Elektrofizyolojik Çalışmalar Yetişkin Fare Retina Yatay Dilimleri hazırlanması

Fare retinasının bu yatay dilim hazırlığının genel amacı, retinanın sinaptik devrelerindeki işlevsel rollerini incelemek için yatay olarak yönlendirilmiş nöronların morfolojik ve fizyolojik bütünlüğünü korumaktır. Bu yöntem, duyusal sinyallerin tekrarlanan retinanın şerit sinapslarına nasıl kodlandığı ve entegre edildiği gibi görsel bilgi işleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yatay hücreler ve amakrin hücreler gibi yatay olarak yönlendirilmiş internöronların işlevsel olarak sağlam olması ve elektronik kayıtlar için erişilebilir olmasıdır.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımda bir teknisyen olan Andrea Nerz olacak. Bu işleme başlamak için, gözün altına bir çift kavisli forseps yerleştirerek göz küresini çıkarın. Optik siniri ortaya çıkarmak için göz küresini yavaşça yukarı kaldırın ve yaylı bir makasla kesin.

Ardından göz küresini iki mililitre AMS ortamı içeren 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Stereo mikroskop altında, büyütmeyi optimum görsel kontrole izin veren bir değere ayarlayın. Daha sonra, göz küresini bir çift forseps ile sabitleyin ve skleraya geçişte korneayı başka bir sivri forseps veya 20 gauge iğne ile delin.

Korneayı delerken retinaya zarar vermemeye dikkat edin. Ardından, yaylı makası küçük deliğe sokun. Kornea etrafında bir daire keserken göz küresini forseps ile sabitleyin ve retinayı kesmemek için kesiyi yüzeye çok yakın tutun.

Kornea lensini ve vitreus gövdesini dikkatlice çıkarın. Vitreus gövdesi gözün arkasında sadece ince şeffaf bir tabaka oluşturur. Bununla birlikte, vibratom kesiti için vitreus gövdesinin tamamen çıkarılması esastır.

Petri kabında, göz kabını retinaya doğru net bir delik gösterecek şekilde konumlandırın. Açıklığın kenarı sadece skleral dokudan oluşmalıdır. Sonra, sklerayı forseps ile tutun ve dokuyu dikkatlice ayırın.

Bu adımda retinayı yırtmamak çok önemlidir. Bu aşamada retina ve göz kabının geri kalanı sadece optik sinir başından bağlanmalıdır. Optik sinir başındaki bağlantı noktasını yaylı makasla kesin.

Retina artık AMS ortamında tek bir doku parçası olarak serbestçe yüzüyor olmalıdır. Daha sonra, retinayı geniş çaplı bir Pasteur pipeti ile bir kapak fişine aktarın ve retinayı kavisli bir neşter bıçağı kullanarak yaklaşık iki x üç milimetre karelik dört ila altı küçük dikdörtgen halinde kesin. Retina dokusunu dikdörtgenlerin içine sıkıştırmaktan kaçının.

Bu prosedürde, iki ila üç retina parçasını, büyük çaplı bir plastik Pasteur pipeti ile AMS ortamının bir kısmı ile birlikte bir cam Petri kabına dikkatlice aktarın. Bir cam Pasteur pipeti ile kalan AMS ortamının mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. Daha sonra retina parçalarını hemen iki mililitre 37 santigrat derece çözünmüş agaroz ile kaplayın.

Retina parçalarını yavaşça Petri kabının altına itin. Ganglion hücre katmanını, agaroz hızlı bir şekilde katılaştığı için mümkün olduğunca hızlı ve hassas bir şekilde aşağı bakacak şekilde konumlandırın. Aynı zamanda, bölümlerin teğet veya eğik olmasını önlemek için retina parçalarını cam tabağın dibine paralel olacak şekilde düzenleyin.

Bundan sonra, daha fazla işlemden önce agarozu sertleştirmek için gömülü retina parçalarını buzdolabına aktarın. Şimdi retina parçalarını içeren agaroz bloğunu Petri kabından dikkatlice ayırın. Agaroz bloğunu camdan dikkatlice kaldırmak için bir neşter bıçağı kullanın.

Daha sonra, agaroz bloğunu bir cam kapak kızağı üzerine yerleştirin. Boyutunu bir neşter bıçağıyla ayarlayın ve retina parçalarının her iki tarafında bir ila iki milimetre agaroz bırakın. Daha sonra, agaroz bloğunu anında bir yapıştırıcı kullanarak vibratom numunesi tutucusuna yapıştırın.

Önceden köpürtülmüş AMS ortamını vibratomun tampon tepsisine dökerek bloğu hemen kapatın. Bu şekilde, dilimin yüzeyine yakın yerleştirilmiş yatay bir hücre, dote kontrast optiği ile görselleştirildi. Bu görüntü, hala hücreye bağlı olan bir yama elektrot aracılığıyla Oregon Green 488 BAPTA-1 ile doldurulmuş yatay bir hücreyi göstermektedir.

Burada gösterilen, boya enjekte edilmiş bir yatay hücrenin kaplaması ve varsayılan sinaptik temasları ortaya çıkaran flouisin birleştirilmiş fıstık aglütinini ile etiketlenmiş bir dizi koni pedikülüdür. Bu şekilde, eksi 60 milivoltluk bir tutma potansiyelinde tüm hücre voltajı kelepçesi kaydı, yüksek frekanslı tonik sinaptik aktiviteyi göstermektedir. Daha yüksek zamansal çözünürlükte, sinaptik olaylar monofazik dalga formları veya daha karmaşık akım yörüngeleri gösterir.

Bu şekilde, yatay bir hücrenin bir ışık uyaranına akım tepkisi gösterilmiştir. Işık, iyon kanallarının kapanmasına ve bir sinaptik aktivite bloğuna neden olur. Ve bu şekilde, koni foto reseptörleri, hücre dışı bir elektrot ile elektriksel olarak uyarıldı.

Post sinaptik uyarıcı akımlar, stimülasyon gücü ile derecelendirilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür uygun şekilde yapılırsa bir saatten daha kısa sürede yapılabilir. Bu prosedürü takiben, retina ağlarında görsel bilginin işlenmesi gibi ek soruları yanıtlamak için kalsiyum görüntüleme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, fonksiyonel sinaptik girişlerle memeli retinasının yatay dilimlerini yatay olarak genişletilmiş hücre tiplerine nasıl keseceğinizi iyi anlamış olmalısınız.