Sıvı Kristal Nanopartikül Carrier bir Hidrofobik Kargo Encapsulated, hedeflenen Plazma Zarı Teslimat

Bu deneysel prosedürün genel amacı, likit kristal tabanlı bir nanoparçacığı, canlı memeli hücrelerin plazma membranının lipofilik kısmına hidrofobik bir yükün kontrollü iletimi için bir taşıyıcı platform olarak kullanmaktır. Bu yöntem, suda çözünürlüğü düşük hidrofobik yüklerin iletiminin ve hücresel alımının nasıl verimli bir şekilde sağlanabileceği gibi, ilaç iletimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, membran hedefli hidrofobik yüklerin plazma membranına daha spesifik bir şekilde iletilmesini sağlaması ve buna ek olarak sitotoksisitesini azaltmasıdır.

Prosedürü, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Dr. Okhil Nag uygulamalı olarak gösterecektir. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı şekilde DiO sıvı kristal nanoparçacıklarının hazırlanması ile başlayın. Ardından, HEPES tamponu içindeki 1.0 millileters DiO sıvı kristal nanoparçacığa, taze hazırlanmış 20 microliters NHSS/EDC çalışma çözeltisi ekleyin.

Ve beş dakika boyunca karıştırın. Ardından, bu karışıma 20 µL kolesterol PEG amin stok çözeltisi ekleyin ve iki saat boyunca karıştırın. İki saat sonra, bir masaüstü mini santrifüj kullanarak reaksiyon karışımını maksimum hızda 30 saniye boyunca kısa süreliğine santrifüjleyin.

Ardından süpernatanı, Dulbecco's fosfat tamponlu salin ile dengelenmiş bir PD 10 boyut dışlama kromatografi kolonundan geçirin. PEG kolesterolün DiO sıvı kristal nanopartikül yüzeyine başarılı kovalent konjugasyonunu jel elektroforezi ile doğrulamak için, metin protokolünde açıklandığı şekilde bir agaroz jel hazırlayın. Jel katılaştıktan sonra, jeli hazne içinde tamamen kapatacak kadar TBE yürütme tamponu ekleyin.

Ardından, jel kuyucuklarına 35 µL DiO sıvı kristal nanopartikül örneği ekleyin ve 110 V gerilimde 20 dakika boyunca çalıştırın. Jeli, 488 nm uyarım filtresine ve 500 ila 550 nm emisyon filtrelerine sahip bir jel görüntüleme sistemi kullanarak görüntüleyin. 14 mm 1 numara lamel ekleri yerleştirilmiş 35 mm çapındaki doku kültürü kaplarını, DPBS içindeki bovine fibronectin ile 37 °C'de iki saat boyunca kaplayarak hazırlayın.

İki saat sonra, kültür kabındaki fibronectin kaplama solüsyonunu uzaklaştırın. Hücre tek tabakasını önce 3 mL DPBS ile yıkayıp, ardından 2 mL trypsin EDTA ekleyerek T25 flask içindeki HEK 293 T17 hücrelerini hasat edin. Flask'ı yaklaşık üç dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin.

Hücreler flasktan ayrıldıktan sonra, flaska dört mililitre komple besiyeri ekleyerek tripsini nötralize edin. Hücre sayacı kullanarak süspansiyondaki hücre konsantrasyonunu belirleyin. Ardından, hücre konsantrasyonunu büyüme besiyeri ile mililitre başına yaklaşık 80, 000 hücre olacak şekilde ayarlayın.

Kap içerisine üç mililitre hücre süspansiyonu ekleyin ve inkübatörde gece boyunca kültüre edin. Ertesi gün, hücrelerin yaklaşık yüzde 70 konflüense ulaşmış olması ve kullanıma hazır olması gerekir. Yüksek bir hücre yüzdesinin güçlü ve verimli bir şekilde işaretlenmesi için yeterli hücre yoğunluğu kritik öneme sahiptir.

Karşılık gelen stok çözeltileri seyrelterek; iletim ortamında bir mililitrelik DiO, DiO sıvı kristal nanopartikül ve DiO sıvı kristal nanopartikül PEG kolesterol çözeltileri hazırlayın. Bir serolojik pipet kullanarak kültür kaplarındaki büyüme ortamını uzaklaştırın ve hücre tek tabakalarını iki kez HEPES DMEM ile yıkayın. Yıkama işlemini, bir pipet yardımıyla HEPES DMEM'i kapların kenarına nazikçe ekleyip ardından geri çekerek gerçekleştirin.

Hazırlanan DiO içermeyen veya DiO'lu sıvı kristal nanoparçacık taşıyıcı çözeltilerden 0.2 mililitre kültür kaplarının merkezine ekleyin. Ardından kapları uygun bir süre boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Daha uzun inkübasyon süreleri, membranöz olmayan bölgelerin spesifik olmayan hücresel işaretlenmesine yol açar.

İnkübasyon süresinin ardından, iletim solüsyonlarını serolojik bir pipet kullanarak uzaklaştırın. Hücre monotabakalarını, her yıkama için iki mililitre kullanarak DPBS ile iki kez yıkayın. Hücre monotabakalarını, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca yüzde dört paraformaldehit kullanarak sabitleyin.

Paraformaldehit çözeltisini bir pipet yardımıyla uzaklaştırın ve hücreleri iki mililitre DPBS ile bir kez nazikçe yıkayın. Artık fikse edilmiş hücreler, konfokal lazer taramalı mikroskopi kullanılarak membranöz floresan sinyal varlığı açısından görüntülenmeye hazırdır. Isıtmalı bir inkübasyon odasına sahip mikroskop tablasında, membran etiketlemesini değerlendirmek için canlı hücre örneğini konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin.

Görüntüleme hemen gerçekleştirilmeyecekse, besiyerini %0,05 sodyum azid içeren DPBS ile değiştirin ve kapları dört derece Celsius'ta saklayın. Bu yöntemde hücreler, FRET donörü olarak DiO ve FRET akseptörü olarak DiI ile birlikte etiketlenir. Hücreleri, daha önce yapıldığı gibi sırayla DiO sıvı kristal nanoparçacık PEG kolesterol ve serbest DiI ile etiketleyin.

Boyamadan sonra, hücreleri serolojik bir pipet kullanarak iki mililitre DPBS ile bir kez yıkayın ve ardından iki mililitre canlı hücre görüntüleme çözeltisi ile değiştirin. Isıtmalı bir inkübasyon odasına sahip mikroskop tablasında, FRET görüntüleme özelliğine sahip konfokal bir mikroskop kullanarak canlı hücre örneğini görüntüleyin. DiO donörünü 488 nanometrede uyararak ve hem DiO donörünün hem de DiI akseptörünün tam emisyon spektrumlarını 490 ile 700 nanometre arasından 32 kanallı bir spektral detektörle toplayarak deneyi, dört saatlik bir süre boyunca 30 dakikalık aralıklar şeklinde yapılandırın.

Ardından, DiO sıvı kristal nanoparçacık PEG kolesterol ve DiI ile boyanmış hücrelerden hem DiO donörünün hem de DiI akseptörünün zamana bağlı emisyon yoğunluğunu belirleyin. Son olarak, metin protokolünde açıklandığı şekilde görüntüler için zamana bağlı akseptör donör FRET oranını hesaplayın. Serbest DiO, çift etiketli bir membran fosfolipid ile karşı boyanan hücrelerin plazma membranları yerine, hücre içinde spesifik olmayan şekilde birikir.

Bu durum, birleştirilmiş görüntülerle görselleştirilebilir. Aksine, DiO sıvı kristal nanoparçacık PEG kolesterol, çift etiketli membran fosfolipidi ile kolokalizasyon yoluyla görselleştirildiği üzere, hücrenin yalnızca plazma membranını spesifik olarak etiketler. FRET, DiO donöründen DiI akseptörüne doğru gözlemlenen enerji transferindeki artış aracılığıyla, DiO'nun sıvı kristal nanoparçacıktan membran lipid çift katmanına bölündüğünü doğrular.

DiO ile DiI arasındaki FRET'in yanı sıra DiO ve DiI emisyon değişiklikleri, zamanın bir fonksiyonu olarak DiO'dan DiI'ye artan FRET'i doğrulamaktadır. DiO sıvı kristal nanoparçacık PEG kolesterol nanoparçacıkları, yaklaşık yüzde 50 canlılık oranındaki serbest DiO'nun belirgin toksisitesine kıyasla, yüzde 90 canlılık ile minimal sitotoksisite sergilemektedir. Bu videoyu izledikten sonra, kargo yüklü sıvı kristal nanoparçacıkların nasıl sentezleneceği, hücresel hedefleme için nasıl biyofonksiyonelleştirileceği ve başarılı hücresel iletim için kargo yüklü hücrelerin nasıl görüntüleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, DiO'nun sulu çözeltiden plazma membranına spesifik olarak iletilmesinin önemli bir zorluk olması nedeniyle güçlük çekeceklerdir. Bu yöntemle ilgili ilk fikri, antikanser ilaç doxorubicin'in hücresel iletimi için sıvı kristal nanoparçacık platformunu kullandıktan ve platformun ilacın hücresel alım kinetiğini modüle etme yeteneğini gördükten sonra geliştirdik. Bu prosedürün ardından, söz konusu yaklaşım, sulu ortamlardan hücrelere iletimleri açısından özel bir zorluk teşkil eden çok çeşitli hidrofobik kargoların hücresel iletimi için uygulanabilir.

Bu yaklaşım, beyin görüntüleme için voltaj duyarlı boyalar veya fotonik destekli ilaç tedavisi için fotodinamik ilaçlar gibi membran hedefli ilaçların ve biyoaktif moleküllerin daha verimli bir şekilde iletilmesini sağlamak için kullanılabilir.