Name: Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Öğrenin, canlı hücrelerde mitokondriyal kalsiyum alımı ve membran potansiyelini konfokal mikroskopi ile eşzamanlı ölçme yöntemini. Bu teknik, genetik manipülasyon gerektirmeden mitokondri fonksiyonlarını araştırmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finansal destek için Dr. Kirstin Elgass ve teknik yardım için Monash Micro Görüntüleme Dr Sarah Creed ve Wellcome Trust ve Tıbbi Araştırma Konseyi UK teşekkür ederim. MMcK Avustralya Araştırma Konseyi Gelecek Bursu Programı (FT120100459), William Buckland Vakfı, Avustralya Mitokondriyal Hastalık Vakfı (AMDF), Tıbbi Araştırma ve Monash Üniversitesi Hudson Enstitüsü desteklenmektedir. Bu eser Victoria Hükümeti Operasyonel Altyapısının Desteklenmesi Programı tarafından desteklenmiştir.

Hücrelerin hazırlanması 1. <ol><li> 10 cm hücre kültür kaplarına hücreleri ya da 75 cm büyütün% 5 (h / h) cenin sığır serumu (FBS) ve 1 x penisilin / streptomisin (s / s ile takviye edilmiş kültür ortamı [10 mi Dulbecco Değiştirilmiş Kartal Ortamı (DMEM) &#39;de 2 şişe )] 37 ° C /% 5 CO2 de. </li><li> hücreleri hasat etmek için, daha sonra, 5 ml 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (1 x PBS) ile yıkamak, aspirasyon ile ortamı çıkarın. Daha sonra, (ağ / hac) tripsin /% 0.25, 1.5 ml% 0.25 ekleyin aspirasyonla 1x PBS çıkarın (a / h) etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve 2 dakika için 37 ° C /% 5 CO2 inkübe edilir. çanak dokunun veya daha sonra 5 ml kültür ortamında tekrar süspansiyon, hücreleri çıkarmak için hafifçe şişe. </li><li> Bir hemasitometre üzerine yeniden süspanse hücrelerin 12 ul ekleyerek hücreleri saymak. </li><li> yemekler veya konfokal görüntüleme için odacıklı lamelleri Levha hücreleri. Not: Bu ters çevrilmiş mikroskop ile kullanılmak için dizayn edilmiştir, uygun bir plastik ya da cam alt olacaktır. </li><li> Plaka hücreleri inci böylece~% 80 konflüansa görüntüleme gününde elde edilir. Örneğin, yaklaşık 2 x 10 4 143B osteosarkom hücreleri görüntüleme önce 8 oyuklu oda slayt bir gün tek bir oyuk içine kaplama olabilir. </li><li> Hücreler takmak ve kurtarmak için izin 37 ° C /% 5 CO 2 gecede hücreleri inkübe. </li></ol> TMRM ve Flu-4 Görüntüleme için 2. Tamponlar <ol><li> 156 mM NaCI, 3 mM KCI, 2 mM MgSO 4 içeren Telaffuz Solüsyonu (SC) hazırlanması 1.25 mM KH 2 PO 4, 10 mM D-glukoz, 2 mM CaCl2 ve 10 mM HEPES pH 7.35. -20 ° C&#39;de alikotları saklayın RS. </li><li> Hazırlama Hücre içi Orta (IM), 6 mM NaCI, 130 mM KCI, 7.8 mM MgCI2, 1 mM KH 2 PO 4, 0.4 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 10 mM HEDTA, 2mM malat, 2 mM glutamat, 2 mM ihtiva eden ADP ve 20 mM HEPES pH 7.1. malat, glutamat ve ADP 200 mM stok çözeltileri, ayrı olarak hazırlanır bölünmüştür ve -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. Bunlar stocks kullanımdan hemen önce IM eklenebilir. </li><li> 2 + serbest Hank tamponlu tuz çözeltisi (HBSS) elde edilebilir Ca ticari satıcılardan önceden hazırlanmış. etilen glikol-bis (β-aminoetil eter) ekleyin -N, N, N &#39;, 500 uM nihai konsantrasyona kadar N&#39;-tetraasetik asit (EGTA). </li><li> % 100 metanol içinde 10 mM tetrametilrodamin, metil ester, perklorat (TMRM) içindeki bir stok çözelti hazırlayın. Bu stoktan, distile H 2 O 2 mcM bir çalışma stok yapmak </li><li> % 100 etanol içinde 10 mM Verapamil bir stok çözelti hazırlayın. </li><li> dimetil sülfoksit (DMSO) içinde Fluo-4 asetoksimetil ester (Fluo-4 AM) stok çözeltisi (ağırlık / hacim), 1 mg / ml hazırlayın. Not: Fluo-4 AM Ca2 + bağlanma üzerine artmış floresan arzeden bir kalsiyum göstergesidir. Fluo-4 florin ile ikame iki klorin ikame edici ile, fluo-3, bir analogudur. Bu, 488 nm&#39;de artan flüoresans uyarma ve daha yüksek floresans sinyali seviyeleri ile sonuçlanır.AM ester grubu hücre zarlarının nüfuz edebilir yüksüz Fluo-4 molekülüne sonuçlanır. hücre içinde bir kez, AM ester hücre içinde tutulur Flu-4 yüklü bir biçimde elde edilen, spesifik olmayan esterazlarla ayrılır. </li><li> % 100 etanol içinde 1 mM karbonil siyanit p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) içindeki bir stok çözelti hazırlayın. </li><li> Damıtılmış H2O içinde bir stok 25 mg / ml çözelti (ağ / hac) digitonin hazırlanması </li><li> DMSO içinde 100 uM thapsigargin bir stok çözelti hazırlayın. </li><li> Damıtılmış H2O 40 mM kalsiyum klorür (CaCl2) bir stok çözelti hazırlayın </li></ol> TMRM ve Fluo-4 AM 3. Hücrelerin boyanması <ol><li> 20 nM TMRM RS boyama çözeltisi hazırlayın, 5 ug / ml (a / h) Fluo-4 AM ve Pluronic F-127, RS gibi% 0.005 yüzeyaktif madde. NOT: Bu yüzey aktif Flu-4, GM çözünürlüğünü kolaylaştırır iyonik olmayan bir polioldür. Not: 10 uM Verapamil, aynı zamanda inhibitörlerinin eklenebilirBu hücre tipinde ifade edilir, eğer plazma zarı çoklu ilaç taşıyıcı T TMRM verme analiz edilir. </li><li> pipetle hücreler kültür ortamı çıkarın ve PBS 1X 100 ul ile yıkayın. </li><li> Pipetle 1 x PBS alınır ve oda sıcaklığında 45 dakika boyunca 250 ul RS boyama çözeltisi içinde hücreler inkübe edin. Not: Fluo-4 AM hücre girdiğinde, AM ester, hücresel esterazlarla ayrılır. Oda sıcaklığında inkübe Fluo-4 AM mitokondri girmesine izin esteraz aktivitesini inhibe eder. </li><li> Pipet ile RS boyama çözüm çıkarın ve aşırı Flu-4, AM ve TMRM kaldırmak için Ca 2 + ul 100 ücretsiz HBSS hücreleri yıkayın. </li><li> 25 ug / ml İM görüntüleme çözeltisi hazırlayın digitonin (w / v), 200 nM TMRM ve IM 1 uM thapsigargin. Not: digitonin konsantrasyonu oluşmaz mitokondriyal iç membran bu geçirgenliği sağlamak üzere ayarlanması gerekebilir. Bu yoğunluk değerlendirerek ampirik olarak saptanabilirdigitonin farklı konsantrasyonlarda TMRM sinyali. </li><li> Pipet ile Ca 2 + ücretsiz HBSS çıkarın ve hücrelere IM görüntüleme çözümü 300 ul ekleyin. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında dengelenmeye hücreleri bırakın. Hücreler artık CaCl2 eklemelerle görüntüleme için hazırız. </li></ol> 4. Hücre Görüntüleme <ol><li> ters bir lazer tarama konfokal mikroskop üzerine çanak veya IM görüntüleme çözümü hücrelerin ile odacıklı lamel yerleştirin. </li><li> TMRM ve Flu-4 eksitasyon ve emisyon spektrumları mikroskop lazer ayarı kullanın. Örneğin, sırasıyla TMRM ve Fluo-4 heyecanlandırmak için 543 nm He-Ne ve 473 nm argon lazer çizgileri kullanıyoruz. hücrelere herhangi bir fotoğraf zararı en aza indirmek için yaklaşık% 5 düşük lazer gücü kullanın. </li><li> görüntüleri her 25 sn tarama mikroskobu ayarlayın. 10 dakika tarama hücreleri TMRM ve Flu-4 sinyaller için temel okumalar kurmak. NOT: Flu-4 sinyal istirahat kalsiyum konsantrasyonlarda ise zayıf ya da saptanamayan olabilirerzak. </li><li> Hızlı görüntüleme çözeltisi 300 ul doğrudan hücrelere 40 mM CaCl2 stok solüsyonu 3 ul ekle (1: 100 dilüsyon) ve bir pipet ile yavaşça karıştırın. Ekleme ve gerekirse CaCl 2 karıştırma sırasında görüntü tarama Pause. NOT: Son ücretsiz Ca 2 + iyonu konsantrasyonu [Ca 2 +] IM görüntüleme çözümü gibi Maxchelator WEBMAXC gibi yazılımları kullanarak hesaplanabilir UZATILDI ( <a href="http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html">http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html</a> ) ya da Şelatör 11. Son serbest Ca2 + iyonu konsantrasyonu hesaplanması için ayrıntılı bir açıklaması [Ca2 +], aşağıda Bölüm 6&#39;da tarif edilmektedir. </li><li> Yaklaşık 4 dakika boyunca görüntü taramaya devam, sonra genellikle yaklaşık 8 ila 10 eklemeler, ulaşıldığında istenilen TMRM veya Flu-4 sinyalleri kadar CaCl2 eklemeler her 4 dk tekrarlayın. </li><li> 1 mM FCCP 100 seyreltme (nihai C: Bir pipet kullanarak, 1 ekleyinşirketinden hücrelere bağlı yoğunlaşma 10 uM) ΔΨ m kaybeder. 5 dakika daha Görüntü hücreleri. Deney şimdi bitti. </li></ol> 5. Görüntü Analizi <ol><li> Görüntüleme işlemi tamamlandıktan sonra, http://downloads.openmicroscopy.org/bio Bio-Biçimleri eklentisi (indir &#39;bioformats_package.jar&#39; ile örnek ImageJ yazılım, görüntü analiz yazılımı kullanılarak Fluo-4 ve TMRM sinyallerin yoğunluğunu belirlemek -formats / ve kaydedin &#39;C: Program Files ImageJ eklentileri&#39; klasörü). </li><li> ImageJ (örneğin bir .oif dosyası) görüntüleme dosyasını açın. mitokondri içeren seçim aracını tıklayın ve faiz (ROI) bir bölge seçin. ROI seçmek için ilk TMRM sinyalini kullanın. </li><li> Aç &#39;Analiz&gt; Araçlar&gt; ROI Yöneticisi&#39;, yoğunluk ölçümü için seçilen ROI eklemek için &#39;Ekle&#39; düğmesini tıklayın. Birden fazla ROI ölçümü için tek bir görüntü seçilebilir. Tüm ROI kadar önceki adımları yineleyins ROI Manager eklenmiştir. </li><li> &#39;Daha fazla&gt; Çok Tedbir tıklayın seçildiğinde&#39; tüm dilimleri ölçün &#39;olduğundan emin olun ve&#39; Dilim Başına Bir Satır &#39;seçilmemiş olduğunu, daha sonra TMRM ve Flu-4 sinyallerin ortalama floresan yoğunluğu bir tablo elde etmek için&#39; Tamam&#39;ı tıklayın her zaman noktasında her ROI için. </li><li> TMRM ve Flu-4 sinyaller için ortalama yoğunluğu ve standart sapmayı hesaplamak için tüm ROI verileri kullanır. </li></ol> 6. Final Ücretsiz Ca 2 + İyon Konsantrasyon [Ca2 +] Hesaplanması <ol><li> Serbest Ca2 + iyonu konsantrasyonu, İM görüntüleme çözelti içinde [Ca2 +] gibi Maxchelator WEBMAXC GENİŞLETİLMİŞ (gibi bir yazılımı kullanılarak belirlenebilir <a href="http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html">http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html</a> ) ya da kelat yapıcı 11. = Sıcaklık 24 ° C, pH = 7: Örneğin, şu şekilde WEBMAXC değişkenleri genişletilmiş bir dizi.1, iyonik kuvvet = 0.162, EGTA = 0.002 M, HEDTA = 0.01 M, Ca 2 + = 0.0004 M, Mg + 2 = 0.0078 M Bu nihai serbest Ca2 + iyonu konsantrasyonu [Ca + 2] 62 nM ile sonuçlanır . Bu programlar, reaktif saflık, ölçümler ve pH tespiti doğruluğu olarak dikkate her değişken alamaz unutmayın. Ücretsiz Ca 2 + konsantrasyonunun belirlenmesi için en doğru yöntem kalibre Ca 2+ seçici elektrot kullanmaktır. </li></ol>

<ol><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+the+hub+of+cellular+Ca2%2B+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling.</a> Physiology. 23, 84-94 (2008).</li>
<li>Jacobson, J., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+mitochondria+and+cellular+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling.</a> Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).</li>
<li>Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+as+a+mediator+of+cell+energy+demand+and+a+trigger+to+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).</li>
<li>Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+calcium-dependent+neuronal+death+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Mitochondria calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease.</a> Pflugers Arch. 464, 111-121 (2012).</li>
<li>Drummond, R. M., Mix, T. C., Tuft, R. A., Walsh, J. V., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Ca2%2B+homeostasis+during+Ca2%2B+influx+and+Ca2%2B+release+in+gastric+myocytes+from+Bufo+marinus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Ca2+ homeostasis during Ca2+ influx and Ca2+ release in gastric myocytes from Bufo marinus.</a> J. Physiol. 522, 375-390 (2000).</li>
<li>Hajnoczky, G., Robb-Gaspers, L. D., Seitz, M. B., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+of+cytosolic+calcium+oscillations+in+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria.</a> Cell. 82, 415-424 (1995).</li>
<li>Davidson, S. M., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22057570">Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 810, 219-234 (2012).</li>
<li>Pozzan, T., Rudolf, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19100709">Measurements of mitochondrial calcium in vivo.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1787, 1317-1323 (2009).</li>
<li>Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+of+mitochondrial+Ca2%2B+revealed+by+specifically+targeted+recombinant+aequorin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin.</a> Nature. 358, 325-327 (1992).</li>
<li>Pitter, J. G., Maechler, P., Wollheim, C. B., Spat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+respond+to+Ca2%2B+already+in+the+submicromolar+range%3A+correlation+with+redox+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondria respond to Ca2+ already in the submicromolar range: correlation with redox state.</a> Cell Calcium. 31, 97-104 (2002).</li>
<li>Schoenmakers, T. J., Visser, G. J., Flik, G., Theuvenet, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHELATOR%3A+an+improved+method+for+computing+metal+ion+concentrations+in+physiological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">CHELATOR: an improved method for computing metal ion concentrations in physiological solutions.</a> BioTechniques. 12, 870-879 (1992).</li>
<li>McKenzie, M., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+Cellular+Bioenergetics+Causes+Mitochondrial+Calcium+Handling+Defects+in+MT-ND5+Mutant+Cybrids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impaired Cellular Bioenergetics Causes Mitochondrial Calcium Handling Defects in MT-ND5 Mutant Cybrids.</a> PLoS One. 11, e0154371(2016).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li>
<li>Homolya, L., Hollo, Z., Germann, U. A., Pastan, I., Gottesman, M. M., Sarkadi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cellular+indicators+are+extruded+by+the+multidrug+resistance+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein.</a> J. Biol. Chem. 268, 21493-21496 (1993).</li>
<li>Fujimoto, K., Chen, Y., Polonsky, K. S., Dorn, G. W. 2nd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cyclophilin+D+and+the+mitochondrial+permeability+transition+enhances+beta-cell+survival+and+prevents+diabetes+in+Pdx1+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeting cyclophilin D and the mitochondrial permeability transition enhances beta-cell survival and prevents diabetes in Pdx1 deficiency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10214-10219 (2010).</li>
<li>Rao, V. K., Carlson, E. A., Yan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+permeability+transition+pore+is+a+potential+drug+target+for+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial permeability transition pore is a potential drug target for neurodegeneration.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1842, 1267-1272 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Kalsiyum kas kasılması, nöronal sinyalleşme ve hücre çoğalması 13 de dahil olmak üzere bir çok hücre süreçlerinde, çok önemli bir rol oynar. Hücre kalsiyum konsantrasyonlarında artışlar genellikle doğrudan ATP nesil 3 yükseltmek için mitokondrial oksidatif fosforilasyonu teşvik edebilmek kalsiyum ile enerji talebi ile ilişkilidir. Etkili bir mitokondriyal kalsiyum birikimini izlemek ve bu fonksiyon genetik faktörler ve farmakolojik ajanların hem nasıl etkilendiğini karşıla...

Mitokondri yerel Ca 2 + tampon 1 olarak hareket ederek hücre içi Ca2 + konsantrasyonu düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Ca 2 +, Ca 2 + uniporter yoluyla mitokondri iç zarının (ΔΨ m) 2 arasında var olan elektrokimyasal gradyan tarafından yönlendirilen bir süreç mitokondri girer. Bir kez mitokondrial matriks içinde, Ca 2 + sitrik asit döngüsü 3 üç hız sınırlayıcı dehidrojenazları uyararak oksidatif fosforilasyonu aktif hale getirebilirsiniz. Bu uyarım pozitif kalsiyum iyonları mitokondrial matriks içine mitokondri iç zarı çapraz olarak geçici dağılır ΔΨ m, korur. Mitokondri içinde Ca2 + konsantrasyonu çok yüksek olursa, mitokondriyal geçirgenlik ΔΨ m dağılımı ile sonuçlanan başlatılabilir, cessatioOksidatif fosforilasyon, n ve yolları 4 sinyal hücre ölümünün indüklenmesi. mitokondri hücresel kalsiyum mekansal tamponlama oynadıkları önemli rol mitokondriyal kalsiyum doğru izlenmesi kritik hale getirir. Çeşitli yöntemler Rodamin bazlı boyaların kullanımı dahil mitokondriyal kalsiyum, izlemek için kurulmuştur. Böyle bir boya, Rhod-2, AM, 6 mitokondriyal Ca 2 + düzeyleri 5 ölçmek için mitokondri bölümleme oldukça etkilidir. Bazı boya lipozomlar gibi diğer organellere birikir, ya da hücre sitozol kalır Ancak dikkat etmek gerekir. Bununla birlikte, alt analizler mitokondri 7&#39;den olanlardan bu sinyalleri ayırt edilmesi için kullanılabilir. Mitokondriyal kalsiyum izlemek için başka bir teknik floresan muhabiri 8 oluşturur kullanır </s<html> &gt; Yukarı. Bu genetik olarak kodlanmış prob yararı özellikle, örneğin, insan COX alt birim VIII N-terminal hedefleme sinyali endojen N-terminali peptidi kullanılarak mitokondri hedef olabilir. Bu sistem 9 sinyalizasyon mitokondriyal kalsiyum araştırmak için son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır mitokondriyal hedefli aequorin probu oluşturmak için istihdam edilmiştir. Bu genetik olarak kodlanmış prob ana dezavantajı, geçici ekspresyonu ile hücre içine gereken (belirli hücre tipleri için uygun değildir ve değişken sonuçları üretebilir) veya sabit bir sentezleme sistemleri (ki zaman alıcı) oluşturarak olmasıdır. Yukarıda özetlenen sorunları aşmak için, biz aynı anda mitokondriyal Ca 2+ ve ΔΨ m ölçmek için yeni bir protokol geliştirmiştir. Bu protokol, permeabilize hücrelerin ekzojen kalsiyum ekler daha önce tarif edilen yönteme dayalıdırs = &quot;xref&quot;&gt; 10. Bizim protokol diğer yöntemlere göre üç ana avantajı vardır: Birincisi, biz Flu-4, AM ve TMRM mitokondriyal Ca 2+ ve ΔΨ m, çok farklı spektral özelliklere sahip iki boyalar izlemek için kullanın; ikincisi, hücreler Flu-4 sinyali sadece mitokondriyal Ca tespit edilir +2 ve Ca +2 diğer organellere veya hücre sitoplazmada lokalize olmayan şekilde permeabilize; ve üçüncüsü, Flu-4 kullanımı 2+ mitokondriyal Ca tespit etmek için genetik olarak kodlanmış problar kullanılarak eğer mevcut herhangi bir hücre transfeksiyon veya transformasyon sorunları inkâr, hızlı ve basit hücre boyama sağlar.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>fetal sığır serumu (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>1x fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100x penisilin/streptomisin (p/s)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>%0,25 Tripsin/%0,25 EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td>25200056</tr><tr><td>8 oyuklu lamel</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</sub</td><td>>Sigma-Aldrich</td><td>746452</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8126&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>malat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ ücretsiz Hank' s tamponlu tuz çözeltisi (HBSS)&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>tetrametilrodamin, metil ester, perklorat (TMRM)</td><td>ThermoFisher</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 asetoksimetil ester (Fluo-4,)</td><td>ThermoFisher</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>dimetil sülfoksit (DMSO)</td><td>ThermoFisher</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>karbonil siyanür p-triflorometoksifenilhidrazon (FCCP)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>tapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 &nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>P3000MP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>hemasitometre</td><td>VWR</td><td>631-0925</td><td></td></tr><tr><td>10 cm hücre kültürü kapları</td><td>Corning</td><td>COR430167</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 hücre kültürü şişeleri</td><td>Corning</td><td>COR430641</td><td></td></tr></tbody></table>

floresan mikroskopi canlı hücreler potansiyel mitokondriyal kalsiyum ve mitokondriyal membran eşzamanlı Ölçümü

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart ATP üreten önemli rolleri dışında, mitokondri de (Ca 2+) sıkıca hücre içi Ca 2 + konsantrasyonu düzenleyen tamponlar, yerel kalsiyum gibi hareket ederler. Bunu yapmak için, mitokondri Ca 2+ ayırmak için kendi iç zarı (ΔΨ m) arasında elektrokimyasal potansiyelini kullanmak. Mitokondriye Ca 2 + akını oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) kompleksleri ile elektron transferini artırmak, sitrik asit döngüsünün üç oran sınırlayıcı dehidrojenazları uyarır. Bu uyarım pozitif kalsiyum iyonları mitokondrial matriks içine mitokondri iç zarı çapraz olarak geçici dağılır ΔΨ m, korur. Biz konfokal mikroskopi kullanılarak canlı hücreler aynı anda ölçüm mitokondri Ca 2 + alımı ve ΔΨ m burada bir yöntem açıklanmaktadır. Hücreleri permeabilizing, mitokondriyal Ca 2+ canfloresan boya tetrametilrodamin kullanılarak ΔΨ m, metil ester, perklorat (TMRM) ölçümü ile, floresan Ca2 + göstergesi Fluo-4 AM kullanılarak ölçülebilmektedir. Bu sistemin avantajı, floresan boyalar arasında çok az spektral örtüşme aynı zamanda, doğru mitokondriyal Ca + 2 ve ölçüm ΔΨ m sağlayan olmasıdır. Ca2 + alikotları dizisel ilavesini kullanarak, mitokondriyal Ca 2 + alımı izlenebilir ve Ca2 + mitokondriyal membran geçirgenliği geçiş ve ΔΨ kaybını indükleyen edildiği konsantrasyon saptanmıştır m.

Biz kalsiyum 12 artış tampon 143B hücre mitokondri yeteneği üzerinde bir MT-ND5 mutasyonunun etkilerini incelemek için bu protokolü kullanılır. Burada gösterilen örnekte, kontrol 143B hücrelerinin TMRM ve Flu-4 ile yüklendi, digitonin permeabilization önce Am. Görüntüleme 5 dakika sonra, 1 sekiz ardışık eklemeler: CaCI2 ekzojen 40 mM, 100 seyreltme Son serbest Ca2 + iyonu konsantrasyonu, yapılmıştır [Ca2 +] hesaplanan. </p...

Mitokondri onları sitozolik Ca şekillendirmek için 2+ hücre içinde sinyal sağlayan (2+ Ca) kalsiyum tecrit kendi iç zarı (Δ Ψm) arasında elektrokimyasal potansiyeli kullanabilir. Floresan boyalar ve konfokal mikroskopi kullanılarak canlı hücreler eş zamanlı olarak ölçüm mitokondri Ca 2 + alımı ve ΔΨ m için bir yöntem tarif eder.

Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Bu prosedürün genel amacı, konfokal mikroskopi kullanarak canlı hücrelerde mitokondriyal kalsiyum alımını ve mitokondriyal membran potansiyelini eş zamanlı olarak ölçmek için basit bir yöntem sunmaktır. Bu yöntem, mitokondrilerin hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu sıkı bir şekilde düzenlemek için yerel kalsiyum depoları olarak nasıl görev yaptığı gibi mitokondriyal alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hem mitokondriyal kalsiyumun hem de mitokondriyal membran potansiyelinin, genetik manipülasyona gerek kalmadan canlı hücrelerde eş zamanlı ve spesifik olarak ölçülebilmesidir.Bu yöntem, mitokondriyal hastalık patolojisindeki kalsiyum regülasyonuna dair içgörü sağlayabilse de, idrar kalsiyum regülasyonunun kritik olduğu diğer daha yeni dejeneratif durumların incelenmesinde de kullanılabilir. Bu prosedürde, hücreleri kültür ortamında 37 °C'de 24 saat boyunca on santimetrelik hücre kültürü kaplarında veya 75 santimetrekarelik flasklarda büyütün. Hücreleri toplamak için, ortamı aspirasyonla uzaklaştırın ve hücreleri beş mililitre PBS ile yıkayın.Ardından, PBS'yi aspirasyon yoluyla uzaklaştırın. Daha sonra 1.5 milliliters Trypsin EDTA ek

simultaneous-measurement-mitochondrial-calcium-mitochondrial-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, mitokondriyal kalsiyum akıları floresan görüntüleme ile gerçek zamanlı ölçümü için bir yöntem açıklanır. Yöntemi seçici mitokondri ifade dairesel permutated bir çift uyarma YFP tabanlı oranlı metrik kalsiyum sensör (oranlı metrik pericam-mt) yararlanır.

Apoptozis sırasında Mitokondrial Kalsiyum Düzeyleri Dinamik değişiklikler izlenmesi Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensor Kullanımı

Konfokal mikroskobi lazer tarama kullanarak canlı hücreler yavaş akıları hızlı (mikrosaniye) kalsiyum olayları izole etmek için bir yöntem sunar. Bu yöntem, bir hücrede birkaç yüz piksel kayıt satırı tarar kalsiyum göstergeler floresan dalgalanmaları ölçer. Histogram analizi, bize farklı kalsiyum akıları zaman ölçeklerinde izole etmek için izin verir.

Hızlı Kalsiyum Dekapanları kardiyomiyositlerde Ölçme

Mitokondriyal füzyon zamanla mitokondriyal ağ üzerinden photoconverted matris hedefli YFP dengelenme izleme ölçüldü. Şimdiye kadar, sadece bir hücre bir anda bir saat uzun kinetik analizine tabi olabilir. Biz aynı anda böylece veri toplama işlemini hızlandıracak, birden çok hücre ölçen bir yöntem sunuyoruz.

Paralel Konfokal Mikroskop kullanarak birden fazla Hücre Kinetik Veri Kazanılması A Daha hızlı, Yüksek Çözünürlük, MTPA-GFP tabanlı Mitokondrial Füzyon Deneyi

Bu videoda, izole mitokondride mitokondriyal kalsiyum alımını ölçmek için plaka okuyucu tabanlı bir test açıklanmaktadır. Tahlil, mitokondriyal kalsiyum alımının ve aşırı kalsiyum yükünün kinetiğini incelemek için kalsiyuma duyarlı bir floresan boyanın floresan sinyalini analiz eder.

Mitokondriyal Kalsiyum Alım Testi: İzole Mitokondride Kalsiyum Alımını Ölçmek İçin Plaka Okuyucu Tabanlı Bir Yöntem

Bu videoda, kültürlenmiş hücrelerde mitokondriyal kalsiyum alımını ölçmek için konfokal mikroskopi görüntülemeye dayalı bir test açıklanmaktadır. Test, geçirgenleştirilmiş kültürlenmiş hücrelerdeki mitokondriyal kalsiyumu ölçmek için kalsiyuma duyarlı floresan boya Rhod-2 /'yi kullanır.

Kültürlenmiş Hücrelerde Mitokondriyal Kalsiyum Alımını Ölçmek için Kalsiyum Akışı Testi

Video, fare serebral arter segmentlerinin endotel hücrelerinde hücre içi kalsiyum seviyelerinin ve membran potansiyelindeki değişikliklerin eş zamanlı ölçümünü göstermektedir. İzole edilmiş endotel tüpü, bir floresan kalsiyum indikatörü ile yüklenir ve hücre içi kalsiyum salınımını indükleyen bir ilaçla muamele edilir, bu da zar potansiyelinde bir değişikliğe neden olur. İndikatörün floresansı, kalsiyum seviyelerinin ölçülmesini sağlar ve membran potansiyelindeki değişiklikleri ölçmek için bir...

Bir Fare Serebral Endotelyumunda Hücre İçi Kalsiyum ve Membran Potansiyelinin Eş Zamanlı Ölçümü

Ca2 + saklama kapasitesi ve Ca2 +incelemek için bir yöntemi açıklamak için bu protokolü amaçlamaktadır - mitokondrial SH-SY5Y izole mitokondri şişme adım adım hücreleri tetikledi.

Mitokondrial Ca2 + saklama kapasitesi tahlil ve Ca2 +-mitokondrial şişme tahlil tetiklenen

Burada, iki protokol mitokondrial Ca2 + akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri ölçümü için mevcut. İzole mitokondri için biz bir plaka okuyucu tabanlı Ca2 + alma detaylı tahlil Ca2 + hassas kullanarak boya kalsiyum yeşil-5N. Kültürlü hücreler için Ca2 + boya Rhod-2/AM kullanarak bir confocal mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır.

Mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri

Burada gösterdi (1) taze olduğu gibi beyin endotel "boru" ve endotel kalsiyum ve membran endotel kaynaklı hyperpolarization sırasında potansiyel (2) eşzamanlı ölçümler sorunlarının yalıtılması iletişim kurallarıdır. Ayrıca, bu yöntemler farmakolojik endotel hücre kalsiyum ve bireysel veya etkileşimli deneysel değişkenler olarak elektrik sinyali ayarlamak için izin verir.

Hücre içi kalsiyum ve taze izole ve olduğu gibi fare serebral endotel membran potansiyeli eşzamanlı ölçümler

Bu teknik, floresan tabanlı canlı görüntüleme kullanarak HeLa hücrelerindeki mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini görselleştirmek ve nicel olarak ölçmek için etkili bir iş akışını tanımlar.

HeLa hücrelerinde canlı görüntüleme kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelinin ve süperoksit seviyelerinin floresan bazlı ölçümü

Öğrenin, canlı hücrelerde mitokondriyal kalsiyum alımı ve membran potansiyelini konfokal mikroskopi ile eşzamanlı ölçme yöntemini. Bu teknik, genetik manipülasyon gerektirmeden mitokondri fonksiyonlarını araştırmak için kullanılır.

Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

Daha fazla video keşfet