Name: Konfokal Mikroskobu kullanılarak Transfekte İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri Canlı Hücre Görüntüleme ve 3D Analiz Angiotensin Reseptör Tip 1a Ticareti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Öğrenin canlı hücre görüntüleme yöntemiyle anjiyotensin tip 1a reseptörlerinin endositozunu ve lizozomlarla birlikte yerleşimini insan embriyonik böbrek hücrelerinde gerçek zamanlı analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu yazıda sunulan araştırma çalışmaları Kathryn Sandberg hibe R01 HL121456-01A1 tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüleri P30-CA051008 tarafından finanse edilmektedir Georgetown Üniversitesi Tıp Merkezi&#39;nde Mikroskopi ve Görüntüleme Paylaşılan Kaynak (MISR) bir Leica SP8 Kelime Size Neyi Çağrıştırıyor kullanılabilirliği ile ek desteklenmiştir. Biz minnetle Leica SP8 görüntüleme Peter Johnson tarafından asistanlığı ve Carl Zeiss Mikroskopi LLC Alma Arnold tarafından sağlanan görüntüleme yardımı ile Georgetown Üniversitesi&#39;nde Thomas Coate, Biyoloji Bölümü laboratuarında Zeiss LSM880 kullanımını kabul. Bu yazıda içerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

<ol><li>Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+angiotensin+II+type+1A+receptor+intracellular+retention%2C+degradation%2C+and+recycling+by+Rab5%2C+Rab7%2C+and+Rab11+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases.</a> J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).</li>
<li>Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+trafficking+of+angiotensin+II+and+its+AT1+and+AT2+receptors%3A+evidence+for+selective+sorting+of+receptor+and+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand.</a> Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).</li>
<li>Hunyady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+PI+3-kinase+dependence+of+early+and+late+phases+of+recycling+of+the+internalized+AT1+angiotensin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor.</a> J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).</li>
<li>Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+endocytosis+of+angiotensin+II+in+rat+myometrial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells.</a> Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).</li>
<li>Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab4+and+Rab11+coordinately+regulate+the+recycling+of+angiotensin+II+type+I+receptor+as+demonstrated+by+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> J Biomed Opt. 13 (3), 031206(2008).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton-dependent+Rab+GTPase-regulated+angiotensin+type+I+receptor+lysosomal+degradation+studied+by+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> J Biomed Opt. 15 (5), 056003(2010).</li>
<li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycin+A1+prevents+maturation+of+autophagic+vacuoles+by+inhibiting+fusion+between+autophagosomes+and+lysosomes+in+rat+hepatoma+cell+line%2C+H-4-II-E+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells.</a> Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).</li>
<li>Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+angiotensin+II+activates+rat+myometrium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular angiotensin II activates rat myometrium.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).</li>
<li>Fortian, A., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+fluorescence+imaging+reveals+high+stoichiometry+of+Grb2+binding+to+the+EGF+receptor+sustained+during+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).</li>
<li>Aymerich, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+G-protein-coupled+receptor+imaging+to+understand+and+quantify+receptor+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22ScientificWorldJournal%22%5BJournal%5D)">Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics.</a> ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).</li>
<li>Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+Detection+of+Diversity+and+Bias+in+GPCR+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26(2014).</li>
<li>Inuzuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+ligand-induced+activation+of+angiotensin+II+type+1+receptor+signaling+by+the+type+2+receptor+via+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase.</a> C. Sci Rep. 6, 21613(2016).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+angiotensin+receptor+signaling+through+Erk1%2F2+pathway+by+a+novel+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li>
<li>Mueller, S. C., Hubbard, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+endocytosis+of+asialoglycoproteins+by+rat+hepatocytes%3A+receptor-positive+and+receptor-negative+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes.</a> J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).</li>
<li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nat Commun. 6, 7670(2015).</li>
<li>Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconversion+of+Lysotracker+Red+to+a+green+fluorescent+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule.</a> Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).</li>
<li>Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycin+A1%2C+a+specific+inhibitor+of+vacuolar-type+H%28%2B%29-ATPase%2C+inhibits+acidification+and+protein+degradation+in+lysosomes+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells.</a> J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Burada sunulan ön deneyler 24 dakika gibi kısa bir sürede boyunca, lizozomlar AT 1a R-GFP teslim kayda değer bir değişiklik meydana geldiğini göstermektedir. Genel olarak, lızozomlara içselleştirilmiş reseptörlerin teslim gibi erken 15-20 dakika olarak meydana gelebilir. Bu deney 1a R AT içselleştirilmiş toplu büyük perinükleer endozomlardan hedeflenmektedir hipotezi ile tutarlıdır. R lizozomlarında geldiğinde 1a AT en azından bazı Li ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir dai...

genel amacı, reseptör agonisti ile muamele edildikten sonra zaman ve belirli bir alt-hücresel organel reseptör ko alan sayısal kanıtı elde etmektir. Bu nedenle, burada acil hedefi zaman atlamalı konfokal lizozomlar görüntülerini ve insan embriyonik böbrek hücrelerinde reseptör (HEK) elde edildi reseptörün yayınlamak için 3 boyutlu görüntüleme verileri transfeksiyonu takiben ve daha sonra bir araya getirmek ve analiz kapsayan bir transmembran yakalamak için lizozomlar. transmembran reseptör fizyolojik ve patofizyolojik koşullarda nasıl düzenlendiği belirlemenize yardımcı olabilir reseptör ligandı tarafından aktive edildiğinde endositoz sırasında lizozomlar veya diğer organellerin yaptığı bir transmembran reseptör eşzamanlı kaçakçılığının soruşturulmasına. 1a R esas olarak HEK293 1 REC çoğunluğu, ancak örnek hücre sistemleri Ang II ile tedavi sonrası lizozomlar bozunabilen varsayılırligand Ang II kütle lizozom 2, 3, 4, 5 bozulmuş ise eptors özellikle plazma membran daha sonra geri dönüşüm için multiveziküler geri kazanım endozomlarda lokalizedir. Daha yakın zamanda, Li ve diğ. Förster rezonans enerji transferi (FRET) ve floresan süresi görüntüleme mikroskobu (FLIM) teknikleri kullanılarak ortaya AT 1a R colocalizes LAMP1 ile (~ 10 nM ölçekte) reseptörünün en azından bir kısmı için hedeflenen ve düşer düşündüren bir lizozomal membran proteini lizozomlarında 6 ile. Bu yazarlar lizozomal inhibitörü klorokin klorokin bir etkisi lizozomlarında ile geç endosomes veya autophagosomes füzyon engellemek için olduğunu düşündüren önceki raporlar ile uyumludur 1a R-LAMP1 dernek AT bloke ettiğini kaydetti. Diğer dolaylı yaklaşımlar 1a R l AT belirlemek içinlizozomlarda ocalization, lizozomlarda 3, 4, 5, 6, 7, 8 1a R varlığına anlaması için bir lızozomal inhibitörü bafilomisin kullanmışlardır. Canlı hücre görüntüleme hücre hacmi ve GFP kimerik reseptörün kaybı / karartma / yeniden dağılımı üzerindeki tespitin potansiyel etkilerini önler. Önceki çalışmalar, ko veya lizozomlar veya reseptör bağlayıcı suretlerle ile etiketlenmiş, canlı hücreleri kullanılarak reseptörün eş oluşumunu belirlemek için, sabit hücre bel bağlar β-arrestin 1, 2, 3, 4, 5, 6. dönen disk konfokal veya lazer noktası tarama conf kullanan diğer GPCRs Canlı hücre görüntülemeGaasp veya HYD dedektörleri ile donatılmış Öçal mikroskoplar 30 s aralıklarla 9, 10, z-yığınlarının görüntülü bireysel hücrelerin reseptör içselleştirilmesi ve ticaretini gözlemlemek için araştırmacılar sağladı. Canlı hücre z-yığınları hızla toplanır Ancak bile, analiz sadece 2D 10 yani her yığının içinde tek bir düzlemde seçimden sonra ortaya çıkabilir. Bu soru içselleştirilmiş GPCR veya tirozin kinaz reseptörü çalışmak için yeterli olabilir, AT 1a Rs zamanla boyutunu ve konumunu değiştirmek ve böylece doğal yeterli her zaman bir noktada temsili tek dilim kullanarak örnek daha zor kesecikler birikir. Iyice hücre yoluyla ve boyut ve konumda farklı veziküller her ICSI&#39;nin tespit etmek 1a R AT etiketli rota belirlemek için, 3D görüntüleme ve 3D analizi için bir yöntem bu değişiklikleri izlemek ve olmaya taktığı<html> Bu lizozomlar gibi çeşitli hücre içi bölmelerin etiketleme ile birlikte kullanılır. Müfettişler doğrudan hücre ve Ang II uyarımı aşağıdaki hücre içi bölmelere onun transferi içine AT 1a R hareketini görselleştirmek için canlı hücre görüntüleme için bu protokolü kullanabilirsiniz. Hücre içi bölmeleri floresan protein kuruntulardan ya da diğer floresan işaretleri ile etiketlenir. Bu protokol, aynı zamanda, vahşi tip reseptörlere karşı mutasyona karşılaştırma ya da farmakolojik tedavi aşağıdaki değişiklikleri tespit etmek için, 200 nm&#39;lik bir çözünürlüğü en az sub-hücresel organellerde reseptörleri lokalize bir ilk yaklaşım olarak kullanılabilir. Bu canlı hücre görüntüleme için donatılmış bir konfokal mikroskop gerçekleştirilebilir çünkü tekniğin erişilebilir. Bu yaklaşımın göreli kolaylığı, artan uzmanlık ve moleküler etkileşimleri 6 tespit FRET / flim / BRET teknikleri yürütmek için gerekli ekipman ile çelişmektedir&quot;xref&quot;&gt; 11. Bu ölçümler, yüksek çözünürlüklü (~ 10 nm) ve sub-hücresel organeller içerisinde lokalizasyonu anlaşılmaktadır protein-protein etkileşimlerini tanımlamaktadır. Bunlar daha ileri teknikler takip ve ileri moleküler ilgi etkileşimleri yerine hücre içi bölmeleri sayesinde reseptörlerin geçişini tanımlamak için kullanılır ve doğrudan hücreye 11 içinde belirli zamanlarda ve yerlerde protein-protein etkileşimleri göstermektedir. görüntü elde etme yavaş olduğu FLIM, alıcı konsantrasyonu bağımsız bir FRET tekniği, genellikle sabit bir numune üzerinde gerçekleştirilir. Buna karşılık, bu oran FRET hızlı görüntüleme ve etkileşim proteinlerin yüksek çözünürlüklü ko sağlar. Oran FRET dezavantajı görüntüleme widefield epi-floresan görüntüleme hız kazanmak ve düşük çözünürlükte ve organellerin 12 aksine sonuçlanan tüm hücre içerecek şekilde kullanmaktadır olduğunu. Biyoparlaklık rezonans enerji transferi (Bret) başka bir şeydirzaman 11 üzerinde moleküler yakınlığı edinilmesini ölçmek için GPCRs uygulanmıştır ileri tekniği. Bu teknikte, bir protein florofor moleküler bölünür ve her yarım, söz konusu iki proteinin birine bağlandı. Ne zaman faiz bağlama iki protein birbirlerine, kimerik etiketinin parçaları floresan ve zamanla sayısal artan floresan elde etmek monte yeniden. Burada, Ang II uyarımı ve Ang II uyarımı aşağıdaki lizozomlar için 1a R AT içselleştirilmiş teslim potansiyel değişim üzerine hücrede AT 1a R ticaretini incelemek için görüntü ölçümü ile birleştiğinde canlı hücre görüntüleme için basit bir teknik sunuyoruz. Bu teknik için nihai kullanımı yabani tip ve mutasyona uğramış reseptörleri karşılaştıran membran kaçakçılığı farklılıkları karakterize etmektir. Bu farklılıklar AT 1a R leadi fizyolojik faaliyetlerini mekanizmasını (ler) etkisini belirlemeye yardımcı olacaktırkan basıncının düzenlenmesi ng.

<table><tbody><tr><td>Anjiyotensin II (Ang II)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9525&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal ortamı (DMEM 1x)</td><td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td><td>11960-044</td><td>37 °C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin (Pen Strep)</td><td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>37 °C sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM (100x)</td><td>Gibco (yaşam teknolojileri)</td><td>25030-081</td><td>37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>İnsan Embriyonik Böbrek (HEK)-293 hücre</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)&nbsp;</td><td>CRL-1573</td><td>Geçit numarası 5 - 12</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II odacıklı 1.5 Alman Kapak Camı</td><td>Sistemi Sigma-Aldrich</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Store 4 & derece; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Opti-MEM, Azaltılmış Serum Ortamı</td><td>Gibco- ThermoFisher Scientific</td><td>31985-070</td><td>37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>PBS 10x&nbsp;</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3994 37</td><td>° C'de Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle ortamı (DMEM 1x)&nbsp;</td><td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td><td>31053-028</td><td>37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>LysoTracker Red DND-99</td><td>moleküler problar -ThermoFisher Scientific</td><td>L7528</td><td>Aliquotes'u karanlıkta -20 ° C'de saklayın; C .&nbsp;</td></tr><tr><td>Volocity Ver. 6.3 Görüntü Analiz yazılımı</td><td>PerkinElmer</td><td>Görselleştirme ve Kantitasyon Modülleri</td><td>Görüntü yığınlarının 3D görüntü analizi için</td></tr><tr><td>Leica SP8 AOBS</td><td>Leica Microsystems</td><td>lazer tarama konfokal mikroskop</td><td>Görüntü toplama için</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td><td>Carl Zeiss</td><td>lazer taramalı konfokal mikroskop</td><td>Görüntü toplama için</td></tr></tbody></table>

konfokal mikroskobu kullanılarak transfekte İnsan embriyonik böbrek hücreleri canlı hücre görüntüleme ve 3d analiz angiotensin reseptör tip 1a ticareti

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Canlı hücre görüntüleme aynı anda anjiotensin II (Ang II) ile uyarılmasını takiben transfekte insan embriyonik böbrek-293 (HEK) hücreleri anjiotensin tip 1a (1a R AT) reseptörleri ve hücre içi bölmelerin zaman atlamalı görüntü yakalamak için kullanılır. HEK hücreleri geçici plazmid DNA gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) ile etiketlenmiş 1a R AT içeren transfekte edilir. Lizozomlar kırmızı floresan boya ile tanımlanır. Canlı hücre görüntüleri Ang II uyarıldıktan sonra bir lazer tarama konfokal mikroskop yakalanan ve zamanla üç boyutlu (3D, vokseller) yazılım tarafından analiz edilir. Canlı hücre görüntüleme reseptör kaçakçılığı soruşturma sağlar ve tespit ile ilişkili boşa önler ve özellikle, EGFP etiketli membran reseptörlerinin kaybı veya artefactual deplasman. tek tek hücreler bir süre ile izlenir Böylece, reseptörlerin hücre içi lokalizasyonu görüntülenmiş ve ölçülebilir. Görüntüler sufficientl edinilmesi gerekiry hızla hızlı vezikül hareketini yakalamak için. Bununla birlikte, hızlı bir görüntüleme hızlarda toplandı, fotonların sayısı azalır. Uzlaşmalar da görüntüleme hız kazanmak amacıyla voksel boyutu gibi görüntüleme parametrelerinin seçimi yapılmalıdır. canlı hücre görüntüleme önemli uygulamaları ama bir kaç isim protein kaçakçılığı, göç, çoğalmasını, hücre döngüsü, apoptoz, otofaji ve protein-protein etkileşimleri ve dinamiklerini incelemek için vardır.

Bu deney Örnek setinde, HEK hücreleri pEGFP-N2 plazmit 13 klonlanmıştır (1a R-GFP AT) anjiyotensin tip 1a reseptör yapısı (E1,2,3-1A R) ile transfekte edildi. HEK Time-lapse görüntüleri elde ve bir film (Canlı Hücre Görüntüleme 1 ve Canlı Hücre Görüntüleme 2 film bakınız) olarak çalındı. Film ve fotoğraf ligand uyarılmasından sonra, 1a AT R-EGFPs plazma membranında lokalize olduğunu gösteriyor, fak...

Burada anjiotensin II tedavi tarafından başlatılan endositoz sırasında yeşil flüoresan protein etiketli anjiotensin tip 1a reseptörlerini eksprese görüntü hücrelere bir protokol mevcut. Bu teknik, zaman içinde, üç boyutlu olarak reseptör ve lizozom ko-lokalizasyonunu analiz yazılımı kullanılarak daha sonra etiket, ikinci bir fluoresan işaretleyici ile lizozomlar ve benzerini kapsamaktadır.

Konfokal Mikroskobu kullanılarak Transfekte İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri Canlı Hücre Görüntüleme ve 3D Analiz Angiotensin Reseptör Tip 1a Ticareti

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Bu deneyin genel amacı, Anjiyotensin iki tedavisi sonrası Anjiyotensin tip bir reseptör ile lizozomun kolokalizasyonuna dair kantitatif mekansal ve zamansal kanıtlar elde etmektir. Bu yöntem, ligand stimülasyonuna yanıt olarak meydana gelen internalizasyon sürecinde, Y tipi reseptörler ile mutant reseptörlerin hücre altı işlenişindeki farklılıkları tespit etmek için tasarlanmıştır. Bu tekniğin avantajları; canlı hücre görüntülemenin, fikse edilmiş ve deterjanla permeabilize edilmiş hücrelerden kaynaklanan artefaktları ortadan kaldırması ve reseptör lokalizasyonundaki dinamik değişikliklerin gerçek zamanlı olarak değerlendirilebilmesidir.Uygun bir 1.4 sayısal açıklıklı objektif seçerek ve objektifi mikroskop tablasının üzerinde merkezleyerek başlayın. Objektifin üzerine bir damla yüksek viskoziteli, düşük oto floresanslı imersiyon yağı ekleyin ve transfekte edilmiş hücrelerin bulunduğu hazneyi mikroskop tablasına yerleştirin. Yağ, ilk lamın altına değene kadar objektifi nazikçe yükseltin ve sönük hücreleri bulun.Görüş alanının merkezinde sağlıklı bir hedef hücre varken, konfokal moda geçin ve hücrenin, ventral tarafı lamıla yakın şekilde konumlanmış olarak iyi yayıldığını doğrulayın. Z Stack iletişim kutusunu açın, Live seçeneğine tıklayın, hücrenin üst kısmına odaklanın ve ardından Begin seçeneğine tıklayın. Sonra hücrenin alt kısmına odaklanın, Z adım boyutu olarak 1.00 micrometer değerini girin ve ardından End seçeneğine tıklayın.Ardından, üst kısımdaki Acquisition ayarları altından XYZT Modunu seçin. Son olarak, GFP etiketli Anjiyotensin Tip 1A Reseptörünün lizozomları hedeflemesini gözlemlemek için tarama zaman aralığını ve tarama süresini ayarlayın. Daha sonra ligand stimülasyonuna başlamak için, görüntülenen kuyucuğa 100 X ligand stok çözeltisinden üç mikrolitre ekleyin ve yanıtı istenen süre ve frekansta 3B olarak görüntülemek için Start'a tıklayın.Canlı hücre görüntülerini analiz etmek için uygun 3D görüntü nicelik belirleme yazılımını açın. Bu protokolde Velocity kullanılmıştır. Görüntü alanına sağ tıklayın ve Özellikler'i seçin.GFP etiketli reseptör vezikülünü ve ligand uygulamasına yanıt olarak tüm hücre yoğunluklarını analiz etmek için bir ölçüm dizisi oluşturmak üzere uygun XY ve Z görüntü piksel özelliklerini girin. 2D menüsü altında, hücreyi gözlemlemek için genişletilmiş odak modunu seçin. Ardından, hücre etrafında bir ilgi alanı çizmek için serbest stil bölge aracını kullanın ve seçimi kırpmak için görüntüye sağ tıklayarak Seçime Göre Kırp'ı seçin.Yeni bir görüntü öğesi oluşturulacaktır. Kırpılmış hücre görüntüsünü seçmek ve ölçüm sekmesini açmak için görüntü adına tıklayın. İçselleştirilmiş veziküllerin GFP ekspresyonunu ölçmek için, Finding kısmındaki Find Objects öğesini yukarıdaki sekans kutusuna sürükleyin.Nesneleri bulma kanalını GFP olarak ayarlayın ve standart sapmayı kullanarak eşik değerini belirlemek ve en parlak GFP yoğunluklarına sahip nesneleri seçmek için alt sınırı altı olarak ayarlamak üzere ayarlar simgesini açın. Minimum nesne boyutunu sıfır mikrometre küp olarak ayarlayın. Ardından, ölç butonuna tıklayarak kanalları ve ölçüm türlerini seçin.Tüm hücreyi tanımlamak için eşik değerini ve filtreleri belirlemek ve toplam GFP yoğunluğunu ölçmek için ikinci bir Find Objects kutusunu sürükleyin. Ardından, herhangi bir GFP yoğunluğuna sahip nesneleri seçmek için Find Objects kanalını GFP olarak ayarlayın, standart sapmayı sıfıra ve minimum nesne boyutunu iki µm³'e ayarlayın. Tüm hücreyi seçmek ve daha küçük tüm nesneleri elemek için Filter Population'ı Population two Find Objects kutusuna sürükleyin ve 100 µm³'ten büyük bir hacim seçin.Ardından, tüm zaman noktalarında ölçüm yapmak için ölçümleri ve Ölçüm Yap öğesini seçin. Veziküllerdeki ve tüm hücredeki ölçülen GFP ekspresyonunu zaman içinde analiz etmek için, görüntü adının altındaki ölçüm öğesi dosya adına tıklayın. Toplam veriler arasından GFP ve veziküllere ait verileri ayıklamak için ham veri sekmesini açın ve birinci popülasyonu seçin.Ardından, analiz edilen sekmesini açın ve verilere sağ tıklayarak analysis seçeneğini, ardından popülasyon birini seçmek için restricting analysis seçeneğini belirleyin. Tüm hücredeki GFP miktarını ölçmek için her ikisini de popülasyon iki olarak değiştirin. Analyze These Data ve Summarized By başlıkları altında, sum GFP color channel ve sum seçeneklerini belirleyin.Ardından, "Organize the data by" (Verileri şuna göre düzenle) altındaki "row" (satır) kısmından "time point" (zaman noktası) seçeneğini belirleyin. Lizozomlardaki GFP miktarını belirlemek için "Find Objects" (Nesneleri Bul) kısmındaki birinci popülasyonda, "find objects channel" (nesneleri bulma kanalı) seçeneğini kırmızı kanala ayarlayın. Diyalog kutusundaki çark simgesinde, en parlak yoğunluğa sahip kırmızı nesneleri seçmek için "threshold using" (eşik belirleme) kısmını "standard deviation" (standart sapma) olarak, "lower limit" (alt sınır) değerini altı olarak ve "minimum object size" (minimum nesne boyutu) değerini 0,017 micrometers cubed olarak ayarlayın.Ölçümleri seçin ve tüm zaman noktalarında ölçüm yapmak için bir ölçüm öğesi oluşturun. Lizozomlardaki ölçülen GFP ekspresyonunu analiz etmek için görüntü adının altındaki ölçüm öğesi dosya adına tıklayın. Ham sekmesi altında birinci popülasyonu seçin ve ardından analiz sekmesi altında birinci popülasyonu, toplam GFP renk kanalını ve toplamı seçerek, kırmızı veziküllerdeki GFP miktarını ölçmek için daha önce yaptığınız gibi sağ tıklayın.Ligand stimülasyonundan önce, GFP etiketli Anjiyotensin Tip 1A Reseptörleri ağırlıklı olarak plazma membranında lokalizedir. Ancak, Anjiyotensin iki ilavesinden sonraki 2,5 dakika içinde, bu reseptörler internalize olarak parlak veziküller oluşturur ve daha sonra kümelenerek geniş paranükleer zom veziküllere dönüşür. Bu temsilci GFP ekspresyon ölçüm verilerinde gözlemlendiği üzere, Anjiyotensin iki tarafından indüklenen ruffling (hücre yüzeyinde kıvrımlanma), toplam vezikül GFP yoğunluğunun kantifikasyonunu karmaşıklaştırmaktadır.Boyut filtreleme, daha büyük fırfırlar ile kümelenmiş veziküller arasında ayrım yapmaz, ancak küçük nesnelerdeki GFP'nin, büyük nesnelerdeki GFP'den daha erken arttığını ortaya koyar. Otomatik odaklama olmadan gerçekleştirilen GFP ekspresyonunun bu temsili zaman seyrinde, internalize olan GFP, toplam hücresel GFP'nin yüzdesi olarak ölçülmüştü. Hücre içindeki toplam GFP'nin analizi, bu hücrenin zamanla belirgin bir fotobeyazlamaya uğramadığını göstermiştir.Transfekte edilmiş hücrelerin lizozomlarındaki GFP miktarının belirlenmesi, Angiotensin Tip 1A Reseptörünün lizozomlar içindeki yoğunluğunun, Angiotensin iki uygulamasından sonraki 24 dakikaya kadar değişmediğini göstermektedir. Bu prosedür sırasında, işlemin zaman alıcı olması nedeniyle, görüntüleme öncesinde ve sırasında hücrelerin sağlığının izlenmesi gerektiğini unutmamak önemlidir; hücre kültürlerinde herhangi bir anormallik görülmesi durumunda deney sonlandırılmalıdır. Bu prosedürün ardından, reseptörlerin hücre içi lokalizasyonunu tespit etmek ve doğrulamak için immünboyama ve FRET veya FLIM kullanılabilir.Reseptör taşınması sırasında yer alan sinyal moleküllerinin kimliğini ve değişimlerini belirlemek için Western blot analizleri yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, ligand tarafından tetiklenen transmembran reseptörlerin lizozomlara ve diğer hücre altı bölmelere yönelimini ölçmek için canlı hücre görüntülemesinin ve analizinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.

live-cell-imaging-3d-analysis-angiotensin-receptor-type-1a

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yetişkin, kardiyak miyositler hayvan kalpleri izole edilebilir ve birkaç gün kültüre temel hücrelerdir. Bu kültür süre içinde adenoviral gen transferi, genetik olarak kodlanmış biyosensörler (GEBs) ya da floresan füzyon proteinleri ifade etmek için kullanılır. Her iki yaklaşım konfokal mikroskobi ile hücresel soruşturma izin verir.

Konfokal Görüntüleme İzolasyon ve Yetişkin kardiyak miyositler Genetik Manipülasyon

Bu protokol bir FRET tabanlı yakınlık tahlil kullanarak nasıl görüntü protein-protein etkileşimleri açıklar.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Bu yazıda, özel ligandlar lökositlerin kemotaktik yanıt belirlemek ve hücre yüzey reseptörleri ve sitozolik proteinler canlı hücre görüntüleme teknikleri kullanarak arasındaki etkileşimleri tanımlamak için metodolojiyi tanımlamaktadır.

Lökotrien B Gerçek zamanlı görüntüleme 4 Hücre aracılığı ile Göç ve β-arrestin BLT1 Etkileşimleri

Hücre göçü gibi hücresel süreçleri, geleneksel iki boyutlu, sert plastik yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Bu rapor doğrudan protein lokalizasyon görselleştirme ve daha fizyolojik ilgili üç boyutlu bir matris içinde göç eden hücrelerin protein dinamiklerini analiz etmek için bir teknik anlatılmaktadır.

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Gerçek zamanlı görüntüleme embriyonik doku uzun süre boyunca meydan okuyor. Burada yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip uzun süre civciv omurilik hücresel ve alt hücresel değişikliklerin izlenmesi için bir test sunuyoruz. Bu teknik, sinir sistemi ve geliştirme embriyo diğer bölgeleri için adapte edilebilir.

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

Biz tek hücrelerin üç boyutlu konfokal floresans alınan tanımsız bir şekil morfolojisi değişiklikleri ölçmek için Imaris Nörobilim, ImarisXT ve MATLAB kullanan bir yazılım platformu geliştirdi. Bu yeni yaklaşım, reseptör aktivasyonunu takiben hücre şekli değişiklikleri ölçmek için kullanılır ve bu nedenle ilaç keşfi için olası ek bir araç temsil edilebilir.

Üç boyutlu Floresans Images Hücresel Morfoloji Değişiklikleri rakamlarla Analitik Aracı

Biz canlı hücre konfokal görüntüleme vasıtasıyla, endoplazmik retikulum (ER) içerisinde yerleşik transfekte floresan protein dağılımı ve hareketliliği incelemek için kullanılan görüntüleme yaklaşımı tarif eder. Biz de ultrastruktural bu subselüler bölmesinin mimarisi üzerine kendi ifade etkisini analiz.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

Bu protokol, konfokal eğirme disk mikroskobu kullanılarak lentiviral ve adenoviral transdüksiyonu takiben primer sıçan neonatal kardiyomiyositleri kullanılarak canlı hücre görüntüleme yöntemini tanımlar. Bu, canlı kardiyomiyositlerde hücresel süreçlerin ayrıntılı gözlemlerini sağlar.

İlköğretim Rat Yenidoğan kardiyomiyositlerin Canlı Hücre Görüntüleme Adenoviral izlenerek ve Lentiviral İletimi Confocal Disk Mikroskopi Spinning kullanma

Hücre nakli, hücre iskeleti etiketleme ve fonksiyon kaybı/kazanımı yaklaşımlarını birleştiren bu protokol, göç eden zebra balığı prospektif prekordal plağın, in vivo hücre göçünde bir aday genin işlevini analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Bu makalede, tanımlamak ve hücre içi boyama ile fare böbrek, aort ve lenf düğümleri içinde mevcut fonksiyonel T lenfosit alt grupları ölçmek ve akım sitometri ayrıntılı bir metodoloji sağlar. anjiotensin II hipertansiyon modeli açıklamak adım-adım, usul ve flow sitometri temel ilkelerine ve hücre içi boyama seçildi.

Hücre içi Boyama ve Sitometrisi Hipertansiyon Modelinde Fare Aort, Böbrek ve Lenf düğümleri içinde lenfosit alt tanımak

Bu el yazması transgenik muhabir fare kullanımı ve bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu değerlendirmek için kan damarlarının intravital video mikroskobu kullanılarak Anjiyotensin II kaynaklı hipertansiyonda floresan boyalar farklı yönetim yollarını açıklar ve onların yetenek rulo ve endotel için uygun.

Lökosit haddeleme ve yapışma Anjiyotensin II-infüzyon farelerde görselleştirme: teknikleri ve Püf noktalar

Öğrenin canlı hücre görüntüleme yöntemiyle anjiyotensin tip 1a reseptörlerinin endositozunu ve lizozomlarla birlikte yerleşimini insan embriyonik böbrek hücrelerinde gerçek zamanlı analiz edin.

Konfokal Mikroskobu kullanılarak Transfekte İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri Canlı Hücre Görüntüleme ve 3D Analiz Angiotensin Reseptör Tip 1a Ticareti (Video) | JoVE Journal

Konfokal Mikroskobu kullanılarak Transfekte İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri Canlı Hücre Görüntüleme ve 3D Analiz Angiotensin Reseptör Tip 1a Ticareti

Daha fazla video keşfet