Forskolin kaynaklı bağırsak Organoids şişme: Bir İn Vitro Deney Kistik Fibrozis Hastalarında İlaç Tepki değerlendirilmesi için

Bu protokol, kistik fibrozisli (KF) deneklerden alınan kültürlenmiş dokuda CFTR fonksiyonunu ve CFTR modülatör yanıtlarını ölçmek için bir testi tanımlar. Biyopsi kaynaklı bağırsak organoidleri, CF organoidlerinde kusurlu (veya güçlü bir şekilde azalmış) bir yanıt olan ve CFTR modülatörlerine maruz bırakılarak geri yüklenebilen bir yanıt olan cAMP güdümlü bir şekilde şişer.

Bu prosedürün genel amacı, Kistik Fibrozis hastalarından üretilen bağırsak organoidlerinde forskolin kaynaklı şişme veya FIS testi kullanarak CFTR modüle edici tedavilerin etkinliğinde bireysel CFTR fonksiyonunu değerlendirmektir. Bu yöntem, Kistik Fibrozis alanındaki temel soruları ele almaktadır. En önemlisi, mevcut veya deneysel ilaçlardan uzun vadede fayda sağlayabilecek hastaların belirlenmesine yardımcı olur.

Bu tekniğin ana avantajı, kolayca erişilebilir dokunun yaştan bağımsız olarak herhangi bir KF hastasından organoidler oluşturmak için kullanılabilmesidir. Bu tekniğin etkileri, Kistik Fibrozis'in ortoterapisine kadar uzanır ve ilaç etkinliğinin uygun maliyetli ve bireysel bir şekilde test edilmesi için acil bir ihtiyaç duyar. Prosedürü Hubrecht Organoid Technology'den Marvin Statia ve Jeffrey Beekman grubundan Annelot Vonk gösterecek.

Optimal forskolin kaynaklı şişme tahlil verilerini elde etmek için, birden fazla tomurcuklanma ile büyük organoidler içeren bir kültürle çalışmak esastır. Böyle bir kültürü tanımladıktan sonra, 15 mililitrelik bir konik tüpü numune adıyla ve bir tüpü yıkanmış olarak etiketleyin. Ardından, bazal membran matris damlalarını bozmadan ortamı organoid kültür kuyularından dikkatlice aspire etmek için bir p1000 pipeti kullanın.

Ve her kuyucuğa bir mililitre bazal ortam ekleyin. Şimdi her bir oyuktaki bazal membran matris damlalarını parçalamak için pipeti kullanın ve elde edilen organoid süspansiyonları numune adıyla 15 mililitrelik tüpe aktarın. Her bir kuyuyu başka bir milimetre bazal ortamla durulayın ve numune tüpündeki yıkamaları çekin.

Tüm numuneler toplandığında, numune tüpünü bazal ortamla 12 mililitrelik son hacme kadar doldurun ve çözeltiyi karıştırmak için önceden ıslatılmış beş mililitrelik bir pipet kullanın. Daha sonra, organoidleri merkeze alın, peleti bir mililitre taze bazal ortamda yeniden süspanse edin. Aynı p1000 pipet ucunu filtresiz bir p10 ucuyla kapatın ve süspansiyonu 20 kez derecelendirmeye çalışın.

Ardından her iki ucu da atın ve numuneye dört mililitre taze bazal ortam eklemek için beş mililitrelik bir pipet kullanın. Tüpü yaklaşık 70 derece eğin ve solüsyonu yeni önceden ıslatılmış p1000 pipet ucuyla iki ila üç kez kuvvetlice karıştırın. Tüpü 10 saniye eğik konumda tutun.

Ardından, numunenin üst bir mililitresini yıkanmış tüplere dört kez aktarmak için aynı p1000 pipetini kullanın. Son numune hasat edildikten sonra, organoidleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti 120 mikrolitre% 50 bazal membran matrisinde yeniden süspanse edin. Daha sonra üç mikrolitrelik bir damlacığı bir cam mikroskop lamına yerleştirin ve bir ışık mikroskobu altında damlacık içinde en az 30 ila 50 organoidin varlığını onaylayın.

Daha sonra, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunun ortasına üç mikrolitre oraganoid damlası yerleştirin ve bazal membran matrisini katılaştırmak için plakayı 15 dakika boyunca 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. Daha sonra uygun organoid kuyucuklara 100 mikrolitre tam kolon ortamı artı VX809 veya tek başına tam bir kolon ortamı ekleyin ve plakayı 18 ila 24 saat boyunca inkübatöre geri koyun. Ertesi gün, her bir oyuğa 10 mikrolitre kalsiyum çözeltisi eklemek için bir tekrarlayıcı pipet kullanın, karıştıklarından emin olmak için kuyucukları çok kanallı bir pipetle bir kez yeniden süspanse edin ve plakayı 30 dakika daha inkübatöre geri koyun.

Hücreler boyanırken, görüntüleme odasını önceden inkübe etmek için canlı hücre görüntüleme konfokal mikroskobu üzerindeki canlı görüntüleme aracını 37 dereceye ve yüzde beş karbondioksite önceden ayarlayın. İnkübasyonun sonunda, plakayı konfokal mikroskop üzerindeki plaka tutucuya aktarın ve Alexa floor 488 izini seçmek için akıllı kurulum seçeneğini kullanın. Ardından, tüm kuyuyu uzaklaştırmak ve yakalamak için beş eski lensi ve tarama alanını 0,6x'e ayarlayın.

Arka plan üzerinde kalsiyum yeşili etiketli organoidlerin en iyi şekilde algılanmasını sağlamak için lazer gücünü ve dedektör hassasiyetini ayarlayın. Bit derinliğini sekize ve kare boyutunu 512 x 512 piksele ayarlayın. Ölçüm süresini, sıklığını ve aralıklarını ayarlamak için zaman serisi seçeneğini kullanın.

Ve bireysel kuyu konumlarını manuel olarak belirlemek için döşeme seçeneği. Şimdi 100 mikrolitre taze hazırlanmış forskolin ve / veya VX770'i ilgili kuyucuklara ekleyin, görüntülenecek ilk kuyudan başlayarak ölçüme başlayın. Kistik Fibrozis transmembran iletkenlik regülatörünün veya CFTR'nin disfonksiyonu nedeniyle, kolon Kistik Fibrozis organoidlerinin çoğu kompakt boyuttadır ve genotiplerine bağlı olarak forskolin stimülasyonundan 60 dakika sonra şişmez veya çok az şişlik gösterir.

Bununla birlikte, CF organoidleri forskolin stimülasyonundan önce CFTR modülatörleri ile tedavi edildiğinde, organoidler şişmede bir artış gösterir. Şişliği ölçmek için, toplam kalsiyum yeşil yüzey alanları her bir zaman noktasında ölçülebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknikler uygun şekilde uygulanırsa üç veya dört saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü denemeden önce, en önemli adım, bağırsak organoidleri için kültür koşullarının optimizasyonudur, çünkü iyi kaliteli kültürler FIS testinin optimal performansını belirleyecektir. Bu videoyu izledikten sonra, bağırsak organoid kültürleriyle nasıl çalışılacağını iyi bir şekilde anlayacak ve daha sonra forskolin kaynaklı bir şişme testi kullanarak CFTR aktivitesini ve CFDR modülatörlerinin yanıtını ölçeceksiniz.