Name: 1,2-Azaborines Sentezi ve T4 Lizozim Mutants ile Bunların Protein Kompleksleri hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Keşfedin 1,2-azaborin sentezi ve T4 lizozim mutantları ile protein kompleksleri hazırlama yöntemini. Bu güvenilir teknik, biyomedikal araştırmalarda bor içeren bu bileşiklerin uygulamalarını ortaya koyar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri NIGMS (R01-GM094541) ve Boston College tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Ducruix, A., Giége, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDucruix%2C+A+%22Crystallization+of+Nucleic+Acids+and+Proteins%2C+A+Practical+Approach%22">Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach</a>. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).</li>
<li>Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/v08-110#.WLBilzsrLIU">B-N as a C-C substitute in aromatic systems.</a> Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).</li>
<li>Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22644658">Recent Advances in Azaborine Chemistry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).</li>
<li>Wang, X. -Y., Wang, J. -Y., Pei, J. B. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25469827">Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties.</a> Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).</li>
<li>Zhou, H. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+isomerism%3A+a+boron-nitrogen+surrogate+for+a+carbon-carbon+double+bond+increases+the+chemical+diversity+of+estrogen+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands.</a> Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).</li>
<li>Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization%2C+and+binding+property+of+isoelectronic+analogues+of+nucleobases%2C+B%286%29-substituted+5-aza-6-borauracils+and+-thymines%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines.</a> Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).</li>
<li>Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BN%2FCC+isosterism+in+borazaronaphthalenes+towards+phosphodiesterase+10A+%28PDE10A%29+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors.</a> Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).</li>
<li>Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzazaborinines+as+Novel+Bioisosteric+Replacements+of+Naphthalene%3A+Propranolol+as+an+Example%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example.</a> J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).</li>
<li>Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja01060a034">New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene.</a> J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).</li>
<li>White, D. G. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00905a022">2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes.</a> J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).</li>
<li>Ashe III, A. J., Fang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Synthesis+of+Aromatic+Five-+and+Six-Membered+B%E2%88%92N+Heterocycles+via+Ring+Closing+Metathesis%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B−N Heterocycles via Ring Closing Metathesis.</a> Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).</li>
<li>Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Hybrid+Organic%2FInorganic+Benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Hybrid Organic/Inorganic Benzene.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).</li>
<li>Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+Group-Free+Synthesis+of+1%2C2-Azaborines%3A+A+Simple+Approach+to+the+Construction+of+BN-Benzenoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).</li>
<li>Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodium-catalyzed+boron+arylation+of+1%2C2-azaborines%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).</li>
<li>Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negishi+Cross-Coupling+Is+Compatible+with+a+Reactive+B-Cl+Bond%3A+Development+of+a+Versatile+Late-Stage+Functionalization+of+1%2C2-Azaborines+and+Its+Application+to+the+Synthesis+of+New+BN+Isosteres+of+Naphthalene+and+Indenyl%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl.</a> J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).</li>
<li>Knack, D. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23355270">BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).</li>
<li>Eriksson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+a+Protein+Structure+to+Cavity-Creating+Mutations+and+Its+Relation+to+the+Hydrophobic+Effect%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect.</a> Science. 255 (5041), 178-183 (1992).</li>
<li>Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cavity-containing+mutant+of+T4+lysozyme+is+stabilized+by+buried+benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene.</a> Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).</li>
<li>Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetic+Origins+of+Specificity+of+Ligand+Binding+in+an+Interior+Nonpolar+Cavity+of+T4+Lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme.</a> Biochemistry. 34 (27), 8564-8575 (1995).</li>
<li>Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Model+Binding+Site+for+Testing+Scoring+Functions+in+Molecular+Docking%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking.</a> J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).</li>
<li>Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+Bonding+of+1%2C2-Azaborines+in+the+Binding+Cavity+of+T4+Lysozyme+Mutants%3A+Structures+and+Thermodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics.</a> J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).</li>
<li>Brown, H. C., Racherla, U. S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/280707532_Organoboranes_43_A_convenient_highly_efficient_synthesis_of_triorganylboranes_via_a_modified_organometallic_route">Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route.</a> J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halogenated+Benzenes+Bound+within+a+Non-polar+Cavity+in+T4+Lysozyme+Provide+Examples+of+I.S+and+I.Se+Halogen-bonding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding.</a> J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).</li>
</ol>

Tüm yazarlar bu makalede rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Bu protokolün birinci bölümünde, daha önce bildirilen yöntemlere 12, 13 göre 1,2-azaborines değiştirilmiş bir sentezini tarif. Triallylborane 22 hazırlamak için allyltriphenyl kalay ya da potasyum allyltrifluoroborate kullanarak yolları için bir ikame olarak kullanılan N -allyl- N -TBS- B -alil klorid adüktü (1). Bu yöntem daha atom-ekonomik ve çevre dostu bir yaklaşım sağlar. N -TBS- <...

Heterosikller (yani 1,2-azaborines) içeren Bor-Azot son zamanlarda arenlerin izosterlerinin olarak büyük ilgi çekmiştir. Bu isosterism kimyasal alanı 2, 3, 4 genişletmek için mevcut yapısal motifler çeşitlendirilmesi yol açabilir. Azaborines özellikle kimyagerler yapısal kütüphanelerinden ve fonksiyonel olarak ilgili moleküllerin sentezi gerçekleştirmek olan tıbbi kimya alanında, biyomedikal araştırmalar 5, 6, 7, 8 uygulama için potansiyel kullanıma sahiptir. Fakat önemli iken, mevcut aren içeren moleküller çok sayıda iyi gelişmiş sentetik yolları vardır, azaborines sentezi için yöntemler sadece sınırlı sayıda rapor edilmiştir 9, 10, </s&gt; 11, 12, 13 kadar. Bunun nedeni sentetik dizinin erken evrede bor kaynağı ve hava ve molekülün neme hassas doğası için çeşitli seçenekler sınırlı sayıda esas olan. Bu yazının ilk bölümünde, biz (3) standart hava içermeyen teknikler kullanılarak N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine bir çok gram ölçekli sentezini anlatacağız. Bu bileşik daha ileri yapısal olarak daha karmaşık moleküllerdir 14, 15 fonksiyonalize edilebilir çok yönlü bir ara madde olarak hizmet eder. 3 ile başlayarak, protein bağlama çalışmalarında kullanılmak üzere N -H- B-etil-1,2-azaborine (5) sentezi ve saflaştırılması tarif edilecektir. 5 volatilite nedeniyle, onun etkin izolasyon reaksiyon sıcaklığı, süresi ve dist hassas kontrol gerektirirsonuç çıkarma koşulları. İkinci bölümde, protein ekspresyonu ve T4 lizozim mutantlar (L99A ve L99A / M102Q) 17, 18, 19 izolasyonu için protokoller, 20, protein kristalleştirme ve protein-ligand bir kristal komplekslerinin hazırlanması ve ardından sunulacaktır. T4 lizozim mutantları L99A ve L99A / M102Q NH azaborine moleküller 17 ihtiva eden hidrojen bağlama yeteneğini incelemek için biyolojik model sistemleri seçilmiştir. Standart moleküler biyoloji protokolü kullanarak protein E. coli RR1 suşunda ifade izopropil-β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ile teşvik edilir. Protein saflaştırma iyon değiştirme kolon kromatografisi ile gerçekleştirilir. Protein kristalleştirme asılı kullanılarak (jel elektroforezi ile&gt;% 95 saflık), yüksek konsantrasyonlu saflaştırılmış protein çözeltisi ile gerçekleştirilirbuhar difüzyon yöntemi bırakın. Çünkü oksijenin Bu çalışmanın ligandların duyarlılık protein-ligand kompleksleri, hava içermeyen koşullar altında hazırlanır.

<table><tbody><tr><td>Tetrahidrofuran (THF), inhibitör içermez, HPLC, & ge için; %99,9</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>34865</td><td></td></tr><tr><td>Dietil eter (Et2O), HPLC, &ge için; %99,9, inhibitör içermeyen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>Metilen klorür&nbsp; (CH<>2</alt>Cl<alt>2</alt>), (Stabilize/Sertifikalı ACS)</td><td>Fisher</td><td>D37-20</td><td></td></tr><tr><td>Toluen</td><td>Fisher</td><td>T290-4</td><td></td></tr><tr><td>Pentan, HPLC</td><td>Fisher</td><td>P399-4</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Fisher</td><td>A21-4</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum hidrit (CaH2), reaktif sınıfı, %95</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>208027</td><td>Aktif karbon üzerinde piroforik</td></tr><tr><td>paladyum (Pd/C), ağırlıkça %10 Pd</td><td>Strem</td><td>46-1900</td><td></td></tr><tr><td>1.0 M Heksan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>211249</td> içinde Bor triklorür çözeltisi <td>Yüksek toksik/Piroforik</td></tr><tr><td>Trietilamin, & ge; % 99.5</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>471283</td><td></td></tr><tr><td>Grubbs 1st üretim katalizörü ve nbsp;</td><td>malzeme</td><td>C823</td><td></td></tr><tr><td>Asetamid Sigma</td><td>Aldrich</td><td>A0500</td><td></td></tr><tr><td>n-Bütanol, susuz, %99,8</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>281549</td><td></td></tr><tr><td>Etillityum çözeltisi, 0,5 nbsp; Benzen / sikloheksan Sigma</td><td>Aldrich</td><td>561452</td><td>içinde M Yüksek derecede toksik / Piroforik</td></tr><tr><td>HCl çözeltisi, Et2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>455180</td><td></td></tr><tr><td>2-Metilbütan, susuz ve ge; %99</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli, (Migula) Castellani ve Chalmers (ATCC&reg; 31343&trade;)</td><td>ATCC</td><td>31343</td><td></td></tr><tr><td>T4 lizozim WT* (L99A)</td> <td>Addgene</td><td>18476</td><td></td></tr><tr><td>T4 lizozim mutantı (S38D L99A M102Q N144D)</td> <td>Addgene</td><td>18477</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin sodyum tuzu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>izopropil ve beta; -D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM9464</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik susuz</td><td>Fisher</td><td>BP329</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat dibazik susuz</td><td>Fisher</td><td>BP332</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Fisher</td><td>S642212&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit</td><td>Fisher</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4880</td><td>Aşındırıcı</td></tr><tr><td>Termo bilimsel delme DNaseI</td><td>Fisher</td><td>PI-90083</td><td></td></tr><tr><td>GE Sağlık&nbsp; Sefaroz Hızlı Akış Katyon Değişim</td><td>Ortamı Fisher</td><td>45-002-931</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher</td><td>BP152-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>TCI</td><td>S0489</td><td>Yüksek toksik</td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Fisher</td><td>ICN806443&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sartorius&nbsp; Vivaspin 20 Santrifüj Konsantratörler</td><td>Fisher</td><td>14-558-501</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>2-Hidroksietil disülfür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>380474</td><td></td></tr><tr><td>N-paraton&nbsp;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-643</td><td></td></tr><tr><td>4 RC Diyaliz Membran Tüpü 12.000 ila 14.000 Dalton MWCO&nbsp;</td><td>Balıkçı</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; CryoLoop</td><td>Hampton Research</td><td></td><td>bir döngü şeklinde şekillendirilmiş kriyojenik boru</td></tr><tr><td>CryoTong</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>kriyojenik maşa</td></tr><tr><td>Coot</td><td></td><td></td><td>Elektron yoğunluğu görüntüleri yazılımdan oluşturulur</td></tr></tbody></table>

1,2-azaborines sentezi ve t4 lizozim mutants ile bunların protein kompleksleri hazırlanması

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Standart havasız teknikler ve buhar difüzyonu ile T4 lizozim mutantları ile protein kompleksi hazırlığı kullanarak 1,2-azaborinlerin genel bir sentezini açıklıyoruz. Oksijen ve neme duyarlı bileşikler, bir vakumlu gaz manifoldu veya bir torpido gözü kullanılarak inert bir atmosfer (N2) altında hazırlanır ve izole edilir. Azaborin sentezinin bir örneği olarak, ürünlerin izolasyonu için damıtma ve kolon kromatografisini içeren beş aşamalı bir dizi ile uçucu N-H-B-etil-1,2-azaborinin sentezini ve saflaştırılmasını gösteriyoruz. T4 lizozim mutantları L99A ve L99A/M102Q, Escherichia coli RR1 suşu ile eksprese edilir. Kimyasal hücre lizisi için standart protokoller ve ardından karboksimetil iyon değişim kolonu kullanılarak saflaştırma, kristalizasyon için yeterince yüksek saflıkta protein sağlar. Protein kristalizasyonu, asılı damla buhar difüzyon yöntemi kullanılarak farklı pH aralıklarında çeşitli çökeltici konsantrasyonlarında gerçekleştirilir. Küçük moleküllerle karmaşık hazırlık, inert bir atmosfer altında buhar difüzyon yöntemi ile gerçekleştirilir. Kristal kompleksinin X-ışını kırınım analizi, protein bağlanma bölgesi ile 1,2-azaborinler arasındaki bağlanma etkileşimlerinin kesin yapısal kanıtını sağlar.

1,2-azaborines şematik bir sentez yolu Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Bu protokol, beş farklı boron, azot ihtiva eden moleküllerin sentezi için de geçerlidir. Şekil 2, arzu edilen ürün (3) oluşumunu izlemek için adım 1.3 boyunca ölçülen 11 B NMR spektrumları temsil eder. Protein saflaştırma düşük basınçlı kromatografi sistemini temsil eden bir kromatogramıdır Şekil 3&#39;te gösterilmiştir kullanılarak gerçekl...

1,2-azaborinlerin sentezi ve protein komplekslerinin T4 lizozim mutantları ile hazırlanması için bir protokol sunulmuştur.

1,2-Azaborines Sentezi ve T4 Lizozim Mutants ile Bunların Protein Kompleksleri hazırlanması

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Bu protokolün genel amacı, 1, 2-Azaborin sentezi için genel bir yöntemi ve bunun biyomedikal araştırmalardaki potansiyel uygulamasını açıklamaktır. Bu tekniğin temel avantajı, yaygın benzen motifinin bor içeren birleşmiş izosterleri olan 1, 2-azaborin bileşiklerinin kesin bir sentezini sunmasıdır. Açıklanan öncü madde, potansiyel olarak daha karmaşık moleküllere dönüştürülmek üzere daha fazla fonksiyonelleştirilebilir.1, 2-azaborin ile protein komplekslerinin hazırlanması, biyomedikal araştırmalardaki gelecekteki uygulamalara dair bazı bilgiler sağlayacaktır. Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği şekilde halka kapanmış ürünü hazırlayın. Toluende bulunan bu hazırlanmış ürüne 14 gram karbon üzerinde paladyum ekleyin.Ardından, balonu kutudan çıkarın. Balona, azotla temizlenmiş ve soğutmalı su ile donatılmış, fırında kurutulmuş 24/40 geri soğutucu takın. Balonu bir yağ banyosuna yerleştirin ve karıştırırken reaksiyonu 135 °C sıcaklıkta kuvvetli bir reflükse kadar ısıtın.Reaksiyonu 16 saat boyunca reflükste tutun. Bunun ardından, reaksiyonun oda sıcaklığına soğuması için balonu yağ banyosundan çıkarın. Soğuma tamamlandığında, reaksiyon balonundaki reflü kondanserini septumla değiştirin.Fırında kurutulmuş Luer Lock iğne ile donatılmış bir şırınga kullanarak, 5 milliliter'lik bir alikot çekin. Alikotu vidalı kapaklı bir NMR tüpüne aktarın. Numuneyi Boron-11 NMR ile analiz edin.Reaksiyon tamamlanmamışsa, reaksiyon balonunu bir glove box'a aktarın. Ardından, ek olarak üç gram karbon üzerinde paladyum ekleyin. Sonrasında, balonu glove box'tan çıkarın.Balonu, azotla temizlenmiş ve soğutmalı su ile donatılmış 24/40 geri soğutucu ile kapatın. Bir yağ banyosu kullanarak, karışımı 24 saat boyunca karıştırırken 135 degrees celsius sıcaklıkta kuvvetli reflükse kadar ısıtın. Reaksiyonun tamamlandığından emin olmak için Boron-11 NMR kullanarak başka bir alikotu analiz edin.Bundan sonra, reaksiyon balonunu tekrar eldiven kutusuna aktarın. Reaksiyon karışımını kağıt havluyla doldurulmuş bir flaş kromatografi kolonundan geçirin. Ardından, süzüntüyü manyetik balık içeren bir litrelik bir yuvarlak tabanlı balona toplayın.Kolonu 50 milliliters toluen ile yıkayın. Filtrat kabını eldiven kutusundan çıkarın ve azot hattı donanımlı bir vakum gaz manifolduna bağlayın. Balonun altına bir su banyosu ve çözücüyü tutmak için sıvı azot içeren bir dewar yerleştirin.Filtrattaki tüm uçucuların uzaklaştırılmasına başlamak için yüksek vakum valfini açın. Ardından, reaksiyon karışımını eldiven kutusuna geri getirin. Karışımı, içinde manyetik karıştırıcı bulunan, fırında kurutulmuş 24/40 250 mililitrelik bir yuvarlak tabanlı balona aktarın.Kalan reaksiyon karışımını diklormetan ile durulayın ve balona aktarın. Balonun ağzını bir septuml ile kapatın. Balonu eldiven kutusundan vakum manifolduna taşıyın ve bağlayın.Kalıntı çözücüyü uzaklaştırmak için yüksek vakum vanasını açın. Ardından, septumu hızla çıkarın ve bir scoopula kullanarak kalsiyum hidrür ekleyin. Balon jojeyi metin protokolünde detaylandırılan distilasyon düzeneğine bağlayın ve yağ banyosu sıcaklığını 100 °C olarak ayarlayın.Damıtma işlemi tamamlandıktan sonra ısı kaynağını kaldırın ve düzeneği oda sıcaklığına kadar soğutun. Soğumuş düzeneği azot ile yeniden basınçlandırın ve havasız saklama balonundaki tıpaya bağlı vanayı sıkıca kapatın. İzole edilen ürünü balonla bir eldiven kutusu (glove box) içindeki viyale aktardıktan sonra, viyali eldiven kutusundaki dondurucuda saklayın.Proteini saflaştırdıktan sonra, saflaştırılmış çözeltiyi diyaliz membran tüpüne aktarın. Diyaliz tüpünü, 100 millimolar sodyum fosfat, 550 millimolar sodyum klorür ve 0,2% sodyum azid içeren dört litrelik bir çözelti bulunan bir kaba yerleştirin. Dört degrees celsius sıcaklıkta gece boyunca karıştırın.Ertesi gün, diyalize edilmiş numuneye son konsantrasyon 5 mM olacak şekilde 2-merkaptoetanol ekleyin. Ardından, çözeltiyi 40 mg/mL konsantrasyona getirmek için bir santrifüj konsantratörü kullanın. Numuneyi 5.000 RPM'de ve 6 °C'de döndürün ve konsantrasyon işleminden sonra oluşan tüm çökelekleri uzaklaştırın.Ardından, 24 kuyucuklu bir plakada, metin protokolünde belirtildiği üzere rezervuar çözeltisi ile çeşitli koşullar hazırlayın. Her bir kuyucuğun kenarına uygulayarak sızdırmaz bir kapatma sağlamak için gres kullanın. Konsantre protein çözeltisinden 5 µL ile rezervuar çözeltisinden 5 µL'yi silikonize bir lam üzerinde karıştırın.Rezervuar çözeltisi içeren kuyucukların üzerine lamelini ters şekilde yerleştirin. Kristal büyümesi için plakayı 4 degrees celsius sıcaklıkta saklayın. Kriyojenik tüpten yapılmış bir halka kullanarak büyümüş kristalleri alın ve 6 milliliter'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.50 µL ana çözelti ekleyin. Ardından, tüpü bir glove box'a aktarın. Hazırlanan azaborin ligandından beş µL'yi tüpün kapak iç kısmına aktarın.Tüpün kapağını kapatın ve buhar difüzyonu yoluyla dengeleme için eldiven kutusu içindeki bir buzdolabında iki ila yedi gün boyunca saklayın. Bundan sonra, bir lam üzerine bir damla N Paratone damlatın. Bir mikropipet kullanarak, bir kristali lama aktarın.Ardından, kristali almak ve sulu çözeltiden N Paratone içine aktarmak için kriyojenik tüpten yapılmış bir halka kullanın. N Paratone ile korunan kristali, sıvı azot içeren bir dewara daldırın. Kriyojenik pensler kullanarak, şok dondurulmuş kristali halka üzerine monte edin.Ardından, toplanan kristal verilerini metin protokolünde belirtildiği şekilde analiz edin. Bu çalışmada, daha önce raporlanmış yöntemlere dayanarak 1, 2-azaborinlerin modifiye edilmiş bir sentezi sunulmuştur. N-allel NTBSB-allel klorür adüktünü hazırlamak için tri-allel borin kullanılır.NTBS BCl 1, 2-azaborin sentezi için, önceki yöntemlerden daha yüksek izole verim sağlayan tek kapta iki basamaklı bir sekans uygulanmaktadır. N-H-B-etil-1, 2-azaborin sentezi, daha önce bildirilen yöntemlerde kullanılan krom kompleksi yerine etillityum kullanılarak iki basamakta gerçekleştirilir. Protein, düşük basınçlı bir kromatografi sistemi kullanılarak saflaştırılır.280 nanometre dalga boyunda gerçekleştirilen bir kromatogram, L99am102q T4 Lizozim mutantı ile uyumlu bir pik göstermektedir. Protein daha sonra kristalize edilir ve ligandlar ile komplekslenir. Bu prosedür uygulanırken, bileşiklerin bozunmasını önlemek için azaborin sentezinin eldiven kutusu ve vakum gaz manifoldu gibi havasız koşulların kullanımını gerektirdiğini hatırlamak önemlidir.Geliştirildikten sonra bu teknik, azaborinlerin klasik biyolojik alan geri kazanım ceplerindeki karbonlu aromatiklere kıyasla sahip olduğu benzersiz kimyasal ve fiziksel özelliklerin araştırılmasının yolunu açmıştır.

synthesis-12-azaborines-preparation-their-protein-complexes-with-t4

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Adenovirüs parçacıklar doğal olmayan bir amino asit analog azidohomoalanine veya azido şeker içermesi için...

Bioorthogonal tıklayın Kimya ile Viral Yüzeylerin Kemoselektif Modifikasyonu

Cis diastereoselektif tek kap hazırlanması için bir protokol - N-Ts-iodoaziridines tarif edilmektedir. N-Ts aldiminler ve gem-diiyodür iodoaziridines aracılık eden amino gösterilmiştir siklizasyonu için diiodomethyllithium, ilave üretimi. Ayrıca, hızlı ve nicel şekilde kromatografi ile saflaştırma için en uygun bir durağan fazı değerlendirmek için bir protokol dahildir.

Sentez ve Kromatografi için optimal sabit faz kantitatif seçimi dahil edilmesi Iodoaziridines saflaştırılması

Burada, genetik olarak azid içeren bir amino asidi dahil ederek ve ardından azidi, suş destekli azid-alkin siklo ilavesi (SPAAC) ile kimyasal bir prob ile birleştirerek bir antikor fragmanına kimyasal probları bölgeye spesifik olarak sokmak için bir protokol sunuyoruz.

Verimli ve Siteye özgü Gerilme-terfi Azid-alkin Siklokatılma tarafından Antikor Etiketleme

1-azoniabicyclo [4.1.0] heptane tosylate gibi bicyclic aziridinium iyonları oluşturulan 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl] yerine piperidines ve azepanes yolu ile regio - ve stereospecific hazırlanması için kullanılan aziridin Yüzük-genişleme ile çeşitli nucleophiles. Bu son derece verimli iletişim kuralı çeşitli azaheterocycles fagomine, febrifugine Analog ve balanol gibi doğal ürünler de dahil olmak üzere hazırlamak izin verdi.

Kararlı Bicyclic Aziridinium iyonları ve onların halka açılış Azaheterocycles sentezi için hazırlanması

3-Aroyl-N-hidroksi-5-nitroindoles tek adımlı termal prosedürde konjuge terminal alkiyyon ile 4-nitronitrosobenzene sikloilamı ile sentezlendi. Nitrosoarene ve alkiyonlar hazırlanması yeterli rapor edildi ve sırasıyla ilgili aniline ve alkinol üzerinde oksidasyon prosedürleri ile.

Alkiyonları ile 4-Nitronitrosobenzene Sikloaddition tarafından 3-Aroyl- N-hidroksi-5-nitroinollerin Direkt, Regiosel ve Atom-Ekonomik Sentezi

Bu çalışmada, biemamid-B ve D dahil olmak üzere alkaloidlerin asimetrik sentezinde kullanılan aziridin-2-karboksilatın her iki enantiyomerini ve (-)-epiallo-izomuskarini hazırlamaktayız.

Enantioprepure Non-Aktive Aziridinlerin Hazırlanması ve Biemamid-B, D ve Epiallo-İzomuskarin Sentezi

Bu protokol, mutant L274G-Metiyonin tRNA sentetazı (MetRS*) ifade eden bir fare çizgisi kullanılarak azidonorlösin (ANL) ile hücre tipine özgü protein etiketlemesinin nasıl gerçekleştirileceğini ve etiketli hücre tipine özgü proteinlerin izolasyonu için gerekli adımları açıklar. Canlı farelerde (1) içme suyu ve (2) intraperitoneal enjeksiyonlarla iki olası ANL uygulama yolunu özetliyoruz.

Mutant Metiyonin tRNA Sentetaz Fare Hattı Kullanılarak Hücre Tipi Özgül Protein Saflaştırma ve Kompleks Dokulardan Tanımlama

Aktif olmayan ve aktive olmuş aziridinler içeren bitişik bizaziridinler asimetrik organokatalitik aziridinasyonlarla sentezlendi ve daha sonra asidik veya bazik koşullar altında kemoselektif halka açma reaksiyonlarına tabi tutuldu. Aktive edilmemiş aziridin halkası asidik koşullar altında daha az reaktif nükleofil ile açılırken, aktive edilmiş aziridin halkası temel koşullar altında daha reaktif nükleofiller ile açılır.

Regioselektif halka açma reaksiyonları için bitişik bisaziridinlerin hazırlanması

Bu protokol, katyonik peptid Mel4 ile RK758 peptit taklidi olan antimikrobiyal aktivite ve sitotoksisitenin üretilmesi ve değerlendirilmesi için bir yöntem tanımlar. Kimyasal sentez, rekombinant ifade ve standartlaştırılmış fonksiyonel testleri entegre ederek, peptit ve küçük molekül taklitlerinin üretimi ve testi için daha verimli bir iş akışı sağlar.

Antimikrobiyal Peptitler ve Taklitlerinin Üretimi ve Testi

X-ışını serbest elektron lazerlerinde ve senkrotron kaynaklarında seri kristalografi için lipidik kübik fazda membran protein mikro kristallerinin hazırlanması ve verilmesi için prosedürleri açıklıyoruz. Bu protokoller aynı zamanda çözünür protein mikro kristallerinin dahil edilmesi ve verilmesi için de uygulanabilir, bu da sıvı enjeksiyona kıyasla numune tüketiminin önemli ölçüde azalmasına yol açar.

Hazırlık ve Seri Femtosecond Kristalografi için lipidik Cubic Faz Protein mikro kristallerinin teslimi

Keşfedin 1,2-azaborin sentezi ve T4 lizozim mutantları ile protein kompleksleri hazırlama yöntemini. Bu güvenilir teknik, biyomedikal araştırmalarda bor içeren bu bileşiklerin uygulamalarını ortaya koyar.

1,2-Azaborines Sentezi ve T4 Lizozim Mutants ile Bunların Protein Kompleksleri hazırlanması

Daha fazla video keşfet