Name: Sıvı Kristal Nanopartikül Carrier bir Hidrofobik Kargo Encapsulated, hedeflenen Plazma Zarı Teslimat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Öğrenin sıvı kristal nanopartiküllerle hidrofobik kargo teslimatını. Bu yöntem, canlı memeli hücrelerinin plazma zarına hedeflenen ilaç iletimini artırır ve sitotoksisiteyi azaltır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma NRL Bankası Fonlama Programı (Çalışma Birimi MA041-06-41-4943) tarafından desteklenmiştir. ON Ulusal Araştırma Konseyi Doktora Sonrası Araştırma Associateship tarafından desteklenmektedir.

Dio-LCNP ve Dio-LCNP-PEG-Chol 1. Hazırlık <ol><li> sıvı kristalin diakrilat çapraz bağlama maddesi (DACTP11, 45 mg) içinde çözülür, 3,3&#39;-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO, 2 mg) ve 2 ml kloroform içinde polimerizasyonu için bir serbest radikal başlatıcı (azobisizobütironitril, 1 mg) eklenmiştir. akrilat işlevselleştirilmiş yüzey aktif maddenin bir sulu çözelti (AC10COONa, 7 ml, 13 mg), bu ekleyin. </li><li> su içinde polimerize yüzey ile çevrili bir organik malzemenin küçük damlacıklar içeren bir miniemulsion üretilmesi için 5 dakika için% 80 genlik de 1 saat süreyle karışımın sonikasyon karıştırın. </li><li> Bir yağ banyosu içinde 64 ° C&#39;ye ısıtın karışımı Kloroform yavaş yüzey aktif madde ile stabilize edilmiş olan bir DIO-ihtiva eden NP süspansiyon bırakarak buharlaştıkça çapraz bağlama maddesi ve yüzey aktif madde hem de polimerizasyonunu başlatmak için. </li><li> bir toplama ayrılması için bir 0.2 mikron bir şırınga filtreden geçirilmiştir NP süspansiyon (3 kez) filtre. Stosonraki kullanıma kadar 4 ° C sıcaklıkta filtre edildi NP çözelti yeniden. </li><li> EDC bağlantı yoluyla Dio-LCNP PEG-Chol çekimi. <ol><li> Kol-PEG-NH2 çözülür · 25 mM HEPES tampon maddesi (pH 7.0) içerisinde HCI (PEG-kol, 0.9 mM). </li><li> N-hidroksi-sülfosukkinimid sodyum tuzu (NHSS, 40 mM) ve konsantre stok çözeltilerinden HEPES tampon maddesi içinde 1-etil-3- (3- (dimetilamino) -propil) karbodiimid hidroklorür (EDC, 400 mM) ihtiva eden bir çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> Hemen HEPES tamponunda DIO-LCNP ve 1.0 ml NHSS / EDC yeni hazırlanmış çalışma çözeltisinin 20 ul ekle ve 5 dakika karıştırın. </li><li> Bu karışıma, kol-PEG-NH2 HCI stok çözeltisi 20 ul ilave edin ve 2 saat karıştırın. </li><li> Kısaca, bir masa üstü santrifüj kullanılarak küçük ile dengelenmiş bir PD-10 ebat eksklüzyon kromatografi kolonundan 13 süpernatanın geçen 30 saniye için maksimum hızda (~ 2.000 x g), reaksiyon karışımı santrifüjDulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS, 0.1X). </li></ol></li></ol> Dio-LCNP ve Dio-LCNP-PEG-Chol 2. Karakterizasyonu <ol><li> Jel elektroforezi ile Dio-LCNP yüzeye PEG-Chol başarılı kovalent çekimlerini onaylayın. <ol><li> (; 89 mM Tris (pH 7.6), 89 mM borik asit, 2 mM EDTA, TBE) tampon maddesi 50 tris-borat elektroforezinin ml (1 x) &#39;de agaroz 0.5 g çözündürülür. agaroz çözmek için bir mikrodalga fırında çözüm ısıtın. Çözelti biraz soğumasını ve elektroforez kutusuna bir jel tabakası içine içeriğini dökün izin verin. numune kuyuları oluşturmak için bir jel tarağı yerleştirin. </li><li> Jel katılaşmış sonra, bölmeye çalışan tampon TBE içinde (bölme jel daldırın kadar) gerekli miktarda ilave edin. </li><li> DIO-LCNP örnek 35 ul ekle jel oyuklarına 110 V&#39;luk bir gerilim 20 dakika boyunca çalışması (% 5 hacim / hacim gliserol ile değişik) </li><li> Görüntü jel görüntüleme sistemi wi kullanarak jelinci uyarılma ve radyasyon filtreleri, sırasıyla 488 nm ve 500-550 nm&#39;de. </li></ol></li><li> PBS içinde DIO-LCNP çözeltisi (~ 200-kat seyreltme) (pH-8, 0.1X) seyreltilmesi ve DLS cihazının 14 ölçüm dinamik ışık saçılımı (DLS) ile partikül ebadı ve dağılımı değerlendirilmesi. Uygun bir zeta potansiyeli ölçüm aleti kullanılarak Dio-LCNPs zeta-potansiyelini ölçün. </li></ol> Teslim Deney ve Görüntüleme Hücre Kültürü Yemekleri 3. hazırlanması Not: DIO-LCNP markalama daha önce tarif edildiği gibi 4 kültürlenir HEK 293T (geçitler 5 ile 15 arasında) / 17, insan embriyonik böbrek hücreleri üzerinde gerçekleştirilir. aktarma deneyleri ve aşağıda tarif edildiği gibi daha sonra hücre görüntüleme gerçekleştirin. <ol><li> 20 ug konsantrasyonunda ~ sığır fibronektin (ile kaplanarak 100 ul (14 mm No 1 coverglass uçlar ile donatılmış) 35 mm çapında bir doku kültür tabakları hazırlanması37 ° C&#39;de 2 saat boyunca DPBS / ml). </li><li> kültür çanak fibronektin kaplama çözüm çıkarın. Hasat HEK İlk yıkama T-25 balonuna 293 T1 / 7 hücreleri DPBS 3 ml ve daha sonra tripsin-EDTA (% 0.5 tripsin,% 0.25 EDTA) 2 ml eklenerek hücre tekli-tabakası. </li><li> ~ 3 dakika için 37 ° C &#39;de balon inkübe edin. tripsin-EDTA çıkarın ve inkübatör şişeyi geri dönün. Hücreler şişeden ayrıldıktan sonra, tam bir ortamda 4 ml ekleyerek tripsin nötralize şişeye (; DMEM Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı,% 10 fetal sığır serumu,% 5 sodyum piruvat ve% 5 antibiyotik / antimikotik içeren değiştirilmiş) . hücre sayacında sayarak göre süspansiyon içindeki hücre konsantrasyonunu saptamak. </li><li> Büyüme ortamı ile yaklaşık 8 x 10 4 hücre / ml hücre yoğunluğu ayarlayın. Gece boyunca kuluçka makinesi içinde çanak ve kültür hücre süspansiyonu 3 ml ilave edilir Sonraki gün, hücreler,% 70 ortak akışkanlığa olmalıdır ve kullanıma hazır olması gerekir. YeterliHücre yoğunluğu, hücrelerin yüksek oranda sağlam ve etkili bir etiketleme için kritik önem taşır. </li></ol> 4. Hücresel Dio ve Dio-LCNPs teslimi ve Sabit Hücre Görüntüleme <ol><li> Teslimat ortamında Dio, Dio-LCNP ve Dio-LCNP-PEG-Chol 1 ml çözümleri hazırlayın (HEPES-DMEM; DMEM 25 mM HEPES içeren) Dio ücretsiz ve Dio-LCNPs stok çözümleri seyreltilmesi ile; hücreler üzerindeki inkübasyon için uygun Dio konsantrasyonları (DIO DIO-LCNP şeklinde serbest veya Dio konsantrasyonu ya da ifade edilir) ~ 1-10 mcM olacaktır. </li><li> serolojik bir pipet kullanılarak kültür kaplarından büyüme ortamı çıkarın ve hücre tek tabakaları yıkama HEPES-DMEM (her biri 2 ml yıkama) ile iki kez (adım 3). yavaşça ekleme ve yemekler kenarından için / bir pipet kullanarak HEPES-DMEM kaldırarak yıkar gerçekleştirin. </li><li> Kültür kaplarına merkezine hazırlanan Dio ücretsiz veya Dio-LCNP teslim çözümleri 0.2 ml ekleyin ve i yemekler dönmekncubator uygun bir zaman süresi (deney ihtiyaçlarına bağlı olarak, tipik olarak 15 ya da 30 dakika) için. Daha uzun inkübasyon süreleri olmayan membranöz alanlarda daha nonspesifik hücresel etiketleme (örneğin, sitosol) ekleyin. </li><li> Kuluçka döneminden sonra, serolojik bir pipet kullanarak dağıtım çözümleri çıkarın. DPBS (2 ml her yıkama) ile hücre tekli iki kez yıkayın. yavaşça yemeğin kenarından / &#39;e DPBS ekleyerek ve çıkararak yıkar gerçekleştirin. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca (DPBS hazırlanmıştır)% 4 paraformaldehid kullanılarak hücre mono tabakaları sabitleyin. UYARI: Paraformaldehyde yanıcı, bir solunum tahriş ve şüpheli kanserojen. </li><li> bir pipet kullanılarak paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve yavaşça eklenmesi ve yemekler kenarı için / pipet kullanılarak DPBS kaldırarak hücreler DPBS ile 1 kez (2 mi) yıkayın. </li><li> Sabitlenen hücreler konfokal lazer tarama kullanılarak bir zar floresans sinyalinin varlığı için görüntülenmek üzere hazırmikroskobu (CLSM). Görüntülemeden hemen önce gerçekleştirmek ya da seçenek olarak, NaN3,% 0.05 ihtiva eden DPBS orta yerine ve 4 ° C&#39;de yemekler saklayın. DİKKAT: NaN3 zehirlidir; NaN 3 kullanırken çok dikkatli. NOT: Bu şekilde depolanan sabit numuneler en iyi sonuçlar için 48 saat içinde görüntülü olmalıdır. </li></ol> Canlı hücreler Dio ve Dio-LCNPs ve FRET Görüntüleme 5. Hücresel Teslimat NOT: Bu yöntemde, hücreler 6 uM (DIO FRET donör) her bir DIO-LCNP-PEG-kol ve 1,1&#39;-dioktadesil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perklorat (DII ile colabeled edilir ücretsiz DII) FRET alıcı olduğu. plazma zarı içine Dio-LCNP-PEG-Chol ve kurulduğu gelen Dio salınımı DII alıcısı için Dio donörden enerji transferi gözlenen artış ile teyit edilir. <ol><li> Dio-LCNP-PEG-Chol ve DII fre ile sırayla etiket hücrelerie aşama 4&#39;te tarif edilen yöntem kullanılarak. </li><li> Boyama işleminden sonra hücreler DPBS ile 1 kez (2 mi) bir serolojik bir pipet kullanarak yıkama ve canlı hücre görüntüleme çözeltisi, 2 ml (LCIS) ile yıkama tamponu değiştirin. </li><li> ısıtılmış bir kuluçka odasına, resim tam emisyon 488 nm heyecanlı Dio donör tarafından 4 saatlik bir süre boyunca 30 dakika aralıklarla bir FRET görüntüleme yapılandırma ile bir konfokal mikroskop (60X objektif) kullanılarak ve toplama canlı hücre örneği ile donatılmış bir mikroskop sahnede Dio donör ve 32 kanallı spektral dedektörü ile 490-700 nm DII alıcısı hem spektrumları. </li><li> NOT: FRET görüntüleme hakkında daha fazla bilgi için, 15 başvuru bakın. </li><li> Dio donör ve Dio-LCNP-PEG-Chol ve DII ile boyanmış hücrelerden DII alıcısı hem zamana bağımlı emisyon yoğunluğunu belirler. Zamana bağımlı alıcı / verici giderek artacak oranını görüntüler için (DII emi / DIO emi), ve sonunda plaka FRET hesaplamakau membran içine bölümlenmiş Dio donör miktarı bir kez maksimum 16 ulaşmıştır. </li></ol> 6. Dio Sitotoksisitenin Deneyi ve Dio-LCNPs HEK 293T / 17 Hücreleri Not: DIO-LCNP malzeme sitotoksisite bir tetrazolyum boya bazlı proliferasyon analizi 17 kullanılarak tayin edilir. Hücreler, dağıtım / etiketleme taklit koşulları altında malzemelerin değişen konsantrasyonlarının varlığında, çok oyuklu bir plaka içerisinde kültürlenir. Hücreler daha sonra çoğalması için izin 72 saat boyunca kültürlenir. Bir boya (MTS (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-karboksimetoksifenil) -2- (4-sülfofenil) -2H-tetrazolyum) daha sonra oyuklara ilave edildi ve metabolik olarak aktif olan hücreler mavi formazan ürüne boya dönüştürün. renk oluşumu miktarı canlı hücre sayısı ile doğru orantılıdır. <ol><li> Hasat HEK aşama 3.2.Seed tarif edilen prosedür takip edilerek, T-25 balonuna 293 T1 / 7 hücreleri24 saat için 96-yuvalı doku kültürü ile muamele edilmiş levha ve kültür çukurlarına HEK 293T / 17 hücreleri (/ 100 ul / oyuk 5.000 hücre). </li><li> Tamamen ücretsiz dio içeren HEPES-DMEM 50 ul bir mikropipet kullanarak kuyulardan kültür ortamı çıkarın ve ekleyin, kuyu çoğaltmak Artan konsantrasyonlarda DIO-LCNPs veya Dio-LCNP-PEG-Chol. 30 dakika boyunca, 37 ° C&#39;de hücreler üzerinde inkübe edin. Not: Genellikle, üç kopya ya da dört yapılan çoğaltır istatistiksel güvenilir veri elde etmek için yeterlidir. <ol><li> İnkübasyondan sonra, bir mikropipet kullanılarak malzemeler ihtiva eden dağıtım orta kaldırmak ve büyüme ortamında 100 ul ile değiştirin. Kültür 72 saat boyunca hücre. </li></ol></li><li> Her bir oyuğa tetrazolyum alt-tabaka 20 ul ekle inkübatör plaka dönüş ve renk oluşumu 4 saat 37 ° C&#39;de ilerlemesine izin. 570 nm (bu stu kullanılan Dio-LCNPs için emme minimada formazan ürünün absorbansı (abs) Okudy) ve spesifik olmayan arka plan emmesinin çıkartma için 650 nm () bir mikrotitre plaka okuyucusu kullanılarak. </li><li> Ayırıcı emme değeri (ABS 570 - ABS 650) Konu malzeme konsantrasyonuna karşı ve kontrol hücre çoğalması (hücre kültür ortamı, yalnızca hücrelerin proliferasyonunun derecesi) yüzdesi olarak sonuçları şu şekildedir. </li></ol> 7. Veri analizi <ol><li> İstatistiksel varyansın tek değişkenli analizi (ANOVA) ile verileri analiz. çoklu karşılaştırmalar için, Bonferroni post hoc testi uygulayın. ortalama ± standart hata olarak belirtilmiştir (SEM) gibi tüm ortalama değerler sağlamak. NOT: anlamlılık için kabul edilebilir olasılık p &lt;0.05 idi. </li></ol>

<ol><li>Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+actuation+of+therapeutic+nanoparticles%3A+an+update+on+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Deliv%22%5BJournal%5D)">Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress.</a> Ther. Deliv. 7 (5), 335-352 (2016).</li>
<li>Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+low-dose+toxicity+of+the+universal+solvent+DMSO%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO.</a> FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).</li>
<li>Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+tuning+of+organic+nanocolloids+by+controlled+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions.</a> ACS Nano. 3 (10), 3214-3220 (2009).</li>
<li>Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+Liquid+Crystal+Nanoparticles+for+Intracellular+Fluorescent+Imaging+and+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery.</a> ACS Nano. 8 (7), 6986-6997 (2014).</li>
<li>Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+DiO-labelled+tumour+cells+in+liver+sections+by+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy.</a> J. Microsc. 208 (Pt 1), 65-74 (2002).</li>
<li>Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+neuronal+connections+in+postmortem+human+hippocampal+complex+with+the+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI.</a> Neurobiol Aging. 11 (6), 649-653 (1990).</li>
<li>Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+in+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Current concepts in neuroanatomical tracing.</a> Prog. Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dil+and+DiO%3A+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 12 (9), 333-341 (1989).</li>
<li>Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+imaging+and+ultrastructural+analysis+of+individual+axon+terminals+labeled+by+iontophoretic+application+of+lipophilic+dye%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye.</a> J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-20 (1999).</li>
<li>Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+in+developing+visual+systems+with+a+new+method+of+staining+neurones+and+their+processes+in+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue.</a> Development. 101 (4), 697-713 (1987).</li>
<li>Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+with+fluorescent+carbocyanine+dyes+of+cultured+endothelial+and+smooth+muscle+cells+by+growth+in+dye-containing+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium.</a> Histochemistry. 97 (4), 329-333 (1992).</li>
<li>Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevation+of+intracellular+glucosylceramide+levels+results+in+an+increase+in+endoplasmic+reticulum+density+and+in+functional+calcium+stores+in+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons.</a> J. Biol. Chem. 274 (31), 21673-21678 (1999).</li>
<li>Garrett, R. H., Grisham, C. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarrett%2C+RH+%22Biochemistry%22">Biochemistry</a>. , 5th, Brooks/Cole Cengage Learning. Belmont, CA. (2013).</li>
<li>Berne, B. J., Pecora, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBerne%2C+BJ+%22Dynamic+Light+Scattering%22">Dynamic Light Scattering</a>. , Courier Dover Publications. 41155-41159 (2000).</li>
<li>Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html">Basics of FRET Microscopy</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html ">http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html </a> (2016).</li>
<li>Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+hydrophobic+molecules+from+polymer+micelles+into+cell+membranes+revealed+by+Fo%CC%88rster+resonance+energy+transfer+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).</li>
<li>Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+MTT+assay+for+rapid+determination+of+chemosensitivity+of+human+leukemic+blast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells.</a> Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).</li>
<li>Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+raft-mediated+membrane+tethering+and+delivery+of+hydrophobic+cargos+from+liquid+crystal-based+nanocarriers%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers.</a> Bioconjug. Chem. 27 (4), 982-993 (2016).</li>
<li>Karve, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revival+of+the+abandoned+therapeutic+wortmannin+by+nanoparticle+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8230-8235 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

NMDD bir sürekli amacı aynı anda geliştirilmiş ilaç etkinliği ile kombine kontrol hedefleme ve hücre ve dokulara ilaç formülasyonlarının içerisinden dağıtım olmaktadır. Bu önemli bir sorun teşkil ettiği için ilaç moleküllerinin belirli bir sınıf sulu ortamda hiçbir çözünürlüğüne idareli sahip hidrofobik ilaçlar / görüntüleme ajanları olduğunu. Bu sorun, klinik ortamda in vitro hücre kültür sistemleri ile ilgili potansiyel ilaçların geçişi saran ve &quot;rafa&quot; olarak ümit vaadeden bir ilaç moleküll...

canlı hücreler ile (en azından bir boyutta malzeme ≤100 nm) nanomalzemeler arayüz gelişiyle bu yana, sürekli bir gol çeşitli uygulamalar için nanopartiküller (NPS) benzersiz boyut özelliklerine yararlanmak olmuştur. Bu uygulamalar, hücre ve doku markalama / görüntüleme (in vitro ve hem de in vivo), gerçek zamanlı algılama ve ilaç ve diğer yüklerin 1 kontrollü olarak verilmesini içerir. Böyle İlgili NP özelliklerin örnekleri yarı iletken Nanokristallerin boyutu bağımlı emisyon (kuantum noktaları, QD&#39;lerin) arasında; altın nanopartiküllerin fototermal özellikleri; Lipozomlar sulu iç kısım büyük yükleme kapasitesi; Bu tür tek duvarlı karbon nanotüpler ve grafen olarak karbon allotropes, ve balistik iletkenlik. Daha yakın zamanlarda, önemli derecede bir faiz gibi kontrast / görüntüleme a gibi ilaçlar ve diğer yükler, kontrollü modülasyonu için NPS kullanımında ortaya çıkmıştırbeyler. Burada, gerekçe anlamlı / geliştirmek bir NP formülasyonu olarak sunarak ilaç kargo genel çözünürlüğü, teslim dozu, dolaşım süresi ve nihai açıklığı optimize etmektir. Bu NP-aracılı ilaç dağıtım (NMDD) olarak bilinen hale geldi ve çeşitli kanserler ve klinik çalışmaların çeşitli aşamalarında daha yüzlerce tedavisinde klinikte kullanılmak üzere yedi FDA onaylı NP ilaç formülasyonları şu anda. &quot;Daha az ile daha başarmak;&quot; Özünde, amaç etmektir diğer bir deyişle, geniş yüzey alanı yararlanarak daha az dozaj idareleri devamı getirilmiş ilacı uygulamak için bir iskele olarak NP kullanımı: hacim (örneğin, bu tür QDS ve metal oksitler gibi sert parçacıklar) NPS veya yükleme için geniş iç hacme büyük kargo yükleri (örneğin, lipozomlar veya miseller). Buradaki amaç, sulu istikrar ve gelişmiş dolaşımını teşvik ederken aynı zamanda, özellikle için, birden fazla sistemik teslim doz rejimleri için gerekliliğini azaltmakÇok etkili olmakla beraber, sulu ortamda çok az çözünen, zor hidrofobik ilaç yükler. Bu nedenle, burada tarif edilen çalışmanın amacı lipofilik plazma zarı çift tabakaya hidrofobik yükün spesifik ve kontrollü verilmesi için, yeni bir NP iskele ile canlılığı belirlemekti. iş için motivasyon sulu ortamdan hücrelere hidrofobik moleküllerin teslim doğasında sınırlı çözünürlük ve zorluk oldu. Tipik haliyle, bu tür hidrofobik moleküllerin dağıtım iç yükleme sınırlı toksik ve uzlaşma doku ve hücre canlılığı 2 veya misel taşıyıcısı olabilir organik çözücüler (örneğin, DMSO) ya da amfifilik yüzey aktif (örneğin, Poloksamerler) kullanımını gerektirir kapasiteleri. Burada seçilen NP taşıyıcı önceden 3 geliştirilen yeni sıvı kristal NP (LCNP) formülasyonu ve bu ~ 40 kat ulaşmak için daha önce gösterilen olmuştu<html> kültürlenmiş hücrelerde 4 antikanser ilaç doksorubisin etkinlikteki artış. Burada tarif edilen çalışmada seçilmiştir Örnek kargo potansiyometrik membran boya, 3,3&#39;-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO) idi. DIO yaşam ve sabit nöronlar, membran potansiyeli ölçümlerde anterograd ve retrograd izleme için kullanılan bir suda çözülmeyen bir boya, ve genel membran etiketleme 5, 6, 7, 8, 9. Dolayı hidrofobik doğası, DIO, genellikle bir kristal formunda 10 hücre mono tabakaları veya dokulara doğrudan ilave edilir, ya da çok yüksek konsantrasyonlarda kuluçkaya yatırılır Bir konsantrasyon stok solüsyonu 11, 12 seyreltme sonra (~ 1-20 mcM). içerik &quot;LCNP platformuna&gt; Burada, yaklaşımdır kullanımı, DIO. DIO için bir iletim aracı olarak olan iç kısım tam olarak hidrofobiktir ve, yüzeyi aynı zamanda, hidrofilik ve bioconjugation için uygun olan bir çok fonksiyonlu NP, sentez esnasında LCNP çekirdek içine dahil edilen ve NP yüzey daha sonra plazma zarına DIO-LCNP topluluğu zar bağlanmasını teşvik etmek için PEG&#39;lenmiş kolesterol yarımı ile işlevlendirilmektedir. Bu yaklaşım daha fazla doğruluk ve membran ikamet plazma zarına DIO paylaştırıldı bir salma sistemi ile sonuçlanmıştır Dio serbest bir şekilde ana çözeltiye teslim kereden (DIO serbest). Ayrıca, bu yöntemle Dio LCNP aracılı teslim edilmesini düzenleyen ve lipofilik plazma zarı ikili katmanı içine boyanın özel bir bölme oranını teşvik ettiği görülmüştür. Bu, eş zamanlı bir LCNP formülasyonu olarak sunarak% 40 ~ tarafından serbest ilacın sitotoksisite düşürürken elde etti. <p cleşek = &quot;jove_content&quot;&gt; tarifnamede tarif edilen yöntem işin içindeki ya da çok az çözülebilen veya sulu bir çözelti içinde tamamen çözülmez olan oldukça hidrofobik yüklerin hücresel gönderilmesini gerektirir araştırmacılar için güçlü bir izin tekniği olacağı tahmin edilmektedir.

<table><tbody><tr><td>1-etil-3- (3- (dimetilamino) -propil) karbodiimid hidroklorür (EDCA)</td> <td>ThermoFisher</td><td>E2247</td><td></td></tr><tr><td>3,3 & prime; -dioktadesiloksakarbosiyanin perklorat (DiO)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D4292-20MG</td><td>Tehlikeli; DMSO</td></tr><tr><td>Kolesterol poli (etilen glikol) amin hidroklorür</td><td>Nanocs, Inc.</td>'de stok çözeltisi yapın.<td>PG2-AMCS-2k</td><td></td></tr><tr><td>Kontes otomatik hücre sayacı</td><td>ThermoFisher</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Dioktadesil-3,3,3 ve prime; &#8288;,3&prime;-tetrametilindokarbosiyanin perklorat (DiI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495-100MG</td><td>Tehlikeli; DMSO</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM)</td> <td>ThermoFisher</td><td>21063045</td><td>37 °C Sıcak'ta stok çözeltisi yapın; </td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyunu (DPBS)</td> kullanmadan önce C <td>ThermoFisher</td><td>14040182</td><td>37 ° C'de Sıcak; Kullanmadan önce</td></tr><tr><td>C Dinamik ışık saçılma cihazı</td><td>ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, İngiltere)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Fibronektin Sığır Proteini, Plazma</td><td>ThermoFisher</td><td>33010018</td><td>DPBS kullanarak 1 mg / ml stok çözeltisi yapın. 20-30 ve mikro kullanın; MetTek kabını kaplamak için g/ml, 37 ° C'de 2 saat; C</td></tr><tr><td>Formaldehit (%16, W/V)</td><td>ThermoFisher</td><td>28906</td><td>Tehlikeli; DPBS kullanarak %4'e seyreltin</td></tr><tr><td>İnsan embriyonik böbrek hücreleri (HEK 293T/17)</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>ATCC&reg; CRL-11268 ve ticaret;</td><td></td></tr><tr><td>Canlı hücre görüntüleme çözümü (LCIS)</td><td>ThermoFisher</td><td>A14291DJ</td><td>37 ° C'de sıcak; C kullanmadan önce</td></tr><tr><td>MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert hücre kültürü kabı</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>25 mM HEPES ThermoFisher içeren Modifiye Eagle Medium (DMEM)</td><td></td><td>21063045</td><td>37 ° C'de Sıcak; Kullanmadan önce C</td></tr><tr><td>N-hidroksisülfosüksinimid sodyum tuzu (NHSS)</td><td>ThermoFisher</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1si spektral konfokal mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavi Leke (%0,4)&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>T10282</td>, <td>hücreleri saymadan önce hücre süspansiyonuna% 50 oranında karışır</td></tr><tr><td>Zeta potansiyel cihazı</td><td>ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, İngiltere)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Ultrasonik İşlemci</td><td>Sonics and Materials Inc</td><td>GEX 600-5</td><td></td></tr><tr><td>Mini Cetntrifuge</td><td>Benchmark</td><td>Mini-fuge-04477</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Sephadex ve ticaret; G-25 Orta GE</td><td>Sağlık</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc XRS Görüntüleme Sistemi</td><td>Bio-RAD</td><td>76S/07434</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0,25), fenol kırmızısı</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

sıvı kristal nanopartikül carrier bir hidrofobik kargo encapsulated, hedeflenen plazma zarı teslimat

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

hücrelere ilaç / görüntüleme maddeleri kontrollü dağıtım terapötik maddelerin geliştirilmesi için ve hücresel sinyal işlev çalışmaları için önemlidir. Son zamanlarda, nanopartiküller (NPS), teslimat sistemlerinin gelişiminde önemli söz göstermiştir. Burada, sıvı kristal NP (LCNP) tabanlı dağıtım sistemi, bir plazma hidrofobik bölgeye NP çekirdek içinde bir suda-çözünmeyen boya, 3,3&#39;-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO) kontrollü olarak bırakılmaları için kullanılmaktadırlar edilmiştir membran iki tabakalı. NPlerin sentezi sırasında, boya verimli çoklu spektroskopik analizleri ile teyit edildiği gibi, hidrofobik LCNP orta tabakasına dahil edilmiştir. NP yüzeyi (DIO-LCNP-PEG-Chol) bir PEG&#39;lenmiş kolesterol türevi çekimi HEK 293T / 17 hücrelerinde plazma zarı boya yüklü NPS bağlanmasını sağladı. Zamana bağımlı lazer tarama konfokal mikroskopi ve Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme geçmek doğruladıLCNP çekirdek ve plazma zarı bilayeri içine yerleştirilmesi gelen Dio çıkışını ive. Son olarak, bir LCNP-PEG-Chol olarak Dio teslim Dio sitotoksisitesini zayıflatılmış; Dio NP formu Dio ücretsiz toplu bir çözüm teslim kıyasla ~% 30-40 daha az toksisite sergiledi. Bu yaklaşım, bir hidrofobik molekül yüklerin membran spesifik gönderimi ve düzenlenmesi için etkili bir yöntem olarak LCNP platformun faydasını ortaya koyar.

LCNPs olan NP hidrofobik merkez hidrofobik yükler için etkili bir taşıma aracı olarak LCNP yararını göstermek için temsili bir zar markalama probu ile yüklenmiştir hazırlanmıştır. Bu amaç için, seçilen kargo yüksek ölçüde suda çözünür olmayan potansiyometrik membran etiketleme boya dio idi. Şekil 1 ila 18 &#39;de gösterildiği gibi, DIO-yüklü LCNPs (DIO-LCNPs), kimyasal bileşenleri DACTP11, AC10COONa ve Dio iki fazlı bir mini emülsiyon tekniği kullanılarak sentezl...

Bir sıvı kristal nanopartikül (LCNP) nanocarrier canlı hücrelerin plazma zarına bir hidrofobik yük sürekli verilme için uygun bir araç olarak kullanılarak.

Sıvı Kristal Nanopartikül Carrier bir Hidrofobik Kargo Encapsulated, hedeflenen Plazma Zarı Teslimat

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Bu deneysel prosedürün genel amacı, likit kristal tabanlı bir nanoparçacığı, canlı memeli hücrelerin plazma membranının lipofilik kısmına hidrofobik bir yükün kontrollü iletimi için bir taşıyıcı platform olarak kullanmaktır. Bu yöntem, suda çözünürlüğü düşük hidrofobik yüklerin iletiminin ve hücresel alımının nasıl verimli bir şekilde sağlanabileceği gibi, ilaç iletimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, membran hedefli hidrofobik yüklerin plazma membranına daha spesifik bir şekilde iletilmesini sağlaması ve buna ek olarak sitotoksisitesini azaltmasıdır.Prosedürü, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Dr. Okhil Nag uygulamalı olarak gösterecektir. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı şekilde DiO sıvı kristal nanoparçacıklarının hazırlanması ile başlayın. Ardından, HEPES tamponu içindeki 1.0 millileters DiO sıvı kristal nanoparçacığa, taze hazırlanmış 20 microliters NHSS/EDC çalışma çözeltisi ekleyin.Ve beş dakika boyunca karıştırın. Ardından, bu karışıma 20 µL kolesterol PEG amin stok çözeltisi ekleyin ve iki saat boyunca karıştırın. İki saat sonra, bir masaüstü mini santrifüj kullanarak reaksiyon karışımını maksim

targeted-plasma-membrane-delivery-hydrophobic-cargo-encapsulated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Hücrelerin hızlı mekanik deformasyon makromoleküller ve nanomalzemelerin hücre içi iletimi için gelecek vaat eden bir vektör içermeyen bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu protokol, geniş bir uygulama yelpazesi için sistemin nasıl kullanılacağı hakkında ayrıntılı adımlar sağlar.

Sağlam, mikroakışkan Hücre içi Delivery Platform olarak hücre Sıkma

Bu çalışmada, biyouyumlu nanopartiküllerin ultra küçük popülasyonlarını sentezlemek için bir yöntemin yanı sıra, hücresel etkileşimlerini değerlendirmek için birkaç in vitro yöntem tanımlanmıştır.

Katı Lipit nanopartiküller (SLNs) Hücre içi Hedefleme için başvurular

nano yapılı lipit taşıyıcının (NLC) sentezi için en yaygın olarak kullanılan yöntem, yağ-su emülsiyonu, homojenizasyon ve katılaşma içerir. Bu dakarbazin teslimat için potansiyel bir taşıyıcı madde gibi arzu edilen boyutu, geliştirilmiş ilaç enkapsülasyonu ve ilaç yükleme verimliliği ile NLC elde etmek katılaştırmadan sonra yüksek kesme dispersiyon uygulayarak buradan değiştirildi.

Nano yapılı lipid taşıyıcı kullanılarak kanser terapötik dakarbazin kapsüllenmesi

Bu protokolün amacı, siRNA'nın BBB'yi geçmesini sağlamak için bir CNS dağıtım sistemi olarak nöro-hedefleme peptitli katyonik/anyonik lipozomları kullanmaktır.  siRNA gibi tedaviler için bir dağıtım sisteminin optimizasyonu, prion ve diğer nörodejeneratif hastalıklar için daha fazla tedavi seçeneğine izin verecektir.

Katyonik ve Anyonik lipozomlar kullanılarak merkezi sinir sistemine Terapötik siRNA teslimi

Nanopartiküller endikasyonlar geniş bir aralığı için ümit vaadeden bir ilaç sağlama sistemlerini ortaya çıkmaktadır. Burada, ters mühendislik ipek böceği ipek kullanılarak ipek nanopartiküller üretmek için basit ama güçlü bir yöntem açıklanmaktadır. Bu ipek nanopartiküller terapötik bir yük ile yüklenen ve daha sonra ilaç dağıtım uygulamaları için keşfedilebilir.

İpek Nanopartiküller imalatı ve İlaç Dağıtım Uygulamaları

Nanomalzemeler çok yönlü kontrollü tedavi teslimat temel bilim ve çevirim uygulamalar için mekanizmalar kullanır, ancak onların imalat kez en Biyomedikal laboratuvarlarda kullanılamaz uzmanlık gerektirir. Burada, iletişim kuralları ölçeklenebilir imalat ve terapötik flash nanoprecipitation kullanarak çeşitli kendi kendine monte nanocarriers yüklenmesini için mevcut.

Ölçeklenebilir, Hızlı montaj ve biyoaktif proteinler ve Immunostimulants yükleme yolu ile birden parlamak Nanoprecipitation çeşitli sentetik Nanocarriers içine

Burada biz bir protokol üzerinde kuru-film yöntemini temel alır ve güvenli için kullanılan katyonik nanoliposomes, nesil için tarif ve in vitro verimli bir şekilde teslim mesajcı RNA transkripsiyonu.

Vitro verimli bir şekilde teslim için katyonik Nanoliposomes nesil mesajcı RNA transkripsiyonu

Bu makalede falcarindiol lipid kaplı 74 nm nano tanecikleri encapsulation. Nano tanecikleri lipid damlacıkları içine insan kök hücreleri tarafından hücresel alımını floresan ve confocal görüntüleme tarafından izlenir. Nano tanecikleri değişen solvent hızlı enjeksiyon yöntemiyle cihazlarında ve büyüklükleri dinamik ışık saçılma tekniği ile ölçülür.

Falcarindiol tarafından insan mezenkimal kök hücre içeren yeni Lipid kaplı nano tanecikleri alımını

Fizikokimyasal özellikleri hazırlamak ve karakterize etmek için yöntemler ve nöphalı, pH duyarlı siRNA nanopartiküller biyoaktivite sunulmaktadır. Boyut, morfoloji, yüzey yükü, siRNA yüklemesi ve gen susturulması gibi başarılı siRNA nanometinler için kriterler tartışılmaktadır.

Sitosolik siRNA teslim için Nötrsel olarak şarj edilmiş, pH duyarlı polimerik nanopartiküller hazırlanması

Bu çalışmada nanopartikül karakterizasyonu takip nanoliposome hazırlık için ince lipid film yöntemi kullanılarak klasik hidrasyon açıklanır. A 47 kDa-hidrofilik ve küresel protein, tarin, başarıyla istikrarı artırmak için bir strateji olarak kapsüllenir, hızlı açıklık önlemek, ve kontrollü salınımı teşvik. Bu yöntem hidrofobik moleküllerkapsülasyonuna adapte edilebilir.

Biyoaktif Hidrofilik Globüler Proteinlerin Tuzakları Için Nanoliposomes Hazırlanması ve Karakterizasyonu

Lipid nanopartikülleri mRNA ve DNA kapsülleme için mikroakışkan karıştırma platformu yaklaşımı kullanılarak geliştirilmiştir.

Mikroakışkan Karıştırma Platformu Kullanarak Gen Teslimatı için Lipid Nanopartiküllerinin Formülei ve Karakterizasyonsu

Öğrenin sıvı kristal nanopartiküllerle hidrofobik kargo teslimatını. Bu yöntem, canlı memeli hücrelerinin plazma zarına hedeflenen ilaç iletimini artırır ve sitotoksisiteyi azaltır.

Sıvı Kristal Nanopartikül Carrier bir Hidrofobik Kargo Encapsulated, hedeflenen Plazma Zarı Teslimat

Daha fazla video keşfet