Sıvı Kristal Nanopartikül Carrier bir Hidrofobik Kargo Encapsulated, hedeflenen Plazma Zarı Teslimat

Bu deneysel prosedürün genel amacı, canlı memeli hücrelerinin plazma zarının lipofilik kısmına kontrollü bir hidrofobik dicargo'nun verilmesi için bir dağıtım platformu olarak sıvı kristal bazlı bir nanoparçacık kullanmaktır. Bu yöntem, suda az çözünür hidrofobik kargoların teslimatının ve hücresel alımının nasıl verimli bir şekilde sağlanacağı gibi ilaç dağıtım alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, membran hedefli hidrofobik kargoların, azaltılmış sitotoksisiteleri ile birlikte plazma membranına daha spesifik bir şekilde verilmesine izin vermesidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora sonrası olan Dr.Okhil Nag olacak. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi DiO sıvı kristal nanopartikülünün hazırlanmasıyla başlayın. Daha sonra, HEPES tamponundaki 1.0 milileter DiO sıvı kristal nanopartikülüne 20 mikrolitre taze hazırlanmış çalışma NHSS / EDC çözeltisi ekleyin.

Ve beş dakika karıştırın. Daha sonra, bu karışıma 20 mikrolitre bir kolesterol PEG amin stok çözeltisi ekleyin ve iki saat karıştırın. İki saat sonra, bir masa üstü mini santrifüj kullanarak reaksiyon karışımını 30 saniye boyunca maksimum hızda kısaca santrifüjleyin.

Daha sonra süpernatanı, Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini ile dengelenmiş bir PD 10 boyutlu dışlama kromatografi kolonundan geçirin. Jel elektroforezi ile PEG kolesterolün DiO sıvı kristal nanopartikül yüzeyine başarılı kovalent konjugasyonunu doğrulamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi bir agaroz jeli hazırlayın. Jel katılaştıktan sonra, jeli hazneye daldırmak için yeterli miktarda TBE çalıştırma tamponu ekleyin.

Daha sonra, jelin kuyucuklarına 35 mikroleter DiO sıvı kristal nanopartikül numunesi ekleyin ve 110 voltluk bir voltajda 20 dakika çalıştırın. Jeli, 488 nanometrede uyarma filtresine ve 500 ila 550 nanometre emisyon filtrelerine sahip bir jel görüntüleme sistemi kullanarak görüntüleyin. 35 milimetre çapında 14 milimetre bir numaralı kapak camı ekleri ile donatılmış doku kültürü kaplarını, 37 santigrat derecede iki saat boyunca DPBS'de sığır fibronektini ile kaplayarak hazırlayın.

İki saat sonra, fibronektin kaplama solüsyonunu kültür kabından çıkarın. HEK 293 T17 hücrelerini, önce hücre tek tabakasını üç mililitre DPBS ile yıkayarak ve ardından iki mililitre tripsin EDTA ekleyerek T25 şişesinden hasat edin. Şişeyi 37 santigrat derecede yaklaşık üç dakika inkübe edin.

Hücreler şişeden ayrıldıktan sonra, şişeye dört mililitre tam ortam ekleyerek tripsini nötralize edin. Süspansiyondaki hücre konsantrasyonunu, bunları bir hücre sayacında sayarak belirleyin. Daha sonra hücre konsantrasyonunu, büyüme ortamı ile mililitre başına yaklaşık 80.000 hücreye ayarlayın.

Tabağa üç mililitre hücre süspansiyonu ekleyin ve gece boyunca inkübatörde kültürleyin. Ertesi gün, hücreler yaklaşık yüzde 70 oranında birleşmiş ve kullanıma hazır olmalıdır. Yeterli hücre yoğunluğu, yüksek hücre yüzdesinin sağlam ve verimli bir şekilde etiketlenmesi için kritik öneme sahiptir.

İlgili stok çözeltilerini seyrelterek dağıtım ortamında bir mililitrelik DiO, DiO sıvı kristal nanoparçacık ve DiO sıvı kristal nanoparçacık PEG kolesterol çözeltileri hazırlayın. Serolojik bir pipet kullanarak büyüme ortamını kültür kaplarından çıkarın ve hücre tek katmanlarını HEPES DMEM ile iki kez yıkayın. Bulaşıkların kenarına nazikçe HEPES DMEM eklemek için bir pipet kullanarak yıkamaları gerçekleştirin ve ardından çıkarın.

Hazırlanan DiO içermeyen veya DiO sıvı kristal nanopartikül dağıtım solüsyonlarından 0.2 mililitre kültür kaplarının merkezine ekleyin. Daha sonra bulaşıkları uygun bir süre için inkübatöre geri koyun. Daha uzun inkübasyon süreleri, zar olmayan alanların spesifik olmayan hücresel etiketlenmesine yol açar.

Kuluçka süresinden sonra, serolojik bir pipet kullanarak dağıtım solüsyonlarını çıkarın. Hücre tek katmanlarını DPBS ile iki kez yıkayın, her yıkama için iki mililitre kullanın. Hücre tek katmanlarını oda sıcaklığında 15 dakika boyunca yüzde dört paraformaldehit kullanarak sabitleyin.

Paraformaldehit çözeltisini bir pipet kullanarak çıkarın ve hücreleri iki mililitre DPBS ile bir kez nazikçe yıkayın. Artık sabit hücreler, konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak zarlı bir floresan sinyalinin varlığı için görüntülenmeye hazırdır. Isıtılmış bir inkübasyon odası ile donatılmış bir mikroskop sahnesinde, membran etiketlemesini değerlendirmek için konfokal bir mikroskop kullanarak canlı hücre örneğini görüntüleyin.

Görüntüleme hemen yapılmazsa, ortamı yüzde 0,05 sodyum azid içeren DPBS ile değiştirin ve bulaşıkları dört santigrat derecede saklayın. Bu yöntemde, hücreler bir FRET donörü olarak DiO ve bir FRET alıcısı olarak DiI ile birlikte etiketlenir. Satışları DiO, sıvı, kristal, nanopartikül, PEG, kolesterol ve daha önce olduğu gibi DiI içermeyen sırayla etiketleyin.

Boyamadan sonra, hücreleri serolojik bir pipet kullanarak iki mililitre DPBS ile bir kez yıkayın ve iki mililitre canlı hücre görüntüleme solüsyonu ile değiştirin. Isıtılmış bir inkübasyon odası ile donatılmış bir mikroskop sahnesinde, canlı hücre örneğini FRET görüntülemeli bir konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin. DiO donörünü 488 nanometrede uyararak ve 32 kanallı bir spektral dedektör ile hem DiO donörünün hem de DiI alıcısının tam emisyon spektrumlarını 490 ila 700 nanometre arasında toplayarak deneyi dört saatlik bir süre boyunca 30 dakikalık aralıklarla yapılandırın.

Ardından, DiO sıvı kristal nanopartikül PEG kolesterol ve DiI ile boyanmış hücrelerden hem DiO donörünün hem de DiI alıcısının zamanla çözülen emisyon yoğunluğunu belirleyin. Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi görüntüler için zaman çözümlü alıcı donör FRET oranını hesaplayın. Serbest DiO, dilabelli bir zar fosfolipidi ile karşı boyanmış hücrelerin plazma zarlarından ziyade, hücre içinde spesifik olmayan bir şekilde birikir

Bu, birleştirilmiş görüntülerle görselleştirilebilir. Tersine, DiO sıvı kristal nanopartikül PEG kolesterol, dilabelli membran fosfolipidi ile kolokalizasyon ile görselleştirildiği gibi, hücrenin sadece plazma zarını spesifik olarak etiketler. FRET, DiO donöründen DiI alıcısına enerji transferinde gözlenen bir artış yoluyla sıvı kristal nanopartikülden membran lipid çift tabakasına diyopartisyonu doğrular.

DiO ve DiI arasındaki FRET ile DiO ve DiI emisyon değişiklikleri, zamanın bir fonksiyonu olarak DiO'dan DiI'ye artan FRET'i doğrular. DiO sıvı kristal nanopartikül PEG kolesterol nanopartikülleri, yaklaşık yüzde 50 canlılıkta serbest DiO için önemli toksisiteye kıyasla, yüzde 90 canlılıkta minimum sitotoksisite sergiler. Bu videoyu izledikten sonra, kargo yüklü sıvı kristal nanopartiküllerin nasıl sentezleneceğini, hücresel hedefleme için biyoişlevsel hale getirileceğini ve başarılı hücresel teslimat için kargo yüklü hücrelerin nasıl görüntüleneceğini iyi anlamış olmalısınız.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir, çünkü DiO'nun sulu çözeltiden plazma zarına spesifik olarak verilmesi önemli bir zorluktur. Bu yöntem için ilk olarak, antikanser ilacı doksorubisin'in hücresel iletimi için sıvı kristal nanopartikül platformunu kullandıktan ve ilacın hücresel alım kinetiğini modüle etme yeteneğini gördükten sonra aklımıza geldi. Bu prosedürü takiben, bu yaklaşım, sulu ortamdan hücrelere iletilmesi açısından özel bir zorluk teşkil eden çok çeşitli hidrofobik kargoların hücresel iletimi için uygulanabilir.

Bu yaklaşım, beyin görüntüleme için voltaja duyarlı boyalar veya fotonik yardımlı ilaç tedavisi için fotodinamik ilaçlar gibi membran hedefli ilaçların ve biyoaktif moleküllerin daha verimli bir şekilde verilmesini sağlamak için kullanılabilir.