Ana fenotipleri incelenmesi halinde Gambusia affinis Takiben Antibiyotik Tedavisi

Bu deneysel sistemin genel amacı, antibiyotik tedavisinden sonra bir konakçı organizma üzerindeki olumsuz yan etkileri incelemektir. Dolayısıyla bu yöntem, mikrobiyom alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin enbac ile ilişkili yan etkiler, örneğin bozulmuş bir mikrobiyomun aracılık ettiği konakçının sağlığı üzerindeki yan etkiler. Bu nedenle, bu tekniğin ana avantajları, bu sistemin omurgalı konakçıların fizyolojik fenotiplerini incelemede basit, ucuz olması ve mukozal mikrobiyomda invaziv olmayan bozulmaya izin vermesidir.

Bu tekniğin sonuçları, bir hayvanın mikrobiyomundaki bir bozulmanın nasıl büyük yan etkilere yol açabileceğini karakterize eder. Başlamak için, daha önce elde edilmiş ve donmuş bir enfeksiyöz Edwardsiella ictaluri suşunu E.Ictaluri seçici ve diferansiyel ortam agar üzerine sürün. Kültürü iki gün boyunca 27 santigrat derecede inkübe edin.

Kültürden saf izole edilmiş bir koloniyi aktarın ve 40 mililitre besin suyu içeren 150 mililitrelik bir şişeyi inoküle edin. Şişeyi iki gün boyunca 27 santigrat derece ve 150 RPM'de çalkalanan bir inkübatöre yerleştirin. İnkübasyonun ardından, E.Ictaluri kültürünü istenen enfeksiyöz doz hacimleri için kalibre etmek için, kültürün bir örneğini 0.2'lik bir OD 650'ye seyreltmek için PBST kullanın.

Gambusia affinis'i topladıktan ve balıkları üç gün boyunca su sütununda rifampisin ile tedavi ettikten sonra, hem antibiyotikle tedavi edilmiş hem de tedavi edilmemiş kontrol balık gruplarını, balık dokularından ilaç temizliği için yaklaşık 10 saat boyunca 130 mililitre taze yapay havuz suyu veya APW içeren ayrı plastik kaplara aktarın. Ardından, balığı tekrar 130 mililitre temiz APW içeren sekiz onsluk plastik kaplara ayırın. Her balığa öldürücü dozda E.Ictaluri kültürü uygulayın ve balığı 24 saat boyunca 27 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.

E.Ictaluri banyosunun ardından, her balığı 130 mililitre APW içeren yeni bir bardağa aktarın. Balıkları beslemeden, bir hafta boyunca balık ölümlerini kaydedin. Toplanan dışkı maddesini steril 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmadan önce steril bir plastik torbaya toplayın, daha sonra dışkı maddesinin mililitre başına 500 ila 800 miligramda bir stok konsantrasyonu oluşturmak için PBST'yi kullanın, bir mililitre veya daha büyük bir plastik pipet kullanarak ucu kesilmiş, APW'de mililitre başına 15 miligram veya mililitre dışkı maddesi başına 10 miligram fincan başına 130 mililitre hazırlayın.

Antibiyotikle muamele edilmiş veya işlenmemiş balıkları çözeltinin ayrı kaplarına aktarın ve daha sonra balığı iki gün boyunca 25 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, bu süre zarfında ölüm oranını yakından gözlemleyin ve kaydedin. Balıkları toprakla tedavi etmek için, yaklaşık yedi ila 15 santimetre derinliğinde bir ila kilogram zengin organik üst toprak toplayın ve temiz bir plastik kaba aktarın. 18.2 gram toprak ve 130 mililitre APW içeren ayrı plastik kaplar hazırlayın, toprağı elle iyice karıştırın, ardından antibiyotikle muamele edilmiş veya işlenmemiş balıkları kaplara aktarın ve herhangi bir ölüm oranını kaydederken üç gün boyunca 25 santigrat derecede bırakın.

Antibiyotik tedavisini takiben APW'de 10 saatlik bir dinlenme süresinden sonra, balıkları mililitre başına 17.5 miligram sodyum klorür ve APW içeren ayrı kaplara aktarın, nitrat toksisitesi mücadelesi yapmak için balığı 36 saat boyunca mortalite açısından gözlemleyin, daha önce olduğu gibi 10 saatlik bir dinlenme süresinden sonra, balıkları mililitre sodyum nitrat ve 130 mililitre APW başına 10 veya 17.5 miligram içeren ayrı kaplara ayırın. Balıkları yüksek dozda sodyum nitrat dozunda ölüm oranı açısından bir gün boyunca ve düşük dozda balıklar için dört gün boyunca gözlemleyin. Gruplar halinde üç günlük antibiyotik veya kontrol maruziyetini tamamladıktan sonra, bireysel balıklar için, sekiz ons strafor kapları 150 mililitre APW ile doldurun ve doldurulmuş kapları tarttıktan sonra, balıkları kaplara aktarın, ardından ilk değerlendirme için toplam vücut ağırlığını kaydedin.

Balıkları her gün balık başına iki pelet yiyecekle besleyin, yenmemiş peletleri görsel olarak kaydederek tüketimi izleyin. Dört hafta boyunca her haftanın sonunda, önce bir fincan taze APW'yi tartarak balık ağırlığını belirleyin ve ağırlığı kaydedin, ardından balığı bir daldırma ağına dökün ve bardağı tekrar tartmadan önce yeni bardağa aktarın. Balık grupları için bir bardağa 150 mililitre APW koyun ve tartıyı darasını alın.

Balıkları yeni APW kaplarına aktarırken her iki grupta da bir arada tutun, ardından toplam grup ağırlığını kaydedin. Tartıyı bir ay boyunca her haftanın sonunda tekrarlayın. Bağırsak geçiş süresini analiz etmek için, steril 1.7 mililitrelik bir tüpe 360 mikrolitre steril deiyonize su ve 52 miligram jelatin ekleyin ve jelatin eriyene ve tamamen çözünene kadar 60 santigrat derecelik bir ısı bloğuna yerleştirin.

Bir ölümlü ve havaneli kullanarak, akvaryum balığı yemi pullarını ince bir toz haline getirin ve 20 mikrolitre balık yağı ile birlikte tüpe 40 miligram toz ekleyin. Karıştırdıktan sonra 1.6 miligram FitC dekstran ekleyin. 20 mikrolitrelik sıcak sıvıyı laboratuvar tezgahındaki parafilm üzerine damlatın ve hızla soğumalarını ve katılaşmalarını bekleyin.

Parafilmi bir Petri kabının yarısına yerleştirin ve kapalı bir plastik kabın içinde steril su üzerinde yüzdürün. Katılaşmış damlaları, balığın yiyemeyeceği kadar sertleşmeden önce buzdolabında dört güne kadar saklayın. Beslemeden hemen önce, damlaları çeyrek bölümlere ayırmak için bir tıraş bıçağı kullanın.

Balıkları iki gün boyunca beslemeden ayrı strafor kaplara alıştırın, yiyeceğin dörtte dördünü balık kabına koyun ve balıkları her birinin kaç parça yemek yediği için 30 dakika boyunca gözlemleyin. İzlemeye başlamak için, tek tek balıkları 80 mililitre APW içeren kaplara aktarın ve her iki saatte bir 1 mililitre numune alın. Dört santigrat derecede etiketli 1.7 mililitrelik bir tüpte saklayın.

Testin tamamlanmasından sonra, bir mililitrelik numunenin tamamını bir küvete yerleştirin ve 495 nanometrelik bir uyarmada floresan kaydetmek için bir floresan spektrofotometresi ve aynı anda tüm numuneler için 520 nanometrelik bir emisyon kullanın. burada gösterildiği gibi, antibiyotikle değiştirilmiş bir mikrobiyomu olan balıklar, kontrol balıklarına göre bir E.Ictaluri enfeksiyonuna daha duyarlıydı. Tedavi edilen ve kontrol edilen balıklar için ortalama ölüm süresindeki fark anlamlı değildi.

Bu muhtemelen küçük grup boyutundan kaynaklanmaktadır. Bu grafik, rifampisine maruz kalan balıkların kontrol balıklarına göre ozmotik strese daha duyarlı olduğunu, bu tahlil ile mililitrede 18 miligramın üzerindeki tuzluluk seviyelerinin hızlı balık ölümüyle sonuçlandığını göstermektedir. Bu tabloda gösterildiği gibi, su kolonundaki toksin nitrata maruz kaldığında, antibiyotik tedavisine önceden maruz kalma sağkalımı etkilememiştir.

Mililitre başına 10 miligramda, hem antibiyotik ile tedavi edilen hem de kontrol grupları için 90 saatte% 50 ölümcüllük gözlendi. Bir akvaryumda kontrol balıkları kullanılarak yapılan bu deneyde, FitC dekstran etiketli yiyeceklerin iki bölümü veya zaman içinde çevredeki sudaki floresanı ölçerek yiyecek geçiş süresini incelemek için bir bölüm balıklara verildi. Bu prosedürü takiben, mekanizmaları anlamak ve olumsuz konak etkilerine katkıda bulunabilecek kafa karıştırıcı faktörleri daraltmak için toplam vücut yağ depolarının ölçülmesi ve cilt mukoza üretiminin ölçülmesi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.