Name: Yenidoğan Fare Pankreas gelen Fonksiyonel Adacık etkili İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T11:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Öğrenin, yenidoğan fare pankreasundan fonksiyonel Langerhans adacıklarını kolajenaz sindirimi ve manuel seçimle izole etme yöntemini. Bu teknik, diyabet araştırmaları için beta hücre biyolojisi çalışmalarına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIDDK'dan (GG için DK065949) hibe ile desteklenmiştir. Makaleyi okudukları için Dr. Brenda M. Jarvis ve Jeff Duryea Jr.'a teşekkür ederiz.

Hayvan kullanım protokolü M belirtilen prosedürleri takip / Gu için Vanderbilt Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış / 181 11. CD1 veya CBA / BL6 fareler ticari satıcılardan satın alınan ve neonatal fareler elde etmek için Vanderbilt hayvan tesisinde geçti bulundu. Farelerin 1. Hazırlık, Stok Çözümleri ve Ekipmanları <ol><li> Fare çapraz için: fare çapraz kurmak ve deneysel planlama yardımcı olmak için takmayı tarihleri ​​kaydedin. CD1 fareler genellikle çiftleşme gün sonra 19 civarında doğurur. Kullanım CD1 veya CBA / BL6 sırasıyla CD1 veya CBA / BL6 yenidoğan elde geçer. İki çizgi arasındaki ara-CD1 kadın ve CBA / BL6 erkek kullanmaktadır. </li><li> kollajenaz stokunun için: yüksek hassasiyetli terazi ile 200 mg kollajenaz Tip IV tartın. 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne transfer edin. Ca 40 mi HBSS içinde çözündürülür 2 + / Mg2 + (sırasıyla 1.26 ve 0.5 mM), 5 mg / ml stok çözelti yapmak için. <ol><li> için kollajenaz izinhafifçe çalkalanarak ~ 30 dakika boyunca çözülür. Kısım ve en az bir yıl boyunca açık kalır stok olarak -20 ° C&#39;de, donmuş çözelti tutun. </li></ol></li><li> diseksiyon ve adacık toplama için cımbız, makas ve P20 ipuçları birkaç çift sterilize etmek otoklavlayın. </li><li> 1 M glükoz stoğu için: 50 ml santrifüj tüpüne 9 g glukoz ağırlık glukoz eritmek için 50 ml RPMI 1640 ortamı eklenir. kullanılana kadar 4 ° C tutun, ama en fazla 6 aydır. </li></ol> 2. Çalışma Çözümleri NOT: adacık izolasyonu gün, aşağıdaki reaktifler hazırlayın. <ol><li> kollajenaz tip IV çalışma çözümü için: çözülme ve buz üzerinde kollajenaz stok sulandırmak. Her 1.7 ml mikrofüj tüpe 0.15 ml stok koyun. Ca 2+ / Mg 2+ ile 1.35 ml HBSS ekleyin. tüpü 5 kez ters çevirin. 15 dakika boyunca buz üzerinde bırakın. <ol><li> bir mikrosantrifüj içinde 3 dakika yüksek hızda dönerler. Yeni bir tüp süpernatant aktarın. kullanılıncaya kadar buz üzerinde bırakın. çözünmez enkaz ile tüp atın. </li></ol></li><li> desteklenmiş tam RPMI 1640 ortamı için 500 ml RPMI 1640 ortamı içine 2.5 mL 1 M glükoz, FBS 50 ml ısı ve 5 mL 100X Pen-Strep suyunu ekleyin. kullanılana kadar buz üzerinde bırakın. </li></ol> 3. Pankreas İzolasyon ve Sindirim <ol><li> onaylanmış protokollere göre dekapitasyon izofluran ile yenidoğan, euthanize. </li><li> karnı yukarı bakacak şekilde fareyi yatırın. Sterilizasyon% 70 etanol ile püskürtülür. </li><li> Cımbız ile karın cildi yukarı kaldırın ve göğüs kafesine genital bölgede, bir makas ile orta hat boyunca uzunlamasına deri ve kas katmanları kesti. Bu, tüm iç organlarını açığa karın boşluğuna açılır. </li><li> cımbız ile 100 cm çanak tüm iç organları aktarın. Mide ve dalak ve duodenum 11 yapışan bir ventral kısmına yapışan bir sırt bölümü ile dağınık-organdır pankreas, bulun. </li&gt; <li> organları batırmak için çanak içine HBSS ekleyin. çözümde, pankreas dokuları artık duodenum, mide, dalak veya sarılmak. Çünkü onun tipik beyaz renkli bir diseksiyon kapsamında kolayca tanınabilir. HBSS ile yeni bir 60 mm çanak uzak çevresindeki doku ve transfer pankreas dokuları soymak için bir cımbız kullanın. </li><li> Herhangi boyutları arasında 5 mm&#39;den küçük parçalar halinde bir makas ile her pankreas kesin. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne transfer edin. En fazla beş pankreata (P7 daha genç) bir tüp içinde sindirilebilir. P8-P16 fareler için, pankreas başına bir tüp kullanın. </li><li> Her bir tüpe 1 mL kolajenaz çalışma çözeltisi (her bir P1-P7 pankreas 0.2 mL, her P8-P16 pankreasta 0.5 mL kullanın.) - 0.5 ekleyin. en fazla 15 dakika süreyle 37 ° C kuluçka makinesi içinde tüpü terk. tüpü iki kez her dakika çevirin. </li><li> ~ 5 dakika sonra, pankreas dokusu sindirim durumunu izlemek için tüp dokunun. pankreatik çoğu kadar sindirim işlemine devamDoku çapı &lt;2 mm kadar parçalanmış hücre kümeleri, görünür. lizat, normal asiner hücre autolysis nedeniyle bulanık görünecektir. </li></ol> 4. Lizat Yıkama <ol><li> Bir mikrosantrifüj 10 saniye süreyle 500 xg&#39;de lizat dönerler. Bir P1,000 Pipetman süpernatant tabakası çıkarın. süpernatant bulanık ama hücre kümeleri yoksun görünmelidir. hızlı nedeniyle bazı yapışkan DNA varlığı altındaki doku parçaları uzak aspire olabilir, aspirasyon kullanmayın. </li><li> 1 ml RPMI 1640 tam ortam ekleyin. parçalanmış lizat tekrar süspansiyon tüp hafifçe dokunun. yukarı ters çevirin ve 10 kez aşağı. Adımı tekrarlayın 4.1. </li><li> Adımı yineleyin 4.2 iki kez daha ya da süpernatant berrak görünene kadar. 1 ml tam RPMI 1640 medya içinde yıkanmış pankreas parçaları yeniden askıya. </li></ol> 5. Adacık İzolasyonu NOT: pancreata küçük sayılar için, doğrudan el toplama aşağıdaki gibi (5.1) adacık isol için kullanılabilirtirme. Pankreatanın büyük sayılar için (&gt; 6), 5.2 özetlenen yöntemi tercih edilir. <ol><li> Doğrudan el toplama: <ol><li> 60 mm çanak adım 4.3 lizat aktarın. 5 ml tam RPMI 1640 ortam ekleyin. bir mikroskop altında getirin. </li><li> mikroskop parlak alan aydınlatma ayarlayın. ışık yoğunluğunu maksimum güç ~% 50 olarak ayarlayın. Bu durumda, adacıklar asiner hücreler koyu düzensiz şekilli kümeler ise (Şekil 1A) gibi hafif pembe kümeleri görünür. ~ 50X (objektif gücünü ve göz parçayı birleştirerek) bir büyütme görselleştirme adacıklar en iyi yolu ve toplamak için aynı anda pipetlemeyin ucu açıklığı sunmak için tavsiye edilir. </li><li> asiner kümeleri kaçınarak bir P20 pipet ile adacıklar toplayın. Dağıtın RPMI tam medya (Şekil 1B) ile yeni bir 60 mm çanak kesirler adacıklar zenginleştirilmiş. </li><li> iki kez daha el toplama işlemi tekrarlayın. Yeni bir 60 saf adacıklar bırakın4 mL tam RPMI medya (Şekil 1C) mm çanak. </li></ol></li><li> Gradyanlı santrifüjleme: <ol><li> 1.077 g / ml yoğunluğunda 2 mL polisükroz ve sodyum Diatrizoate ile önceden yüklenmiş bir 15 ml santrifüj tüpü hazırlayın. kullanılana kadar buz üzerinde tüp bırakın. </li><li> Pasteur pipeti ile polisükroz ve sodyum diatrizoate çözeltisinin üst üzerine adım 4.3 süspansiyon aktarın. Alt tabaka Rahatsız etmeyin. kadar yeni doğmuş 10 ya da 2 pankreata P17 dokular her 15 ml tüp içine yüklenebilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika için bir döner rotor içinde ~ 600 x g&#39;de tüp dönerler. Fren-off ayarları kullanın. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, yeni bir 15 ml tüp içine medya ve interfaz katmanları (İdeal çalışma koşulları altında, adacıklar santrifüj sonra polisükroz ve kültür ortamı arasındaki interfaz yer alacak unutmayın) aktarın. 10 ml medya ekle yavaşça ama iyice karıştırın. </li><li> adacık zenginleştirilmiş kısmını aşağı Spin5 dakika boyunca 300 x g&#39;de. Yıkama ortamı çıkarın. tam RPMI medya ile yıkayın bir kez daha tekrarlayın. Çoğunlukla adacıklar ve oluklar (Şekil 1D) içeren 4 mL medya, pelet tekrar. </li><li> bölüm 5.1&#39;de belirtildiği gibi adacıklar elle seçin. </li></ol></li></ol> İzole adacıklardaki 6. GSIS Tahliller <ol><li> 37 ° C, doku kültürü kuluçka makinesi içinde 2 saat boyunca tam RPMI ortamı içinde aşama 5.1.4 adacıklar inkübe edin. </li><li> bir mikroskop altında RPMI kaldırmak için bir pipet kullanın. Plaka 3-2,8 mM glukoz ihtiva eden 3 mL KRB solüsyonu eklenir. adacıklar yıkamak için 10 kez girdap. KRB çözümlerini çıkarın. <ol><li> bir kez yıkama işlemi tekrarlayın. bir kuluçka makinesi içinde, 1 saat boyunca 37 ° C de 3 ml KRB çözeltisi ile adacıklar inkübe edin. </li></ol></li><li> 12 oyuklu plakanın her oyuğuna kısım 1 ml KRB. Bir inkübatör içerisinde 37 ° C&#39;ye kadar KRB stokları ve plaka önceden ısıtın. </li><li> 6.2 gibi önceden ısıtılmış KRB ile iki kez adacıklar yıkayın. Transfer önceden ısıtılmış levhaların her çukuruna 10 adacıklar. 37 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edin. </li><li> 45 dakika sonra, süpernatan 50 ul geri. Bu temel şeker altında salgılanan insülin çözeltisi içerir. </li><li> 32 uL 500 mM glikoz eklenmektedir. solüsyonu karıştırmak için plaka 20 kez döndürülür. 37 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edin. plaka kez 5 kez her 5 dk girdap. </li><li> 45 dakika sonra, 50 uL süpernatant çıkarın. Bu yüksek glukoz altında salgılanan insülin olduğunu. </li><li> 1.5 ml tüp tüm adacıklar aktarın. 30 dakika boyunca -20 ° C&#39;de dondurun. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında çözülme. donma ve çözülme işlemi tekrarlayın. </li><li> 20 mM HCI ile 0.5 mL% 70 etanol ekleme. gece bekletin. Bu adacıkların sol insülin olduğunu. </li><li> Insülin seviyelerini analiz etmek için geleneksel bir ELISA kullanarak, daha önce 3 açıklandığı. </li></ol>

<ol><li>Matsumoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+pancreatic+islet+cell+isolation+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+%28Bayl+Univ+Med+Cent%29%22%5BJournal%5D)">Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation.</a> Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galphao+represses+insulin+secretion+by+reducing+vesicular+docking+in+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells.</a> Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).</li>
<li>Planas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+for+the+human+pancreas+and+purified+islets+in+type+1+diabetes%3A+new+findings+at+clinical+onset+and+in+long-standing+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes.</a> Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).</li>
<li>Tonne, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+profiling+of+pancreatic+islets+in+mice+during+streptozotocin-induced+beta-cell+damage+and+pancreatic+Glp-1+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy.</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).</li>
<li>London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+functional+evaluation+of+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans.</a> Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).</li>
<li>Rorsman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+glucose+to+elicit+a+normal+secretory+response+in+fetal+pancreatic+beta+cells+results+from+glucose+insensitivity+of+the+ATP-regulated+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).</li>
<li>Hellerstrom, C., Swenne, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+and+proliferation+of+fetal+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells.</a> Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).</li>
<li>Blum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+beta-cell+maturation+is+marked+by+an+increased+glucose+threshold+and+by+expression+of+urocortin+3%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).</li>
<li>Hegre, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonenzymic+in+vitro+isolation+of+perinatal+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans.</a> In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).</li>
<li>Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas.</a> Islets. 7 (1), e102445(2015).</li>
<li>White, J., White, D. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+J+%22Source+Book+of+Enzymes%2C+Source+Book+of+Enzymes%22">Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes</a>. , C.R.C. Press. (1997).</li>
<li>Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+determines+the+size+and+structure+of+the+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas.</a> Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).</li>
<li>Bouwens, L., Rooman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pancreatic+beta-cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of pancreatic beta-cell mass.</a> Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar, açıklanan çalışma için herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Burada, alışılmış perfüzyon için çok küçük pankreatasmdan adacığı izolasyonu adım adım protokolü sağlar. Vb beta hücresi saflaştırma, gen ekspresyon analizi, doku adacığı beta hücresi olgunlaşması, çoğalması, hücre stres yanıtları, hücrenin hayatta kalması, metabolizma ve fonksiyonel GSIS bakım, tüm doku adacığı temelli çalışmalar hazır adacıklar elde etmesi beklenmektedir. Bu bilgimiz, neonatal fareden adacık izolasyonunu gerçekleştirmek için yeni araştırmacılar kılavuzları ilk detaylı görsel protokolünün en i...

Saf pankreas adacıklarının izole edilmesi, beta hücrelerinin glikoz ile uyarılan insülin sekresyonunun (GSIS) tahlili ve kadavra donörlerinden adacık nakli için gereklidir 1-3. Adacık hücreleri 4, 5'te endokrin gen ekspresyonunun oluşturulması da gereklidir. Bu amaçla, pankreas adacıklarının büyük pankreatadan izole edilmesine izin vermek için ayrıntılı protokoller oluşturulmuştur (6 ve buradaki referanslar). Bu yöntemler, asinarı adacık dokularından ayırmak için enzimatik perfüzyona, gradyan ayırma ve elle toplama ile birleştirilir. Bu nedenle, büyük pankreastan adacık izolasyonu çoğu laboratuvarda kolaylıkla gerçekleştirilebilir. Öte yandan, perfüze edilemeyecek kadar küçük olan pankreatadan adacıkların izolasyonuna izin vermek için ayrıntılı bir adım adım protokol mevcut değildir.
Neonatal adacıkların gen ekspresyonunu ve fonksiyonunu incelemek önemlidir. Yenidoğan adacıkları insülin salgılama ve proliferasyon kabiliyeti açısından erişkinlerden farklı özelliklere sahiptir 7, 8. Bununla birlikte, yeni doğan pankreasın küçük boyutu nedeniyle adacıkları yeni doğan hayvanlardan, özellikle farelerden izole etmek zordur. Boyut, pankreas kanalından kollajenaz enjekte edildiğinde olağan perfüzyon sürecini önler. Gerçekten de, birkaç makale, enzim veya enzim destekli olmayan izolasyon prosedürleri 7, 9, 10 ile bu hatlar boyunca çalışmalar sunmuştur. Bununla birlikte, görsel yardımla adacık izolasyon sürecinin ayrıntılı açıklaması 7, 9'dan yoksundur ve bu da çoğu araştırmacının benzer çalışmaları gerçekleştirmesini zorlaştırır. 
Yenidoğan farelerden yüksek kaliteli adacıklar veren birkaç farklı koşulu araştırdık. Burada, araştırmacıların adacık izolasyon sürecindeki temel detayları öğrenmelerine yardımcı olması beklenen bir protokol sunuyoruz. Bu protokol iki haftalık olana kadar fare pankreaslarına uygulanabilir, daha sonra rutin adacık izolasyonu için perfüzyon yapılabilir. Adacıklar doğrudan insülin sekresyonu ve gen ekspresyonu tahlilleri için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Kollajenaz Tip IV</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Ca2 + / Mg2 + </td><td>Mediatech / Cellgro, Manassas, VA</td><td>ile</td><td>1x HBSS MT21020CV Ca2 + / Mg2 + elde edilirse, CaCl2 ve MgSO4 eklenebilir. Sırasıyla 1.26 ve 0.5 mM.&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 glikozsuz</td><td>Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA</td><td>11879-020</td><td>Sonraki adacık kullanımına müdahale etmemek için glikozun belirli seviyelere eklenmesi gerekir.&nbsp;</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>G-7021 ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>polisakroz ve sodyum diatrizoat çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>Histopaque-10771</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Carl-Zeiss, Oberkochen, Almanya</td><td>Stemi2000</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Leica, Wetzlar, Almanya</td><td>Leica M165</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>Santrifüj 5417C</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>Santrifüj 5810R</td><td></td></tr><tr><td>15 mL santrifüj tüpleri</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>50 mL santrifüj tüpleri</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Hassas denge</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>VWR-225AC</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofüj tüpleri</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P1000</td><td>Fisher Scientific,&nbsp; Waltham, MA</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P20</td><td>Fisher Scientific,&nbsp; Waltham, MA</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm çanak</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm çanak</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25384-168</td><td></td></tr><tr><td>12 kuyulu plakalar</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td>İnce Bilimsel Aletler, Foster City, CA</td><td>14080-11</td><td></td></tr><tr><td>Cımbız</td><td>İnce Bilimsel Aletler, Foster City, CA</td><td>5708-5</td><td></td></tr><tr><td>CD1 fareleri</td><td>Charles River Laboratuvarları, Wilminton, MA&nbsp;</td><td>CD-1</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Jackson laboratuvarı, Farmington, CT&nbsp;</td><td>C57BL/6J</td><td></td></tr><tr><td>B6CBAF1/J</td><td>Jackson laboratuvarı, Farmington, CT&nbsp;</td><td>B6CBAF1/J</td><td></td></tr></tbody></table>

yenidoğan fare pankreas gelen fonksiyonel adacık etkili İzolasyonu

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Büyük memeli pancreata gelen perfüzyon tabanlı adacık izolasyon protokolleri iyi bilinmektedir. Bu tür protokoller kolayca nedeniyle hazır kollajenaz enjeksiyonu ve sonraki doku perfüzyon için izin veren pankreas kanalının büyüklüğü birçok laboratuvarlarda yapılır. perfüzyon kolayca küçük pancreata başarılabilir değil çünkü aksine, küçük pancreata adacık izolasyonu, yenidoğan farelerin olduğu gibi, zordur. Burada görsel yardımı ile yeni doğan farelerin adacıklar önemli sayıda kurtarır ayrıntılı basit bir prosedür açıklanmaktadır. Taze parçalara Bütün pankreastan mikrosantrifüj tüpleri içinde, 37 ° C &#39;de Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde çözülmüş 0.5 mg / ml kollajenaz IV ile sindirildi. Tüpler doku dağılmasına yardımcı olması için düzenli olarak aday bulundu. doku en fazla 1 mm civarında küçük kümelere dağıtılmıştır zaman lizatları% 10 cenin sığır serumu (FBS) kültür ortamı ile dört kez yıkanmıştır. Adacık kümeler,tanınabilir asiner dokuların yoksun, daha sonra stereoskopla diseksiyon altında elde edilebilir. Yeni doğan fare pankreas başına büyük boyutlu adacıklar 80 küçük - Bu yöntem 20 kurtarır. Bu adacık insülin sekresyonu, gen ekspresyonu ve kültür dahil olmak üzere en akla alt deneyleri için uygundur. insülin salgılanması tahlilinin bir örneği, yalıtım işlemi doğrulamak için sunulmuştur. genetik altyapı ve sindirim derecesi verimi belirleyen en büyük faktörlerdir. Endokrin-ekzokrin izolasyon yardımcıları gibi yüksek aktiviteli taze hazırlanmış kolagenaz çözeltisi tercih edilir. Yıkama tüm çözümler ve fetal sığır serumu katyonların mevcudiyeti [Kalsiyum (Ca2 +) ve magnezyum (Mg + 2)] / çekme ortamı, uygun bir bütünlük adacık iyi bir verim için gerekli değildir. iyi kontrast ve büyütme ile bir diseksiyon kapsamı da yardımcı olacaktır.

Her bir küçük fare pankreastan 80 adacıklar - optimum koşullar altında, sunulan yöntem 20 verim alınabilir. Bu sayı, farelerin genetik arka plan, yaşına ve adacıklar boyutu geri alınacak. Yaygın olarak kullanılan arasında, CD1 dışarı yetiştirilmiş ve C57BL / 6J safkan fareler CD1 ve C57BL / 6 veya ticari B6CBAF1 arasındaki melezler daha küçük boyutta daha az adacıklar üretmek / J fareleri yok. Genellikle toplama direkt elden nedeniyle ekzokrin dokularda (Şekil 1A-C) ile ...

Neonatal farelerden sağlam adacıklar izole edilmesi için bu tarifnamede, bir protokol açıklar. Pancreata kısmen yıkama ve elle toplama ile, ardından kollajenaz ile sindirilir. 20-80 adacık kümeleri birkaç adacık çalışmalar için uygun yeni doğan farelerin, gelen pankreas başına elde edilebilir.

Yenidoğan Fare Pankreas gelen Fonksiyonel Adacık etkili İzolasyonu

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Bu prosedürün genel amacı, neonatal fare pankreasından sağlam Langerhans adacıklarını izole etmektir. Bu yöntem, gelişim ve fonksiyon eklemedeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; insülin salgılanması, gen ekspresyonu, parasel sağkalımı ve fonksiyonel koruma gibi.Bu yöntemin temel avantajı, basit ve kolay olmasıyla birlikte yeni araştırmacıların alt grup çalışmaları için önemli miktarda sağlam adacık izole etmelerine olanak tanımasıdır. İşleme, sırtüstü pozisyondaki yenidoğanı %70 etanol ile püskürterek başlayın. Ardından, cımbız yardımıyla karın üzerindeki deriyi kaldırın ve deri ile kas tabakalarını, genital bölgeden göğüs kafesine kadar orta hat boyunca boylamasına kesin.Ardından, tüm iç organları 100 santimetrelik bir kaba aktarın ve ventral kısmı duodenumun, dorsal kısmı ise mide ve dalağın üzerine yapışık olan, beyaz ve dağılımlı bir organ olan pankreası bulun. Organları tamamen örtmek ve böylece pankreas dokularının duodenum, mide veya dalağa yapışık kalmamasını sağlamak için kaba HBSS ekleyin. Daha sonra, pankreası çevreleyen dokulardan ayırmak için bir cımbız kullanın.Pankreası HBSS içeren yeni bir 60 milimetrelik kaba aktarın ve makas kullanarak bir ila beş pankreası beş milimetre veya daha küçük parçalara bölün. Tüm doku kıyıldıktan sonra, parçaları 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve örneklere kollagenaz çalışma çözeltilerini ekleyin. Ardından, tüpleri her dakika iki kez tersyüz ederek doku fragmanlarını 37 °C'de inkübe edin.Beş dakika sonra, parçaların sindirim durumunu izlemek için tüpe hafifçe vurun. Lizat bulanıklaşana ve pankreasların çoğu iki milimetreden küçük parçalanmış hücre kümeleri şeklinde görünene kadar sindirime on dakika daha devam edin. Sindirim sonunda, lizatı mikro santrifüj ile çöktürün ve bulanık görünen ancak hücre kümelerinden arınmış olan süpernatanı bir p1000 pipet kullanarak dikkatlice uzaklaştırın.Ardından, pelletin üzerine bir mililitre taze RPMI 16/40 komple besiyeri ekleyin. Sonra, fragmanlara ayrılmış lizat parçalarını yeniden süspande etmek için tüpe hafifçe vurun ve tüpü on kez altüst edin. Santrifüjden sonra, süpernatant berraklaşana kadar, az önce gösterildiği gibi yeniden süspande edilen lizatı en az iki kez daha altüst edin.Ardından, son peleti bir mililitre taze komple ortamda yeniden süspande edin ve buz üzerinde 15 mililitrelik konik bir tüpe 1,077 g/ml yoğunlukta iki mililitre polisükroz ve sodyum diatratoat ekleyin. Bir Pasteur pipeti kullanarak, katmanları karıştırmadan lizatı dikkatlice gradyan çözeltisinin üzerine ekleyin ve hücreleri santrifüj ile ayırın. Ortamı ve adacıkları içeren ara faz katmanlarını yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın ve santrifüj için adacıkları on mililitre taze ortamla nazikçe ancak iyice karıştırın.İkinci bir yıkama ve taze tam besiyeri uygulamasının ardından, adacık ve kanal içeren peleti dört mililitre taze tam besiyeri içinde yeniden süspande edin. Şimdi adacıkları 60 milimetrelik bir kaba ekleyin ve hücrelere beş mililitre tam besiyeri ekleyin. Kabı bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin ve parlak alan aydınlatmasını açarak ışık yoğunluğunu maksimum gücün yaklaşık %50'sine ayarlayın.50x büyütmede, adacıklar hafif pembe kümeler, asinöz hücreler ise koyu renkli, düzensiz şekilli kümeler olarak görünecektir. p20 pipet ucu kullanarak, asinöz kümelerden kaçınmaya dikkat ederek tekil adacıkları toplayın ve adacık bakımından zenginleştirilmiş fraksiyonları, komple ortam içeren yeni bir 60 milimetrelik kaba aktarın. Tüm adacıklar orijinal kaptan toplandıktan sonra, son toplama kabında yalnızca saf adacıklar kalana kadar, toplama kabındaki adacıkları dört mililitre taze komple ortam içeren yeni bir 60 milimetrelik kaba iki kez daha aktarın.Uygun bir sindirim ve izolasyon, dış yüzeyleri pürüzsüz adacıklar sağlayacaktır. Yetersiz kollagenaz sindirimi, asiner dokulardan tamamen ayrılamayan ve kolayca gözlemlenebilen büyük adacıklarla sonuçlanabilir; bu durum, daha büyük adacıklar üretilmesine rağmen genel adacık verimini düşürür. Aşırı sindirim durumunda ise, asiner dokular adacıklardan tamamen ayrılabilse de adacık yapısının bozulma eğilimi vardır ve bu da mikroskop altında pürüzlü yüzeyli adacıkların görülmesine yol açar.Bu yöntemle izole edilen neonatal adacıklar, yüksek bazal insülin sekresyon seviyeleri ve immatür adacık beta hücrelerine özgü glikozla stimüle edilmiş insülin sekresyon profilleri sergilemektedir; bu durum, söz konusu adacık izolasyon prosedürünün neonatal adacıkların fonksiyonel özelliklerini büyük ölçüde koruduğunu göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde sadece iki saat içinde tamamlanabilir. Prosedür uygulanırken, çözünmeyen kalıntıları uzaklaştırmak için kollagenazın ön santrifüj işleminden geçirilmesi, yıkama tamponunun kalsiyum ve magnezyum ile desteklenmesi ve doku dissosiyasyonunu hızlıca durdurmak için ön işlem görmüş yıkama tamponu kullanılması gerektiği unutulmamalıdır.Bu prosedürde, yenidoğan beta hücrelerinde insülin sekresyon dinamiği gibi ek soruları yanıtlamak için glikozla uyarılmış insülin sekresyonu gibi deneylerimiz gerçekleştirilebilir. Ayrıca bu teknik, beta hücresi biyolojisi alanındaki araştırmacıların gen ekspresyonu veya diğer metabolik çalışmalar gibi ek analizler yapmalarına olanak sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, alt hat çalışmalarınız için yenidoğan fare pankreasından sağlam adacıkların nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Kollajenaz tozu ile çalışmanın son derece tehlikeli olduğunu unutmayın, bu nedenle bu materyal kullanılırken eldiven ve yüz maskesi takmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

effective-isolation-of-functional-islets-from-neonatal-mouse-pancreas

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Izole adacık transplantasyonu tip 1 şeker hastalığı için potansiyel bir tedavi olarak öne sürülmüştür. Burada, fare pancreata adacıkları izole, ve böbrek subkapsüler alan nakli için bir yöntem açıklanmaktadır.

Murin Islet İzolasyon ve subkapsüler Böbrek Nakli Bir Yöntem

Araştırma için tip 2 diyabetik adacık kaynağı yetersiz. Burada kısmi pankreatektomi geçiren hastalardan izole adacıklar için protokol paylaşın. Bu yaklaşım, tip 2 diyabetik adacıklar elde etmek için eşsiz bir mekan temsil eder ve temel ve klinik çalışmalar için yeterli sayıda non-diyabetik hastalarda klinik olarak uyumlu.

Kısmen Pancreatectomized hastalar İnsan Islets izolasyonu

Fare adacık izolasyon ayrıntılı bir açıklaması kolajenaz nötr proteaz ve saflaştırılmış bir bileşimi in situ pankreatik kanal kanülasyon ve perfüzyon tekniği kullanılarak tarif edilir.

Langerhans İzolasyonu Fare Islet Saflaştırılmış Collagenase ve Nötr Proteaz bir kombinasyonu kullanılarak

Langerhans Adacıkları olarak da adlandırılan pankreas adacıkları, glikoz regülasyonu ve diğer önemli biyolojik işlevler için hormonlar üreten bir endokrin hücre kümesidir. Bu protokol, ekzokrin pankreas dokusunu sindirmek için önce Ampulla of Vater yoluyla kollajenaz perfüze ederek pankreas adacıklarını izole etmek için bir yöntemi ve adacıkları farelerden saflaştırmak için basitleştirilmiş bir yoğunluk gradyan santrifüjünü açıklar.

Kollajenaz Perfüzyonu ile Pankreas Adacıkları İzolasyonu: Pankreas Adacığı Hücrelerini İzole Etmek İçin Enzimatik Bir Yöntem

Langerhans adacıkları izole edilmiş fare kullanılarak in vitro β-hücre fonksiyonu denenmesi diyabet patofizyolojisi ve terapötik çalışmada önemli bir bileşenidir. Çok sayıda alt-uygulama mevcut olmakla birlikte, bu protokol, spesifik olarak β-hücresi fonksiyonunu belirleyen önemli bir parametre olarak hücre içi siklik adenozin monofosfat (cAMP) ölçümünü açıklamaktadır.

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Burada, tip 2 diyabetin fare modelinden adacıkların izolasyonu için bir protokol, Leprdb ve 2 foton mikroskobu kullanan sağlam adacıklardan insülin sekresyonunun ölçümü için bir canlı hücre testinin ayrıntılarını sunuyoruz.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Tip 2 Diyabet Fare Modeli: Bozulmamış Islets Of Pankreas Adacık İzolasyonu ve Canlı hücre 2-Foton Görüntüleme

Bu protokol, murine iz izolasyonunu ve bir desellularize iskele üzerine tohumlamayı gösterir. İskele destekli adacıklar streptozotosin (STZ) ile indüklenen diyabetik farelerin epididimal yağ yastığı içine nakledildi. Isletler nakil alanından kurtuldu ve hiperglisemik durumu tersine çevirdi.

Diyabetik Farenin Epididimal Yağ Tabağında Iskelelerin İskele Destekli Nakli

Bu adacık izolasyon protokolü ekroz dokuyu sindirmek için kollajenaz enjeksiyonunun yeni bir rotasını ve adacıkları farelerden arındırmak için basitleştirilmiş bir degrade prosedürünü tanımlamıştır. Enzimatik sindirim, degrade ayırma/arıtma ve adacık el toplama içerir. Başarılı yalıtım fare başına 250-350 yüksek kaliteli ve tam işlevsel adacıklar verebilir.

Farelerden Pankreas Adacık İzolasyon için Basit Bir Yüksek Verimlilik Protokolü

Pankreas adacık nakli normoglycemia tip 1 diyabet için bir yoludur. Bu makale nakli tekniği normal glikoz düzeyleri diyabetik farelerde korumak için intraportal rota üzerinden üzerinde duruluyor.

İntraportal fare modeli pankreas adacıkları nakli

Bu çalışma, fare pankreasındaki fonksiyonel birincil adacıqları ve asinar hücreleri verimli bir şekilde çıkaran basitleştirilmiş bir yöntem geliştirdi ve Akut Pankreatit Kaynaklı Diyabetin patogenezinde hücrelerarası iletişimi incelemek için değerli bir araç sağladı.

Farelerden Birincil Adaçik Ve Birincil Pankreas Asinar Hücrelerinin Eşzamanlı İzolasyonu İçin Basit ve Hızlı Bir Yöntem

Bu protokol, Lewis sıçan pankreas adacıqlarının cerrahi hasamı, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanlı arındırması için standartlaştırılmış bir yöntemi tanımlar; böylece doğrudan nakil veya in vitro çalışmalarda kullanılmak üzere yüksek verimli, yüksek saflıkta preparatlar sağlanır.

Lewis Farelerinden Pankreas Adacığı İzolyasyonu ve Arındırma, Enzimatik Sindirim ve Yoğunluk-Gradient Ayrımı Kullanılarak

Öğrenin, yenidoğan fare pankreasundan fonksiyonel Langerhans adacıklarını kolajenaz sindirimi ve manuel seçimle izole etme yöntemini. Bu teknik, diyabet araştırmaları için beta hücre biyolojisi çalışmalarına olanak tanır.

Yenidoğan Fare Pankreas gelen Fonksiyonel Adacık etkili İzolasyonu

Daha fazla video keşfet