Konfokal Mikroskobu kullanılarak Transfekte İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri Canlı Hücre Görüntüleme ve 3D Analiz Angiotensin Reseptör Tip 1a Ticareti

Bu deneyin genel amacı, Anjiyotensin iki tedavisinden sonra Anjiyotensin tip bir reseptör lizozom kolokalizasyonunun kantitatif mekansal ve zamansal kanıtlarını elde etmektir. Bu yöntem, içselleştirme sürecinde olduğu gibi, ligand simülasyonuna yanıt olarak ortaya çıkan mutant reseptörlere karşı Y tipinin hücre altı işlenmesindeki farklılıkları tespit etmek için tasarlanmıştır. Bu tekniğin avantajları arasında, yaşam hücresi görüntüleme, sabit ve deterjan geçirgen hücrelerden artefaktları ortadan kaldırması ve reseptör lokalizasyonundaki dinamik değişikliklerin gerçek zamanlı olarak değerlendirilebilmesi sayılabilir.

Uygun bir 1.4 sayısal açıklık objektifi seçerek ve objektifi mikroskop aşaması üzerinde ortalayarak başlayın. Objektif üzerine bir damla yüksek viskoziteli, düşük otomatik floresan daldırma yağı ekleyin ve aktarılan hücrelerin bulunduğu odayı mikroskop aşamasına aktarın. Yağ ilk sürgünün altına değene kadar hedefi yavaşça kaldırın ve loş hücreleri bulun.

İlgilenilen sağlıklı bir hücre ile, görüş alanının merkezinde, konfokal moda geçin ve hücrenin, ventral tarafı kapak kayması ile yakından yan yana gelecek şekilde iyi bir şekilde yayıldığını onaylayın. Z Yığını iletişim kutusunu açın, Canlı'yı tıklatın, hücrenin üst kısmına odaklanın ve ardından Başlat'ı tıklatın. Ardından hücrenin en altına odaklanın, Z adım boyutu 1,00 mikrometre girin ve ardından Son'u tıklatın.

Ardından, üst kısımdaki Edinme ayarları altında XYZT Modu'nu seçin. Son olarak, GFP etiketli Anjiyotensin Tip 1A Reseptörünün lizozomlara hedeflenmesini gözlemlemek için tarama için zaman aralığını ve tarama süresini ayarlayın. Daha sonra ligand stimülasyonunu başlatmak için, görüntülenen kuyucuğa 100 X stok ligand çözeltisinden üç mikrolitre ekleyin ve yanıtı istenen süre ve frekans için 3D olarak görüntülemek için Başlat'a tıklayın.

Canlı hücre görüntülerini analiz etmek için uygun 3D görüntü niceleme yazılımını açın. Bu protokolde Velocity. Görüntü alanına sağ tıklayın ve Özellikler'i seçin.

Ligand tedavisine yanıt olarak GFP etiketli reseptör vezikülünü ve delik hücresi yoğunluklarını analiz etmek için bir ölçüm dizisi oluşturmak için uygun XY ve Z görüntü pikseli özelliklerini girin. 2D menüsü altında, hücreyi gözlemlemek için genişletilmiş odak modunu seçin. Ardından, hücrenin etrafına ilgi çekici bir bölge çizmek için serbest stil bölgesi aracını kullanın ve Seçime Kırp'ı seçmek için görüntüye sağ tıklayın.

Yeni bir görüntü öğesi oluşturulacaktır. Kırpılan hücre görüntüsünü seçmek için görüntü adına tıklayın ve ölçüm sekmesini açın. İçselleştirilmiş veziküllerin GFP ifadesini ölçmek için, Bul'dan Nesneleri Bul'u yukarıdaki dizi kutusuna sürükleyin.

Nesne bul kanalını GFP olarak ayarlayın ve en parlak GFP yoğunluklarına sahip nesneleri seçmek için eşiği standart sapmaya ve alt sınırı altıya ayarlamak için ayarlar simgesini açın. Minimum nesne boyutunu sıfır mikrometre küp olarak ayarlayın. Ardından, ölç'e tıklayın ve kanalları ve ölçüm türlerini seçin.

Tüm hücreyi tanımlamak için eşiklemeyi ve filtreleri tanımlamak ve toplam GFP yoğunluğunu ölçmek için ikinci bir Nesne Bul kutusunu sürükleyin. Ardından, Nesneleri Bul kanalını GFP olarak ayarlayın ve herhangi bir GFP yoğunluğuna ve minimum nesne boyutuna iki mikrometre küp olan nesneleri seçmek için standart sapmayı sıfıra ayarlayın. Filtre Popülasyonu'nu Popülasyon iki Nesne Bul kutusuna sürükleyin ve hücrenin tamamını seçmek ve tüm küçük nesneleri elemek için 100'den büyük bir mikrometre küp hacmi seçin.

Ardından, tüm zaman noktalarında ölçüm yapmak için ölçümleri ve Ölçüm Yap öğesini seçin. Veziküllerde ölçülen GFP ifadesini ve zaman içinde tüm hücreyi analiz etmek için, görüntü adının altındaki ölçüm öğesi dosya adına tıklayın. Toplam verilerden GFP ve veziküller için verileri çıkarmak için ham sekmeyi açın ve popülasyonu seçin.

Ardından, analiz edilen sekmeyi açın ve verilere sağ tıklayın, analizi seçin, ardından popülasyonu seçmek için analizi kısıtlayın. Tüm hücredeki GFP miktarını ölçmek için, her ikisini de popülasyon ikiye değiştirin. Bu Verileri Analiz Et ve Özetleyen altında, GFP renk kanalını topla'yı ve toplamı seçin.

Ardından, Verileri düzenleme ölçütü ve satır'ın altında zaman noktası'nı seçin. Lizozomlardaki GFP miktarına ilişkin verileri çıkarmak için, birinci popülasyon için Nesneleri Bul'da nesneleri bul kanalını kırmızı kanala ayarlayın. İletişim kutusundaki tekerlek simgesinde, kullanarak eşiği standart sapmaya, en parlak yoğunluklara sahip kırmızı nesneleri seçmek için alt sınırı altıya ve minimum nesne boyutunu 0,017 mikrometre küp olarak ayarlayın.

Ölçümleri seçin ve tüm zaman noktalarında ölçüm yapmak için ölçüm öğesi yapın. Lizozomlarda ölçülen GFP ekspresyonunu analiz etmek için, görüntü adının altındaki ölçüm öğesi dosya adına tıklayın. Ham sekmesi altında popülasyon bir'i seçin ve ardından popülasyon bir'i seçin ve analiz sekmesi altında GFP renk kanalını ve toplamını toplayın, kırmızı veziküllerdeki GFP miktarını ölçmek için daha önce olduğu gibi sağ tıklayın.

Ligand stimülasyonundan önce, GFP etiketli Anjiyotensin Tip 1A Reseptörleri ağırlıklı olarak plazma zarında lokalizedir. Ancak Anjiyotensin iki ilavesinden sonraki 2.5 dakika içinde, bu reseptörler içselleşir, parlak veziküller oluşturur ve daha sonra kümelenir ve büyük paranükleerzom vezikülleri oluşturur. Anjiyotensin iki kaynaklı fırfırlama, bu temsili GFP ekspresyonu ölçüm verileri için gözlemlendiği gibi toplam vezikül GFP yoğunluğunun ölçülmesini zorlaştırır.

Boyut filtreleme, daha büyük fırfırlar ve kümelenmiş veziküller arasında ayrım yapmaz, ancak daha küçük nesnelerdeki GFP'nin daha büyük nesnelerdeki GFP'den daha erken arttığını ortaya çıkarır. Otofokus olmadan GFP ekspresyonunun bu temsili zaman seyrinde, içselleştirilmiş GFP, toplam hücresel GFP yüzdesi olarak ölçüldü. Hücre içindeki toplam GFP'nin analizi, bu hücrenin zaman içinde kayda değer bir şekilde ağartıcı olmadığını ortaya koydu.

Transfekte edilmiş hücrelerin lizozomlarındaki GFP'nin miktar tayini, lizozomlar içinde bulunan Anjiyotensin Tip 1A Reseptörünün yoğunluğunun, Anjiyotensin iki uygulamasından sonra 24 dakikaya kadar değişmediğini de gösterir. Bu prosedür sırasında, görüntüleme öncesinde ve sırasında hücrelerin sağlığını izlemeyi hatırlamak önemlidir, çünkü prosedür zaman alıcıdır, hücre kültürleri herhangi bir şekilde anormal ise deney iptal edilmelidir. Bu prosedürü takiben, reseptörlerin hücre altı lokalizasyonunu tespit etmek ve doğrulamak için immün boyama ve FRET veya FLIM kullanılabilir.

Western blotları, reseptör kaçakçılığı sırasında yer alan sinyal moleküllerindeki kimlik ve değişiklikleri ele almak için yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, lizozomlara ve diğer hücre altı bölmelere yönelik ligand kaynaklı transmembran reseptörünü ölçmek için canlı hücre görüntüleme ve analizinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.