Konfokal Mikroskobu kullanılarak Transfekte İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri Canlı Hücre Görüntüleme ve 3D Analiz Angiotensin Reseptör Tip 1a Ticareti
27 Mart 2017
Burada anjiotensin II tedavi tarafından başlatılan endositoz sırasında yeşil flüoresan protein etiketli anjiotensin tip 1a reseptörlerini eksprese görüntü hücrelere bir protokol mevcut. Bu teknik, zaman içinde, üç boyutlu olarak reseptör ve lizozom ko-lokalizasyonunu analiz yazılımı kullanılarak daha sonra etiket, ikinci bir fluoresan işaretleyici ile lizozomlar ve benzerini kapsamaktadır.
Bu deneyin genel amacı, Anjiyotensin iki tedavisi sonrası Anjiyotensin tip bir reseptör ile lizozomun kolokalizasyonuna dair kantitatif mekansal ve zamansal kanıtlar elde etmektir. Bu yöntem, ligand stimülasyonuna yanıt olarak meydana gelen internalizasyon sürecinde, Y tipi reseptörler ile mutant reseptörlerin hücre altı işlenişindeki farklılıkları tespit etmek için tasarlanmıştır. Bu tekniğin avantajları; canlı hücre görüntülemenin, fikse edilmiş ve deterjanla permeabilize edilmiş hücrelerden kaynaklanan artefaktları ortadan kaldırması ve reseptör lokalizasyonundaki dinamik değişikliklerin gerçek zamanlı olarak değerlendirilebilmesidir.
Uygun bir 1.4 sayısal açıklıklı objektif seçerek ve objektifi mikroskop tablasının üzerinde merkezleyerek başlayın. Objektifin üzerine bir damla yüksek viskoziteli, düşük oto floresanslı imersiyon yağı ekleyin ve transfekte edilmiş hücrelerin bulunduğu hazneyi mikroskop tablasına yerleştirin. Yağ, ilk lamın altına değene kadar objektifi nazikçe yükseltin ve sönük hücreleri bulun.
Görüş alanının merkezinde sağlıklı bir hedef hücre varken, konfokal moda geçin ve hücrenin, ventral tarafı lamıla yakın şekilde konumlanmış olarak iyi yayıldığını doğrulayın. Z Stack iletişim kutusunu açın, Live seçeneğine tıklayın, hücrenin üst kısmına odaklanın ve ardından Begin seçeneğine tıklayın. Sonra hücrenin alt kısmına odaklanın, Z adım boyutu olarak 1.00 micrometer değerini girin ve ardından End seçeneğine tıklayın.
Ardından, üst kısımdaki Acquisition ayarları altından XYZT Modunu seçin. Son olarak, GFP etiketli Anjiyotensin Tip 1A Reseptörünün lizozomları hedeflemesini gözlemlemek için tarama zaman aralığını ve tarama süresini ayarlayın. Daha sonra ligand stimülasyonuna başlamak için, görüntülenen kuyucuğa 100 X ligand stok çözeltisinden üç mikrolitre ekleyin ve yanıtı istenen süre ve frekansta 3B olarak görüntülemek için Start'a tıklayın.
Canlı hücre görüntülerini analiz etmek için uygun 3D görüntü nicelik belirleme yazılımını açın. Bu protokolde Velocity kullanılmıştır. Görüntü alanına sağ tıklayın ve Özellikler'i seçin.
GFP etiketli reseptör vezikülünü ve ligand uygulamasına yanıt olarak tüm hücre yoğunluklarını analiz etmek için bir ölçüm dizisi oluşturmak üzere uygun XY ve Z görüntü piksel özelliklerini girin. 2D menüsü altında, hücreyi gözlemlemek için genişletilmiş odak modunu seçin. Ardından, hücre etrafında bir ilgi alanı çizmek için serbest stil bölge aracını kullanın ve seçimi kırpmak için görüntüye sağ tıklayarak Seçime Göre Kırp'ı seçin.
Yeni bir görüntü öğesi oluşturulacaktır. Kırpılmış hücre görüntüsünü seçmek ve ölçüm sekmesini açmak için görüntü adına tıklayın. İçselleştirilmiş veziküllerin GFP ekspresyonunu ölçmek için, Finding kısmındaki Find Objects öğesini yukarıdaki sekans kutusuna sürükleyin.
Nesneleri bulma kanalını GFP olarak ayarlayın ve standart sapmayı kullanarak eşik değerini belirlemek ve en parlak GFP yoğunluklarına sahip nesneleri seçmek için alt sınırı altı olarak ayarlamak üzere ayarlar simgesini açın. Minimum nesne boyutunu sıfır mikrometre küp olarak ayarlayın. Ardından, ölç butonuna tıklayarak kanalları ve ölçüm türlerini seçin.
Tüm hücreyi tanımlamak için eşik değerini ve filtreleri belirlemek ve toplam GFP yoğunluğunu ölçmek için ikinci bir Find Objects kutusunu sürükleyin. Ardından, herhangi bir GFP yoğunluğuna sahip nesneleri seçmek için Find Objects kanalını GFP olarak ayarlayın, standart sapmayı sıfıra ve minimum nesne boyutunu iki µm³'e ayarlayın. Tüm hücreyi seçmek ve daha küçük tüm nesneleri elemek için Filter Population'ı Population two Find Objects kutusuna sürükleyin ve 100 µm³'ten büyük bir hacim seçin.
Ardından, tüm zaman noktalarında ölçüm yapmak için ölçümleri ve Ölçüm Yap öğesini seçin. Veziküllerdeki ve tüm hücredeki ölçülen GFP ekspresyonunu zaman içinde analiz etmek için, görüntü adının altındaki ölçüm öğesi dosya adına tıklayın. Toplam veriler arasından GFP ve veziküllere ait verileri ayıklamak için ham veri sekmesini açın ve birinci popülasyonu seçin.
Ardından, analiz edilen sekmesini açın ve verilere sağ tıklayarak analysis seçeneğini, ardından popülasyon birini seçmek için restricting analysis seçeneğini belirleyin. Tüm hücredeki GFP miktarını ölçmek için her ikisini de popülasyon iki olarak değiştirin. Analyze These Data ve Summarized By başlıkları altında, sum GFP color channel ve sum seçeneklerini belirleyin.
Ardından, "Organize the data by" (Verileri şuna göre düzenle) altındaki "row" (satır) kısmından "time point" (zaman noktası) seçeneğini belirleyin. Lizozomlardaki GFP miktarını belirlemek için "Find Objects" (Nesneleri Bul) kısmındaki birinci popülasyonda, "find objects channel" (nesneleri bulma kanalı) seçeneğini kırmızı kanala ayarlayın. Diyalog kutusundaki çark simgesinde, en parlak yoğunluğa sahip kırmızı nesneleri seçmek için "threshold using" (eşik belirleme) kısmını "standard deviation" (standart sapma) olarak, "lower limit" (alt sınır) değerini altı olarak ve "minimum object size" (minimum nesne boyutu) değerini 0,017 micrometers cubed olarak ayarlayın.
Ölçümleri seçin ve tüm zaman noktalarında ölçüm yapmak için bir ölçüm öğesi oluşturun. Lizozomlardaki ölçülen GFP ekspresyonunu analiz etmek için görüntü adının altındaki ölçüm öğesi dosya adına tıklayın. Ham sekmesi altında birinci popülasyonu seçin ve ardından analiz sekmesi altında birinci popülasyonu, toplam GFP renk kanalını ve toplamı seçerek, kırmızı veziküllerdeki GFP miktarını ölçmek için daha önce yaptığınız gibi sağ tıklayın.
Ligand stimülasyonundan önce, GFP etiketli Anjiyotensin Tip 1A Reseptörleri ağırlıklı olarak plazma membranında lokalizedir. Ancak, Anjiyotensin iki ilavesinden sonraki 2,5 dakika içinde, bu reseptörler internalize olarak parlak veziküller oluşturur ve daha sonra kümelenerek geniş paranükleer zom veziküllere dönüşür. Bu temsilci GFP ekspresyon ölçüm verilerinde gözlemlendiği üzere, Anjiyotensin iki tarafından indüklenen ruffling (hücre yüzeyinde kıvrımlanma), toplam vezikül GFP yoğunluğunun kantifikasyonunu karmaşıklaştırmaktadır.
Boyut filtreleme, daha büyük fırfırlar ile kümelenmiş veziküller arasında ayrım yapmaz, ancak küçük nesnelerdeki GFP'nin, büyük nesnelerdeki GFP'den daha erken arttığını ortaya koyar. Otomatik odaklama olmadan gerçekleştirilen GFP ekspresyonunun bu temsili zaman seyrinde, internalize olan GFP, toplam hücresel GFP'nin yüzdesi olarak ölçülmüştü. Hücre içindeki toplam GFP'nin analizi, bu hücrenin zamanla belirgin bir fotobeyazlamaya uğramadığını göstermiştir.
Transfekte edilmiş hücrelerin lizozomlarındaki GFP miktarının belirlenmesi, Angiotensin Tip 1A Reseptörünün lizozomlar içindeki yoğunluğunun, Angiotensin iki uygulamasından sonraki 24 dakikaya kadar değişmediğini göstermektedir. Bu prosedür sırasında, işlemin zaman alıcı olması nedeniyle, görüntüleme öncesinde ve sırasında hücrelerin sağlığının izlenmesi gerektiğini unutmamak önemlidir; hücre kültürlerinde herhangi bir anormallik görülmesi durumunda deney sonlandırılmalıdır. Bu prosedürün ardından, reseptörlerin hücre içi lokalizasyonunu tespit etmek ve doğrulamak için immünboyama ve FRET veya FLIM kullanılabilir.
Reseptör taşınması sırasında yer alan sinyal moleküllerinin kimliğini ve değişimlerini belirlemek için Western blot analizleri yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, ligand tarafından tetiklenen transmembran reseptörlerin lizozomlara ve diğer hücre altı bölmelere yönelimini ölçmek için canlı hücre görüntülemesinin ve analizinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, angiotensin II tedavisiyle başlatılan endositoz sırasında yeşil floresan protein etkili angiotensin tip 1a reseptörleri eksprese eden hücrelerin görüntülenmesi için bir protokol sunmaktadır. Yöntem, reseptör ve lizozom ko-lokalizasyonunun gerçek zamanlı analizine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Nörobilim
- Floresan Mikroskopi
Arka Plan
- Anjiyotensin tip 1 reseptörleri, hücresel sinyal iletiminde kritik bir rol oynar.
- Reseptör endositozunu anlamak, ligandlara verilen hücresel yanıtların aydınlatılması açısından önemlidir.
- Gerçek zamanlı görüntüleme teknikleri, dinamik hücresel süreçler hakkında içgörüler sağlayabilir.
- Önceki yöntemler, gerçek hücresel davranışı gölgeleyen artefaktlara yol açabilir.
Çalışmanın Amacı
- Reseptör-lizozom kolokalizasyonuna dair kantitatif konumsal ve zamansal kanıtlar elde etmek.
- Yabani tip ve mutant reseptörlerin internalizasyon süreçlerini karşılaştırmak.
- Canlı hücrelerdeki reseptör dinamiklerine ilişkin anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Yüksek sayısal açıklıklı bir objektif kullanılarak canlı hücre görüntülemesi.
- Görüntüleme kalitesini artırmak için imersiyon yağı uygulaması.
- Reseptör lokalizasyonunu takip etmek için lizozomların floresan işaretlemesi.
- Üç boyutlu ko-lokalizasyon değerlendirmesi için yazılım analizi.
Temel Sonuçlar
- Gerçek zamanlı görüntüleme, reseptör dinamiklerini etkili bir şekilde yakalar.
- Yabanıl tip ve mutant reseptörlerin internalizasyonu arasında farklar gözlemlenmiştir.
- Reseptörlerin ve lizozomların ko-lokalizasyonu başarıyla nicelendirilmiştir.
- Bu teknik, fikse edilmiş hücrelerle ilişkili artefaktları minimize eder.
Sonuçlar
- Bu protokol, reseptör endositozunu incelemek için sağlam bir yöntem sunmaktadır.
- Gerçek zamanlı görüntüleme, hücresel sinyal mekanizmaları hakkında kritik bilgiler sağlayabilir.
- Bulgular, çeşitli biyolojik bağlamlarda reseptör fonksiyonunu anlamak açısından önem taşıyabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluk
Reseptör taşınımının canlı hücre görüntülemesi, ligand kaynaklı hücre altı dinamiklerin gerçek zamanlı ve kantitatif değerlendirmesine olanak tanıyarak fiksasyondan kaynaklanan artefaktları azaltır ve erken hedef doğrulamada mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler. Bu yaklaşım, reseptör davranışında öngörülebilir bir güven sağlayarak ön aday belirleme ve preklinik model seçimindeki devam/dur kararlarına temel oluşturur. Uzamsal ve zamansal kolokalizasyon verilerini yakalayarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan translasyonel sürekliliği güçlendirir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Ligand stimülasyonuna yanıt olarak gerçek zamanlı reseptör internalizasyonunu ve lizozomal trafiği görselleştirerek terapötik hipotezleri sorgulayın.
- Operasyonel Değer: Membran reseptör lokalizasyonunu yanıltan fiksasyon artefaktlarını ortadan kaldırarak hedef doğrulaması için veri güvenilirliğini artırın.
- Öngörücü Değer: Trafik kinetiğini değerlendirmek ve reseptör varyantlarının fenotipik taramasını desteklemek için zaman içindeki reseptör-lizozom kolokalizasyonunu nicelleştirin.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Standardize edilmiş, tekrarlanabilir canlı hücre görüntüleme iş akışları için EGFP etiketli reseptörler eksprese eden valide edilmiş HEK-293 hücre sistemlerini hazırlayın.
- Kantitatif Çıktı: Bileşik etkisinin değerlendirilmesine olanak tanıyan, veziküllerdeki ve lizozomlardaki reseptör yoğunluğunun zaman içindeki 3D voksel tabanlı ölçümlerini oluşturun.
- Ölçeklenebilirlik: Tanımlanmış görüntüleme parametreleri (Z-adımı, zaman aralığı, voksel boyutu) ve otomatik segmentasyon aracılığıyla yüksek içerikli görüntüleme platformlarını destekleyin.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgisi: Kardiyovasküler hedef modülasyon stratejilerine bilgi sağlamak amacıyla, insan hücre sisteminde anjiyotensin reseptör taşınımını modelleyin.
- Translasyonel Biyobelirteç: Reseptörün lizozomal birikimini aşağı akış sinyalizasyon sonuçlarıyla ilişkilendirerek, biyobelirteçle uyumlu preklinik modelleri destekleyin.
- Riske Göre Ayarlanmış İlerleme: Uygun hücre içi işlem profillerine sahip reseptör varyantlarını veya ligandları önceliklendirmek için taşınım kinetiğini kullanın.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürecine entegre olarak, reseptör fonksiyonunun erken preklinik değerlendirmesine temel oluşturan dinamik ve kantitatif veriler sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Ang II kaynaklı internalizasyonun gerçek zamanlı görselleştirmesi yoluyla, reseptör taşınma mekanizmalarının hipotez testlerini desteklemek ve yolakların netleştirilmesini sağlamak.
- Tarama: Tekrarlanabilir vezikül ve lizozom tespitini garanti eden standartlaştırılmış transfeksiyon, boyama ve görüntüleme parametreleri aracılığıyla analiz hazırlığını mümkün kılmak.
- Analizler: Zaman noktaları arasındaki koşulları karşılaştırmak için, reseptör vezikülleri ve lizozomlardaki GFP yoğunluğunun toplam hücresel GFP'ye normalize edilmiş kantitatif okumalarını sunmak.
- Translasyonel Araştırma: Reseptör lokalizasyonunu hastalıkla ilgili sistemlerdeki fonksiyonel sonuçlarla ilişkilendirerek, canlı hücre görüntüleme verilerini preklinik sürekliliğe bağlamak.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla hedef ve hücre hattında GPCR taşınma çalışmaları için yeniden kullanılabilir bir görüntüleme platformu oluşturmak.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Fiksasyon artefaktlarını minimize ederek ve dinamik trafik olaylarını yakalayarak reseptör davranışına yönelik öngörü güvenini artırmak.
- Operasyonel Değer: Ekipler arası görüntüleme ve analiz protokollerini standardize ederek sübhücre yerleşim verilerinin tekrarlanabilirliğini geliştirmek.
- Stratejik Değer: Vahşi tip ve mutant varyantlar arasındaki reseptör işleme farklarını ortaya çıkararak, aday optimizasyonunda veri odaklı devam/dur kararlarına imkan sağlamak.
- Portföy Etkisi: Doğrulanmış trafik kinetiği ve lizozomal etkileşime dayanarak, reseptör hedefli adayların riskle uyumlu önceliklendirmesini desteklemek.
Uygulama Hususları
- Konfokal mikroskopi, floresan protein işaretleme ve canlı hücre görüntüleme protokollerinde uzmanlık gerektirir.
- Optimum sinyal tespiti için yüksek sayısal açıklıklı objektiflere, imersiyon yağına ve lazer taramalı konfokal sistemlere dayanır.
- Tutarlı sonuçlar için görüntüleme parametrelerinin (Z-adımı, zaman aralığı, voksel boyutu) ve analiz eşiklerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Farklı reseptör etiketleri, floresan boyalar ve HEK-293 dışındaki hücre tipleri için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Yüksek görüntüleme hızlarında fotobeyazlama riski ve zamansal çözünürlük ile foton toplama arasındaki ödünleşimler gibi pratik sınırlamaları kapsar.
