Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü
24 Ocak 2017
Mitokondri onları sitozolik Ca şekillendirmek için 2+ hücre içinde sinyal sağlayan (2+ Ca) kalsiyum tecrit kendi iç zarı (Δ Ψm) arasında elektrokimyasal potansiyeli kullanabilir. Floresan boyalar ve konfokal mikroskopi kullanılarak canlı hücreler eş zamanlı olarak ölçüm mitokondri Ca 2 + alımı ve ΔΨ m için bir yöntem tarif eder.
Bu prosedürün genel amacı, konfokal mikroskopi kullanarak canlı hücrelerde mitokondriyal kalsiyum alımını ve mitokondriyal membran potansiyelini aynı anda ölçmek için basit bir yöntem sağlamaktır. Bu yöntem, mitokondrinin hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu sıkı bir şekilde düzenlemek için yerel kalsiyum depoları olarak nasıl davrandığı gibi mitokondriyal alandaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hem mitokondriyal kalsiyum hem de mitokondriyal membran potansiyelinin, genetik manipülasyona gerek kalmadan yaşam hücrelerinde aynı anda spesifik olarak ölçülebilmesidir.
Bu yöntem mitokondriyal hastalık patolojisinde kalsiyum regülasyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, idrar kalsiyumunun regülasyonunun çok önemli olduğu diğer yeni dejeneratif durumları incelemek için de kullanılabilir. Bu prosedürde, hücreleri on santimetrelik hücre kültürü kapları veya 75 santimetre karelik şişeler üzerinde, 24 saat boyunca 37 santigrat derecede kültür ortamında büyütün. Hücreleri hasat etmek için, ortamı aspirasyonla çıkarın ve hücreleri beş mililitre PBS ile yıkayın.
Daha sonra, PBS'yi aspirasyon ile çıkarın. Daha sonra 1.5 mililitre Tripsin EDTA ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede 2 dakika inkübe edin. Ardından, hücreleri çıkarmak için tabağa hafifçe vurun.
Onları beş mililitre kültür ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri bir hemositometre ile sayın. Konfokal görüntülemeden bir gün önce, hücreleri bulaşıklarda veya odacıklı örtü fişlerinde yüzde 60 ila 70 oranında birleşecek şekilde plakalayın.
Daha sonra, hücrelerin yapışmasına ve iyileşmesine izin vermek için hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu prosedürde, TMRM, Fluo 4 ve yüzey aktif madde ile kayıt boyama solüsyonunu hazırlayın. Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri 100 mikrolitre PBS ile yıkayın.
Daha sonra, PBS'yi çıkarın ve hücreleri oda sıcaklığında 45 dakika boyunca 100 mikrolitre kayıt boyama solüsyonunda inkübe edin. Bunu takiben, kayıt boyama solüsyonunu çıkarın ve fazla Fluo 4 ve TMRM'yi çıkarmak için hücreleri 100 mikrolitre kalsiyum içermeyen HBSS'de yıkayın. Daha sonra digitonin, TMRM ve thapsigargin ile hücre içi görüntüleme solüsyonunu hazırlayın.
Daha sonra kalsiyum içermeyen HPSS'yi çıkarın ve hücrelere 300 mikrolitre IM görüntüleme solüsyonu ekleyin. Kalsiyum klorür ilaveleri ile görüntülemeden önce hücreleri oda sıcaklığında on dakika dengede bırakın. Hücrelerdeki herhangi bir fotoğraf hasarını en aza indirmek için yaklaşık yüzde 5'lik düşük bir lazer gücü kullanın.
TMRM ve Fluo 4'nin uyarma ve emisyon spektrumları için mikroskop lazerlerindeki ayarı kullanın. Hücrelerin foto hasarını en aza indirmek için yüksek kazançla yaklaşık yüzde beşlik düşük bir lazer gücü kullanın. Ardından, mikroskobu her yirmi beş saniyede bir görüntüleri tarayacak şekilde ayarlayın. TMRM ve Fluo 4 sinyalleri için temel çizgi okumalarını oluşturmak için hücreleri on dakika boyunca tarayın.
Ardından görüntü taramasını duraklatın ve 3 mikrolitre 40 milimolar kalsiyum klorür stok çözeltisini 300 mikrolitre IM görüntüleme çözeltisindeki hücrelere doğrudan ekleyin. Bir pipetle hafifçe karıştırın. Hücrelere kalsiyum çözeltisi eklerken, çanağı mikroskop sahnesinde hareket ettirmemeye dikkat edin.
Yaklaşık dört dakika boyunca görüntü taramaya devam edin. Ardından, istenen TMRM veya Fluo 4 sinyallerine ulaşılana kadar her dört dakikada bir, genellikle yaklaşık sekiz ila on ekleme olmak üzere kalsiyum klorür ilavelerini tekrarlayın. Daha sonra, iç zar potansiyelini dağıtmak için doğrudan hücrelere bir milimolar FCCP'nin 1 ila 100 oranında seyreltilmesini ekleyin.
Ardından, deney bitmeden önce hücreleri beş dakika daha görüntüleyin. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, görüntü analiz yazılımını kullanarak Fluo 4 ve TMRM sinyallerinin yoğunluğunu belirleyin. Bunu yapmak için görüntüyü açın, seçim aracına tıklayın ve mitokondri içeren bir ilgi alanı seçin.
Analiz, Araçlar, ROI Yöneticisi açılarak ölçüm için birden fazla ilgi alanı seçilebilir. Yoğunluk ölçümü için seçilen ROI'yi dahil etmek için Ekle'ye tıklayın. Tüm ROI'ler ROI yöneticisine eklenene kadar önceki adımları tekrarlayın.
Daha fazla çoklu ölçüm işlevini seçerek ilgilenilen her bölge için TMRM ve Fluo 4 sinyallerinin ortalama floresan yoğunluğunu ölçün. Tüm Dilimleri Ölç'ün seçili olduğundan ve Dilim Başına Bir Satır'ın seçili olmadığından emin olun. Ardından, her bir zaman noktasındaki her ROI için TMRM ve Fluo 4 sinyallerinin ortalama floresan yoğunluğu tablosunu elde etmek için Tamam'a tıklayın.
Ardından, TMRM ve Fluo 4 sinyalleri için ortalama yoğunluğu ve standart sapmayı hesaplamak için verileri birleştirin. Bu deneyde, 143B hücreleri, digitonin ile geçirgenleştirmeden önce Fluo 4 ve TMRM ile önceden yüklendi. Her kalsiyum klorür ilavesinden sonra, kalsiyum iyonlarının mitokondriye akışı mitokondriyal membran potansiyelini dağıttıkça TMRM sinyali azalır.
10 mikromolar FCCP'nin eklenmesi hala membran potansiyelinin çökmesine neden olduğundan, geçirgenlik geçişini takiben küçük bir membran potansiyeli belirgindir. Burada, Fluo 4 sinyali ile gösterilen mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonu, ortamdaki serbest kalsiyum 0.32 mikromolar değere ulaştığında, ikinci kalsiyum klorür ilavesini takiben artmaya başlar. Sonraki her kalsiyum klorür ilavesi, mitokondriyal kalsiyumda ilerleyici bir artışa neden oldu.
Burada, mitokondriyal kalsiyumdaki membran potansiyelinin eşzamanlı ölçümlerinin görüntüleri gösterilmektedir. Kırmızı sinyal TMRM'yi ve yeşil sinyal Fluo 4'ü gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa yaklaşık iki saat içinde yapılabilir.
Bu videoyu izledikten sonra, geçirgen hücrelere eksojen kalsiyum ilavesi kullanılarak konfokal mikroskopide mitokondriyal kalsiyum seviyelerinin ve mitokondriyal membran potansiyelinin aynı anda nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız. FCCP ve digitonin ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman KKD giymek gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, konfokal mikroskopi kullanarak canlı hücrelerde mitokondriyal kalsiyum alımının ve membran potansiyelinin ölçümü için bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, araştırmacıların genetik manipülasyona başvurmadan mitokondrilerin hücre içi kalsiyum konsantrasyonlarını nasıl düzenlediğini incelemelerine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Mitokondriyal Araştırmalar
Arka Plan
- Mitokondriler, kalsiyum sinyalleşmesinde kritik bir rol oynar.
- Mitokondriyal fonksiyonun anlaşılması, çeşitli hastalıkların incelenmesi için önemlidir.
- Kalsiyum regülasyonu, hücresel sağlık için hayati öneme sahiptir.
- Mevcut yöntemler genellikle genetik manipülasyon gerektirmekte, bu da uygulanabilirliklerini sınırlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Mitokondriyal fonksiyonların ölçümü için basit bir yöntem sağlamak.
- Mitokondrilerin yerel kalsiyum depoları olarak rolünü araştırmak.
- Mitokondriyal hastalıklar ve diğer dejeneratif durumlar üzerine yapılan araştırmaları kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Hücreler, uygun besiyerlerinde 37 °C'de kültüre edilir.
- Hücreler hasat edilir ve PBS ile yıkanır.
- Kalsiyum alımını ve membran potansiyelini ölçmek için floresan boyalar kullanılır.
- Eş zamanlı ölçümler için konfokal mikroskopi uygulanır.
Temel Sonuçlar
- Yöntem, mitokondriyal kalsiyum dinamiklerinin gerçek zamanlı izlenmesine olanak tanır.
- Kalsiyum ve membran potansiyelinin eş zamanlı ölçümü gerçekleştirilir.
- Teknik, mitokondriyal hastalık patolojisine dair içgörüler sağlayabilir.
- Kalsiyum düzenlemesiyle ilişkili diğer durumların incelenmesinde uygulanabilir.
Sonuçlar
- Bu yöntem, canlı hücrelerdeki mitokondriyal fonksiyonların anlaşılmasını geliştirir.
- Sağlık ve hastalıklarda mitokondrinin rolünü araştırmak için bir araç sağlar.
- Bu yaklaşım, hücre biyolojisindeki çeşitli araştırma uygulamaları için çok yönlüdür.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Bu yöntem, canlı hücrelerde mitokondriyal kalsiyum dinamiklerinin ve membran potansiyelinin doğrudan ölçülmesini sağlayarak mitokondriyal disfonksiyon yolaklarında hedef doğrulama için kritik veriler sunar. Kalsiyumla tetiklenen geçirgenlik geçişini ve membran potansiyeli kaybını nicelleştirerek, biyenerjetik yetmezlikle ilgili terapötik hipotezlerin mekanistik risklerinin azaltılmasını destekler. Eş zamanlı okuma, kalsiyum akışını genetik manipülasyon olmaksızın mitokondriyal sağlıkla ilişkilendirerek erken keşif aşamasındaki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değeri: Hücresel kalsiyum homeostazının bir düzenleyicisi olarak mitokondriyal kalsiyum yönetimine ilişkin terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değeri: Floresan okumalar kullanarak canlı hücrelerdeki mitokondriyal hedeflerin fonksiyonel doğrulamasını sağlar.
- Öngörücü Değeri: Kalsiyumla tetiklenen geçirgenlik geçişini modüle eden bileşikleri belirleyerek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Kalsiyum alımının ve membran potansiyelinin kantitatif ve eş zamanlı tespiti için Fluo-4 AM ve TMRM ile permeabilize edilmiş hücreleri hazırlar.
- Tekrarlanabilirlik: Geçirgenlik geçiş eşiğinin belirlenmesi için doz-yanıt eğrileri oluşturmak amacıyla ardışık kalsiyum klorür eklemeleri kullanır.
- Ölçeklenebilirlik: Çok kuyucuklu adaptasyon ve ROI tabanlı yoğunluk analizi için konfokal mikroskopi platformlarıyla uyumludur.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişkisi: Nörodejenerasyon ve iskemik hasarla ilişkili mitokondriyal kalsiyum aşırı yüklemesini modeller.
- Translasyonel Süreklilik: Mitokondriyal hastalıkların preklinik modellerinde, akut kalsiyum akışı ölçümlerini kronik disfonksiyonla ilişkilendirir.
- Risk Ayarlı İlerleme: Kalsiyum tutma kapasitesi ve membran potansiyeli stabilitesine dayalı olarak devam/dur kararlarına veri sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, özellikle mitokondriyal kalsiyum regülasyonu ve oksidatif stres içeren yolaklar için, hedef etkileşiminden fonksiyonel doğrulamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Pertürbasyonların mitokondriyal kalsiyum tamponlamasını ve membran potansiyeli eşleşmesini nasıl etkilediğini test eder.
- Tarama: Bileşiklerin kalsiyumla indüklenen depolarizasyon üzerindeki etkilerinin karşılaştırılmasına olanak tanıyan kantitatif floresan okumalar sağlar.
- Analitikler: Zaman noktaları ve ROI'ler boyunca Fluo-4 ve TMRM sinyalleri için ortalama yoğunluk ve standart sapma verileri sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Akut geçirgenlik geçiş olaylarını, hastalık modellerindeki süregelen biyEnerjetik yetmezlikle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Mitokondriyal güvenlik farmakolojisi ve hedef risk azaltma için yeniden kullanılabilir bir analiz platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kalsiyum girişini membran potansiyeli kaybı ile doğrudan ilişkilendirerek mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Rasyometrik boya eşleştirmesi ve ardışık kalsiyum uyarımı yoluyla ölçümü standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Lider optimizasyonun erken aşamalarında mitokondriyal riskleri belirleyerek sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Kalsiyum tutma kapasitesi ve geçirgenlik geçişi duyarlılığına dayalı, riski ayarlanmış önceliklendirmeyi mümkün kılar.
Uygulama Hususları
- Canlı hücre görüntüleme, boya yükleme ve permeabilizasyon protokollerinde uzmanlık gerektirir.
- TMRM ve Fluo-4 eksitasyon/emisyonu için uygun lazer ayarlarına sahip konfokal mikroskopiye bağımlıdır.
- Kalsiyum içermeyen HBSS ve hücre içi görüntüleme çözeltisi hazırlığının ekipler arasında standart hale getirilmesini gerektirir.
- Farklı hücre tipleri ve mitokondriyal yoğunluklar için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Lazer maruziyetinden kaynaklanan fototoksisite riski ve permeabilizasyon sonrası boya sızıntısı gibi pratik sınırlamaları kapsar.
