Name: bir Ex Vivo Yöntem kültürlü Rat Mezenterik Mikrovasküler Ağları Time-Lapse Görüntüleme için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Keşfedin sıçan mezenter kültür modelini mikrovasküler ağların time-lapse görüntülenmesi için. Bu yöntem anjiyogenezde endotel hücre etkileşimlerini ve anti-anjiyojenik ilaçların etkilerini değerlendirmeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibe 5-P20GM103629 tarafından WLM ve Tulane Yaşlanma Merkezi'ne desteklenmiştir. Protokol metninin düzenlenmesindeki yardımları için Matthew Nice'e teşekkür ederiz.

Tüm hayvan deneyleri ve prosedürleri Tulane Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Cerrahi Prosedür Kurulumu <ol><li> Otoklav aletleri, cerrahi malzemeleri, ve ameliyat öncesinde kültür malzemeleri. Her sıçan için Cerrahi sarf malzemeleri şunlardır: 1 drape, önceden kesilmiş delik ile 1 örtüyü (0.5 x 1.5) merkezinde, gazlı bez ve 1 emici underpad. Cerrahi aletler şunlardır: bir sayı 10 bıçak ile 1 neşter, cımbız 2 çift ve ince bir makas. 1 drape, cımbız 1 çift ve polikarbonat filtreler ile 6-plaka ekler hazırlandı: Kültür malzemeleri bulunmaktadır. </li><li> pleksiglas platformu, cerrahi bir evre ve% 70 etanol ile cerrahi tezgah üstü alan sterilize edin. steril bir kapta kullanıma kadar cerrahi sahne tutun. <ol><li> 100 mm kültür çanağı merkezi deliğe 1 ile yaklaşık 2 sondaj cerrahi alanı oluşturur. Sonra, pürüzsüz zımpara kağıdı kullanınherhangi bir keskin kenarları ve dokular için yükseltilmiş yüzey oluşturmak için deliğin kenarlarına silikon yapıştırıcı katman ekleyin. </li><li> Alternatif olarak, CAD yazılımı kullanarak cerrahi sahne tasarım ve 3-D baskı (Şekil 1) yapmak. </li></ol></li><li> aşağı steril emici underpad yerleştirin ve bunun üstüne bir pleksiglas platformu yatıyordu. Emici underpad yanındaki ısıtılmış bir yastık üzerinde, bir önceden kesilmiş deliksiz, örtü yerleştirin. </li><li> Steril bir fosfat tamponlu salin (PBS) önceden sıcak ortam, 37 ° C&#39;ye kadar tuz. Bir sonraki cerrahi kurulum için bir 50 ml konik tüp ısıtma pedi ve yer tuzlu üstünde ayrı kültür kaplarına yerleştirin medya ve PBS. </li><li> tüm paketler tüm malzemelerin steril kullanımını sağlamak için cerrahi başlamadan önce açılmış olduğundan emin olun. Bu prosedürde kullanılan yaygın araçların tam listesi listelenir Spesifik Cerrahi Malzemeler ve Araçlar Tablo. </li></ol> 2. mezentery Doku Hasat <ol><li> Kullanım erişkin erkek Wistar sıçanları (350 ± 25 g; 6 - yaş 8 hafta). Diğer suşlar ve sıçanların yaşları ikame edilebilir. </li><li> Ketamin (80 mg / kg vücut ağırlığı) ve ksilazin (8 mg / kg vücut ağırlığı) bir kas içi enjeksiyon ile sıçan anestezisi. sıçan bir refleks yanıt denetlemek için ayak parmakları arasında sıkıştırarak anestezi altında olduğunu teyit; hiçbiri olmalıdır. bu terminal prosedür için rüçhan analjezi gerekli değildir. </li><li> Karın bölgesini Tıraş ve epilasyon kremi kullanarak kalan tüylerden. povidon-iyot, ardından% 70 izopropil alkol ile iki kez karın cildi silin. mendil cerrah cerrahi bölgenin merkezinde başlamalı ve daha önce steril gazlı bez veya steril pamuklu çubuk aynı parça ile temizlendi olan alanların üst üste olarak dairesel şekilde hazırlanan alanın dışına taşıyın. Sonra steril cerrahi kurulum hayvan transferi ve pleksiglas plat üstünde yerform. </li><li> sternum altında 1 ile başlayan gut 1.25 kesi - Bir neşter bıçak kullanarak, bir 0.75 yapmak. bağırsak veya mezenter (cilt 1 kat, bağ dokusu 1 kat, ve kas 1 kat) delmek için dikkatli olun. </li><li> kesi üzerinde önceden kesilmiş delik olan bir örtü koyun ve örtü üstünde bir steril cerrahi sahne yerleştirin. kesi ile açılış Uyum Gösterir olun. bulmak ve cerrahi evre delikten ileum çekin steril pamuk uçlu aplikatör kullanın. </li><li> Pamuk uçlu aplikatörler kullanılarak aşamasında 8 mezenterik pencereleri ve açılır pencere (Şekil 1) dokunmamaya dikkat - 6 çekin. Dokular, tipik haliyle çekum yakınındaki itibaren ince bağırsak ileum bölgesinden toplanır. çözeltisi damla steril bir şırınga kullanılarak gerektiği kadar ısıtılmış steril tuzlu su ile nemli maruz kalan dokuların tutun. </li><li> Pentobarbital sodyum intrakardiyak enjeksiyonu ile sıçan (sıçan başına 0.2 mL) ile öldürülür. Beni çıkartmadan öncesenteric pencereler, sıçan kalbi palpe ötenazi sağlamak; Puls olmalıdır. </li><li> pencere kesmek için yağ yastığı ve ince makas kapmak için cımbız kullanarak istediğiniz mezenter dokuları çıkarın. pencerenin çevresinde yağ (2 mm) bir sınır bırakın. medya içinde bir defa ısıtılmış, steril PBS içinde bir kez dokuları yıkayın. </li><li> karın boşluğuna batın ileum dönün ve kurumsal kurallarına göre hayvanın imha edin. </li></ol> Time-Lapse Çalışmaları 3. Mezenter Doku Kültürü <ol><li> Steril bir laminer akış kaputu Transfer otoklava kültür malzemeleri (bölüm 1.1) ve dokular. </li><li> polikarbonat filtre zarı tepesinde her doku aktarmak için cımbız kullanın. yağ yastığı ile tut dokular damarsal hasar görmesini önlemek için. </li><li> Hızla pencere dokunmamaya dikkat ederek, yağ yastığı kullanılarak doku yayıldı. 6-çukurlu plaka altına doku ile ekleme ters çevirin ve ortam 3 ml (Şekil 1 ile kapak </stRong&gt;). Bu prosedür için kullanılan tipik ortam,% 1 penisilin streptomisin (Penstrep ile tedarik edilmiş) ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile Minimum Esansiyel Ortamı (MEM) içerir. Ortam anjiyojenezi teşvik etmek için diğer serumlar ve / veya büyüme faktörleri ile desteklenebilir. </li><li> En fazla 5 gün boyunca, standart inkübatör koşullarında her doku ve kültür (% 5 CO2, 37 ° C) 3.3 - Tekrar 3.2 adımları tekrarlayın. </li></ol> Mezenter Doku 4. Time-Lapse Görüntüleme <ol><li> görüntüleme gününde, konjuge BSI-lektin iyi her ortam katkısı ve 30 dakika boyunca, standart kültür koşulları altında inkübe edilir. lektin özgür medya ile iki kez dokuları yıkayın. BSI-lektin leke kültüründe en fazla 3 gün süreyle mezenter dokusu üzerinde görünür kalacaktır. </li><li> Bir mikroskop aşamasına plaka aktarın. kendi morfolojisi ve ağ yapısına dayalı kan ve lenf damarlarına belirleyin. </li><li> Her doku üzerinde istenen ağ bölgesini bulun ve görüntü alabilir. görüntüleme dikkat edinAynı bölgeyi sağlamak için konum sonraki görüntüler için Çekilecek. Bir motorlu sahne kullanılıyorsa, koordinatları belge. </li><li> inkübatör dokuları dönün ve istenen son noktaya kadar kültüre devam edin. Tekrarlayın 4.1 adımları - 4.3 istenilen deneysel zaman noktalarında bağlı gerektiği gibi. </li></ol> 5. Doku ile immün <ol><li> BSI-lektin Etiketleme <ol><li> ortam ile iki durulama ardından ortam içinde 1:40 FITC ile konjüge edilmiş lektin (6-gözlü plaka içinde çukur başına 2.5 ml antikor çözeltisi) 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca doku inkübe edin. durular için, medya ekleyin ve sonra hemen değiştirin. </li></ol></li><li> Live / Dead Etiketleme <ol><li> 1 ile 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca doku inkübe: 500, 2 mM etidyum homodimer-1 ve 1: ortamı ile iki durulama sonra ortam 500, 1 mM Calcein AM (6-gözlü plaka içinde oyuk başına 2.5 ml antikor çözeltisi). </li></ol></li><li> BSI-lektin / NG2 Etiketleme <ol><li> Bir mikroskop yayılmış dokular kaydırdıe (1-2 dokular / slayt) ve kurumaya bırakın. yağ çıkarılması için sıkıca bastırarak bir neşter ile aşırı yağ çıkarın. </li><li> -20 ° C&#39;de 30 dakika süreyle soğuk metanol dokuları düzeltildi. PBS (3 x 10 dk) ile dokuları yıkayın. </li><li> 100 tavşan poliklonal NG2 antikor ve% 5 normal keçi serumu (NGS): Primer antikor etiketlemesi için 1 ile oda sıcaklığında 1 st için dokular inkübe edin. PBS (3 x 10 dk) ile dokuları yıkayın. </li><li> İkincil antikor etiketlemesi için 1 ile oda sıcaklığında 1 st için dokular inkübe: 100 keçi anti-tavşan CY2 bağlı antikor (GAR-Cy2) ve% 5 NGS. PBS (3 x 10 dk) ile dokuları yıkayın. </li><li> PBS ile iki durulama sonra PBS içinde 1:40 FITC konjüge lektin, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca doku inkübe edin. durular için, PBS ekleyin ve sonra hemen değiştirin. </li><li> slaytlar monte etmek için, üst 50:50 PBS ile doku ve gliserol çözeltisi ve yer lamel kapsamaktadır. oje kullanarak slayt kenarları mühür. </li></ol></li><li> LYVE-1 / PECAM Etiketleme<ol><li> bir mikroskop lamı üzerine dokulara yayılır (1-2 dokular / slayt) ve kurumaya bırakın. yağ çıkarılması için sıkıca bastırarak bir neşter ile aşırı yağ çıkarın. </li><li> -20 ° C&#39;de 30 dakika süreyle soğuk metanol dokuları düzeltildi. PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) ile dokuları yıkayın. </li><li> 200 fare monoklonal biyotinile CD31 antikoru ve 1: Primer antikor etiketlemesi için 1, oda sıcaklığında 1 saat boyunca dokular inkübe 100 tavşan poliklonal LYVE-1 antikoru, PBS +% 0.1 saponin +% 2 sığır serum albümini (BSA) +% 5 NGS . PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) ile dokuları yıkayın. </li><li> 500 Cy3-konjüge edilmiş streptavidin antikoru ve 1: PBS +% 0.1 saponin +% 2 BSA +% 5 NGS 100 GAR-Cy2 ikincil antikor etiketlemesi için, 1 1, oda sıcaklığında st için dokular inkübe edin. PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) ile dokuları yıkayın. </li><li> 50:50 PBS ve gliserol çözeltisi ile slaytlar, kapak dokularını mount ve üstüne bir lamel yerleştirin. oje kullanarak slayt kenarları mühür. </li></ol></li><li> BrdU / BSI-lektin Etiketleme <ol><li> ortam 1 mg / ml BrdU ekleme ve BrdU çözeltisi doku ortamı değiştirin. 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> bir mikroskop lamı üzerine dokulara yayılır (1-2 dokular / slayt) ve kurumaya bırakın. yağ çıkarılması için sıkıca bastırarak bir neşter ile aşırı yağ çıkarın. </li><li> -20 ° C&#39;de 30 dakika süreyle soğuk metanol dokuları düzeltildi. PBS (3 x 10 dk) ile dokuları yıkayın. </li><li> 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca 2M HCI doku DNA&#39;yı denatüre. PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) dokuları yıkayın. </li><li> PBS +% 0.1 saponin +% 2 BSA +% 5 NGS 100 monoklonal fare anti-BrdU: Primer antikor etiketlemesi için, 1 ile oda sıcaklığında 1 st için dokular inkübe edin. PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) ile dokuları yıkayın. </li><li> İkincil antikor etiketlemesi için, 1 ile oda sıcaklığında 1 st için dokular inkübe: 100 keçi anti-fare Cy3-konjüge edilmiş antikor, PBS +% 0.1 saponin +% 2 BSA +% 5 NGS (GAM-Cy3). PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) ile dokuları yıkayın. </li><li&gt; PBS ile iki durulama sonra PBS içinde 1:40 FITC konjüge lektin, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca doku inkübe edin. </li><li> üst slaytlar, kapak dokularını 50:50 PBS ile ve gliserol çözeltisi ve yer lamel monte etmek için. oje kullanarak slayt kenarları mühür. </li></ol></li><li> BSI-lektin / CD11b etiketleme <ol><li> bir mikroskop lamı üzerine dokulara yayılır (1-2 dokular / slayt) ve kurumaya bırakın. yağ çıkarılması için sıkıca bastırarak bir neşter ile aşırı yağ çıkarın. </li><li> -20 ° C&#39;de 30 dakika süreyle soğuk metanol dokuları düzeltildi. PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) ile dokuları yıkayın. </li><li> Primer antikor etiketlemesi için 1 ile oda sıcaklığında 1 st için dokular inkübe: PBS +% 0.1 saponin +% 2 BSA +% 5 NGS 100 farede anti-fare CD11b. PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) ile dokuları yıkayın. </li><li> İkincil antikor etiketlemesi için 1 ile oda sıcaklığında 1 st için dokular inkübe: PBS +% 0.1 saponin +% 2 BSA +% 5 NGS 100 GAM-Cy3. PBS ile dokuları yıkayın+% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika). </li><li> PBS ile iki durulama sonra PBS içinde 1:40 FITC konjüge lektin, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca doku inkübe edin. </li><li> üst slaytlar, kapak dokularını 50:50 PBS ile ve gliserol çözeltisi ve yer lamel monte etmek için. oje kullanarak slayt kenarları mühür. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in cancer and other diseases.</a> Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).</li>
<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+life%2C+disease+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li>
<li>Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+Regulation+of+Angiogenic+Sprouting+by+Biochemical+Factors+and+Wall+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress.</a> Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).</li>
<li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li>
<li>Song, J. W., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+forces+control+endothelial+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluid forces control endothelial sprouting.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).</li>
<li>Chan, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+in+vitro+3D+capillary+beds+by+self-directed+angiogenic+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting.</a> PLoS One. 7 (12), e50582(2012).</li>
<li>Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+experimental+and+computational+approaches+to+sprouting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis.</a> Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).</li>
<li>Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+angiogenesis+model+for+investigating+multicellular+interactions+across+intact+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).</li>
<li>Azimi, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+model+for+anti-angiogenic+drug+testing+on+intact+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks.</a> PLoS One. 10 (3), e0119227(2015).</li>
<li>Nicosia, R. F., Ottinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+microvessels+in+serum-free+matrix+culture+of+rat+aorta.+A+quantitative+assay+of+angiogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro.</a> Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).</li>
<li>Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures+as+a+model+to+study+angiogenesis+of+brain+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 52(2015).</li>
<li>Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+retinal+explant+cultures+to+study+ex+vivo+tip+endothelial+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses.</a> Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).</li>
<li>Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+retinal+angiogenesis+reveals+decreased+development+and+progression+of+neovascular+sprouting+by+anecortave+desacetate%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16989723">In vivo models of angiogenesis.</a> J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).</li>
<li>Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+islands+during+microvascular+regression+and+regrowth+in+adult+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks.</a> Front Physiol. 4, 108(2013).</li>
<li>Kelly-Goss, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+along+vascular+islands+during+microvascular+network+growth%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth.</a> BMC Physiol. 12, 7(2012).</li>
<li>Skalak, T. C., Price, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mechanical+stresses+in+microvascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">The role of mechanical stresses in microvascular remodeling.</a> Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).</li>
<li>Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+types+of+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+proliferation+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival.</a> J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).</li>
<li>Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+shear+stress%2C+angiogenesis%2C+and+VEGF+in+skeletal+muscles+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo.</a> Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).</li>
<li>Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+An+Inflammatory+Link+Between+Angiogenesis+and+Lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis.</a> Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu protokol mikrovasküler ağ büyüme time-lapse görüntüleme için bir ex vivo aracı olarak sıçan mezenter kültür modeli kullanılarak için bir yöntem belgelemektedir. Laboratuvarımızda Önceki çalışmaları, 1 yönelik modeli) anjiyojenez 8, 2) lenfanjiyogenez 8, 3) perisit-endotelyal hücre etkileşimleri 8 ve 4), anti-anjiyojenik madde testi 9&#39;a göre bir kullanım oluşturmuştur. Birden çok zaman n...

Mikrovasküler ağ büyüme ve yeniden doku işlevi için ortak paydası, yara iyileşmesi, ve birden çok patoloji ve önemli bir proses, mevcut olanlar 1, 2, yeni kan damarlarının büyümesi olarak tanımlanır, anjiyojenez ise. yeni gemiler mühendislik veya anjiyogenez katılan hücresel dinamiklerin önemini anlayarak, anjiyogenik dayalı tedaviler tasarımı dokuya için kritik öneme sahiptir. Ancak, bu işlem karmaşıktır. Bir mikrovasküler ağ içinde belirli yerlerde değişiklik ve çoklu hücre tipleri (örneğin endotel hücrelerini, düz kas hücreleri perisitleri, makrofajlar, kök hücreler) ve birden fazla sistemi (lenfatik ağları ve yapay sinir ağları) içerir olabilir. In vitro modeller anjiyogenez 3 katılan farklı hücreler arasındaki ilişkiyi inceleyen çok büyük katkıları olmasına rağmen, onların fizyolojik alaka thei nedeniyle zarar olabilir<html> Sınırlı karmaşıklığı ve yakından in vivo senaryoyu yansıtmayan gerçeğini r. Bu sınırlamaları, üç boyutlu kültür sistemleri üstesinden gelmek için 3, ex vivo doku modelleri 4, mikroakışkan sistemleri 5, 6, ve son yıllarda geliştirilmiş ve tanıtılmıştır 7 hesaplama modelleri. Bununla birlikte, sağlam mikrovasküler ağ ex vivo anjiyojenezi araştırmak için hızlandırılmış yeteneğine sahip bir model için hala bir ihtiyaç vardır. karmaşıklık düzeyi ile anjiyogenez çalışmaları için yeni time-lapse modellerinin kurulması anjiyogenez düzenleyen altında yatan mekanizmaları anlamak için paha biçilmez bir araç sağlayacak ve tedavileri geliştirmek. Sağlam bir mikrovasküler ağ üzerinden anjiyogenez ex vivo soruşturma sağlayan bir potansiyel modeli sıçan mezenter kültür modeli&gt; 8. Son çalışmada, kan ve lenfatik mikrovasküler ağları kültür sonra canlı kalır olduğunu göstermiştir. Daha da önemlisi, sıçan mezenter kültür modeli fonksiyonel pericyte-endotel hücre etkileşimleri, kan ve lenfatik endotel hücre bağlantıları ve zaman atlamalı görüntüleme araştırmak için kullanılabilir. Bu makalenin amacı time-lapse görüntüleme yöntemi için protokol sağlamaktır. Bizim Örnek sonuçlar serumu ile anjiyojenezin uyarılmasında sonra canlı kalır ve dokuya özel anjiyojenik yanıtlar gibi endotel hücre takibi çalışmaları ölçülmesi için bu yöntemi kullanarak örnekleri sunmaktadır çok sayıda hücre türleri belge.

<table><tbody><tr><td>Drape</td><td>Kardinal Sağlık</td><td>4012</td><td>12" x 12" Bio-Shield Düzenli Sterilizasyon Sargıları</td></tr><tr><td>Neşter Sapı</td><td>Roboz Cerrahi Alet</td><td>RS-9843</td><td>Neşter Sapı, #3; Katı; 4" Uzunluk</td></tr><tr><td>Steril Cerrahi Bıçak</td><td>Cincinnati Cerrahi</td><td>0110</td><td>Paslanmaz Çelik; 10</td></tr><tr><td>Numara Kültür Kabı (60 mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>130181</td><td>10/Kol</td></tr><tr><td>Graefe Forcep (kavisli cımbız)</td><td>Roboz Cerrahi Alet</td><td>RS-5135</td><td>Mikro Diseksiyon Forseps; Dişli; hafif eğri; 0,8 mm Uç Genişliği; 4" Uzunluk</td></tr><tr><td>Graefe Forcep (düz cımbız)</td><td>Roboz Cerrahi Alet</td><td>RS-5130</td><td>Mikro Diseksiyon Forseps; tırtıklı, düz; 0,8 mm Uç Genişliği; 4" Uzunluk</td></tr><tr><td>Noyes Mikro Makas</td><td>Roboz Cerrahi Alet</td><td>RS-5677</td><td>Noyes Mikro Diseksiyon Yaylı Makas; düz, keskin-künt noktalar; 13 mm Kesme Kenarı; 0,25 mm Uç Genişliği, 4 1/2" Toplam Uzunluk</td></tr><tr><td>Gazlı Bez Pedleri</td><td>FisherBrand</td><td>13-761-52</td><td>Non-Steril Pamuklu Gazlı Bez Süngerler; 4 "x 4" 12 Katlı</td></tr><tr><td>Pamuk Uçlu Aplikatörler</td><td>FisherBrand</td><td>23-400-124</td><td>6 "Uzunluk; ahşap şaft; Tek Kullanımlık</td></tr><tr><td>Sadece 6 Kuyulu Plaka</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-49</td><td>Düşük Buharlaşma Kapaklı Düz Tabanlı; Polistiren; Pirojenik</td></tr><tr><td>Olmayan Steril Şırınga 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td>Luer-Lok Uçlu</td></tr><tr><td>Steril Kase</td><td>Tıbbi Eylem Endüstrileri A.Ş.</td><td>01232</td><td>32 oz. Soyma Torbası; Mavi; Steril Tek</td></tr><tr><td>Kullanımlık 6 Kuyulu Plaka Ekleri (CellCrown Ekleri)</td><td>SIGMA</td><td>Z681792-3EA</td><td>6 Kuyulu Plaka Ekleri; Steril Olmayan</td></tr><tr><td>Polikarbonat Filtre Membranı</td><td>SIGMA</td><td>TMTP04700</td><td>İzogor Membran Filtre; Polikarbonat; Hidrofilik; 5.0&nbsp; &mikro; m, 47&nbsp; mm, Beyaz Düz</td></tr> <tr><td>< güçlü > İsim< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar / Açıklama< / güçlü ></td></tr> <tr><td>Beuthanasia</td><td>Schering-Plough Hayvan Sağlığı A.Ş. Birliği (MWI Veteriner Tedarikinden Sipariş Edildi)</td> <td>MWI #: 011168</td><td>Aktif Madde: 100 mL başına, 390 mg pentobarbital sodyum, 50 mg fenitoin sodyum&nbsp;</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Fort Dodge Hayvan Sağlığı (MWI Veteriner Tedarikinden Sipariş Edildi)</td><td>MWI #: 000680</td><td>Kateset 100 mg / mL</td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>LLOYD. Inc. (MWI Veteriner Tedarikinden Sipariş Edildi)</td> <td>MWI #: 000680</td><td>Anased 100 mg / mL</td></tr><tr><td>Salin</td><td>Baxter</td><td>2F7122</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11095080</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Saponin&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>S7900-100G</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil Alkol</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25372</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-İyot</td><td>İşleyicisi</td><td>82-226</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit</td><td>SIGMA</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>FITC-konjuge Lektin</td><td>SIGMA</td><td>L9381-2MG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NG2 Kondroitin Sülfat Proteoglikan Antikoru</td><td>SIGMA</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31) Antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>555026</td><td></td></tr><tr><td>LYVE-1 Antikoru</td><td>AngioBio Co.</td><td>11-034</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Tavşan Cy2-konjuge Antikor</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-585-144</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Fare Cy3-konjuge Antikor</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-227-003</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Cy3-konjuge Antikor</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-160-084</td><td></td></tr><tr><td>Canlı / Ölü Canlılık / Sitotoksisite Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2'-Deoksiüridin</td><td>SIGMA</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal Fare Anti-Bromodeoksiuridin&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Klon Bu20a</td><td>Dako</td><td>M074401-8</td><td></td></tr><tr><td>Fare Anti-Rat CD11b&nbsp;</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA275R</td><td></td></tr></tbody></table>

bir<em&gt; ex vivo</em&gt; yöntem kültürlü rat mezenterik mikrovasküler ağları time-lapse görüntüleme için

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Anjiyojenez, önceden mevcut damarlardan yeni kan damarlarının büyümesi olarak tanımlanır, endotel hücreleri, perisitler, düz kas hücreleri, bağışıklık hücreleri ve lenf damarları ve sinirler koordinasyon içinde yapılmalıdır. çok hücreli, multi-sistem etkileşimleri fizyolojik ilgili bir ortamda anjiyogenezisteki soruşturma gerektirmektedir. In vitro hücre kültürü modelleri kullanımı bakış açıları sağladı Böylece, ortak bir eleştiri bir mikrovasküler ağı ile ortaya çıkan karmaşıklık özetlemek kalmamasıdır. Bu protokolün amacı, öncesi ve kültürlü sıçan mezenter dokularında anjiyogenez uyarılmasından sonra bozulmamış mikrovasküler ağlarının zaman atlamalı karşılaştırmalar yapabilme yeteneği göstermektir. Kültürlü dokuların hiyerarşi korumak mikrovasküler ağları içerir. İmmünohistokimyasal markalama endotel hücreleri, düz kas hücreleri, perisitler, kan damarları ve lenf damarlarının varlığını teyit. İçindeAyrıca bu yöntem, BSI-lektin ile dokuları etiketleme önce ve artan kapiller filizlenmesi ve damar yoğunluğu ile karakterize serum veya büyüme faktörü uyarılmasından sonra yerel ağ bölgelerin time-lapse karşılaştırılmasına olanak sağlamaktadır. Ortak hücre kültürü modelleri ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, fizyolojik olarak uygun mikrovasküler ağlarda endoteliyal hücre soyu çalışmaları ve dokuya özel anjiyojenik madde değerlendirilmesi için bir araç sağlar.

Kültür içinde 3 gün sonra, dokular sıçan mezenter kültürü modeli (Şekil 2a) mikro-damar canlılığını gösteren bir ölü / canlı canlılığı / sitotoksisite kiti ile etiketlenmiştir. mezenterinde mevcut hücrelerin çoğu endotel hücrelerinin mikrovasküler segmentlerde konumlarına göre belirlenen edildi kültürde canlı kalmıştır. Endotel hücre çoğalması ayrıca lektin / BrdU etiketleme (Şekil 2D) ile teyit edilmiştir. Damarlar boyunca düz kas hücresi ve perisit var...

Anjiyogenez, fizyolojik olarak ilgili bir ortamda araştırılması gereken çok hücreli, çok sistemli etkileşimleri içerir. Bu çalışmanın amacı, sıçan mezenter kültürü modelinin, anjiyogenez sırasında sağlam mikrovasküler ağların hızlandırılmış karşılaştırmalarını yapma yeteneğini göstermektir.

bir<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Yöntem kültürlü Rat Mezenterik Mikrovasküler Ağları Time-Lapse Görüntüleme için

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Bu deneyin genel amacı, parazit endotel hücresi etkileşimlerini, kan-lenfatik endotel hücresi bağlantılarını veya anti-anjiyojenik ilaç etkilerini değerlendirmek için, mikrovascular ağ yeniden şekillenmesinin ex vivo zaman atlamalı (time-lapse) incelemesinde sıçan mezenterik kültür modelinin kullanımını göstermektir. Bu yöntem, mikrodamarların nereye büyüyeceklerini nasıl bildikleri ve endotel hücre segmentlerinin akıbeti dahil olmak üzere, mikrodamar yeniden şekillenmesi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, gerçek ve bozulmamış mikrovasküler ağların ex vivo büyüme öncesinde ve sonrasında görüntülenebilmesidir.Prosedürü, yöntemi geliştiren laboratuvarımızdaki lisansüstü öğrencisi Sadegh Azimi uygulamalı olarak gösterecektir. İşleme, steril ve emici bir alt pedi yerleştirip üzerine etanolle sterilize edilmiş bir pleksiglas platformu ve platformun üzerine ise anestezi uygulanmış yetişkin erkek bir sıçanı yerleştirerek başlayın. Sıçanın tıraş edilmiş karın bölgesini önce iki adet %70 isopropyl alcohol mendiliyle, ardından povidon-iyod ile dezenfekte edin.Sternumun bir inç altından başlayarak, bir skalpel yardımıyla deri, bağ doku ve

an-ex-vivo-method-for-time-lapse-imaging-cultured-rat-mesenteric

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Fizyolojik anjiyogenez ve yoksun Normal erişkin vaskülarize memeli doku çalışma için kullanılan cerrahi müdahaleye maruz kalmamış: (i) başlatılması ve test ajanların intraperitoneal uygulanması aşağıdaki anjiyogenez geliştirilmesi; ve sistemik uygulanması aşağıdaki (ii) anjiyogenez değişiklik Test ajanlar seçilir.

Rat mezenter Anjiyogenez Testi

Bu makale sıçan mezenter anjiogenezisi teşvik için basit bir model tanımlamaktadır. Modeli aşağı tek hücre düzeyine kadar tüm mikrovasküler ağlarının yüz görselleştirme tr sağlayan bir doku nispeten kısa bir süre boyunca kılcal filizlenmesi, damar alanı ve damar yoğunluğu dramatik artış üretir.

Sıçan mezenter eksteriorizasyon: Anjiogenez ilgilendim Hücresel Dinamikler araştırılması için Bir Model

Burada iki boyutlu zaman atlamalı görüntü dizileri içinde olumlu sinyal bölgelerine atanan en uygun elips sıralama dayanan faiz analiz protokolünün yeni bir bölge gösterilmiştir. Bu algoritma kapsamlı az kullanıcı girişi ve önyargı ile fizyolojik Ca 2 + sinyalleri analiz müfettişleri sağlayabilir.

Dinamik Ca Otomatik Analizi<sup&gt; 2 +</supGörüntü Dizilerinde&gt; Sinyaller

Vasküler hücre fonksiyonu, hücre içi habercilerin aktivitesine bağlıdır.  Burada tarif edilen, izole bir aortun bireysel endotel ve düz kas hücrelerinde fizyolojik ve farmakolojik uyaranlara yanıt olarak hücre içi kalsiyum ve nitrik oksit seviyelerinin ölçülmesine izin veren bir ex vivo iki foton görüntüleme yöntemidir.

Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Bir İzole Sıçan Aort Kullanım ve Endotel Nitrik Oksit Üretimi ve düz kas hücreleri

Modifiye edilmiş Landis tekniği, mikroperfüzyon teknikleri kullanılarak kontrol ve test koşulları altında normal ve genetik olarak modifiye edilmiş sıçanların mezenterindeki tek tek mikro damarların hidrolik iletkenliğinin eşleştirilmiş ölçümünü sağlar. Fizyolojik koşullar altında mikrodamar geçirgenliğini ve transvasküler değişimi düzenleyen mekanizmaları değerlendirmek için uygun bir yöntem sağlar.

Şekilde, mikro Tekniği Sıçan mezenter mikrodamar geçirgenliği Yönetmelik Araştırma

Anestezi uygulanmış farelerde intravital konfokal mikroskopi kullanarak kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında mezenterik venlerdeki nötrofillerin ve monositlerin davranışını izlemek için bir protokolü detaylandırıyoruz.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Birincil insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler), bir mikroakışkan ağ cihazı içinde birleşecek şekilde büyütüldü. Endotel hücre bağlantısı ve F-aktin dağılımları gösterildi ve adenozin trifosfata (ATP) yanıt olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve nitrik oksit üretimindeki değişiklikler, bireysel hücre seviyelerinde gerçek zamanlı olarak ölçüldü.

Gelişim ve karakterizasyonu<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; I</sub&gt; Ve Nitrik Oksit Üretimi

Bu el yazması sıçan beyin direnç arterlerin vasküler işlevinde değerlendirilmesinde vitro video mikroskobu iletişim kurallarını açıklar. El yazması da microvessel yoğunluğu fluorescently etiketli lektin ve doku perfüzyon lazer Doppler Flowmetry kullanarak değerlendirmek için teknikler açıklanır.

Sıçan izole direnç arter Video mikroskobu kullanan vasküler kontrol mekanizmalarının değerlendirilmesi

Bu el yazması arteriyoller elektrofizyolojik, kalsiyum görüntüleme ve baskı myography çalışmalarda kullanılan fare retina üzerinden yalıtım için basit bir protokol açıklar.

Retina arteriyoller yalıtım Ex Vivo Hücre fizyolojisi çalışmaları için

Bu protokol, mezenterik iskemi-reperfüzyon hasarını indüklemek ve mezenterik venüllerde nötrofil hücre dışı tuzakları (NET'ler) intravital mikroskopi kullanarak görüntülemek için bir yöntem sunar. Superior mezenterik arterdeki kan akışı 1 saat boyunca kısıtlandı, ardından reperfüzyon yapıldı ve lökosit yapışması ve NETosis'in doğrudan ölçülmesine izin verildi.

Mezenterik İskemi-Reperfüzyon Yaralanması Sonrası Mezenterik Venüllerde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İntravital Mikroskopi ile Görüntülenmesi

Bu protokol, ışık tabakası floresan mikroskobu kullanılarak kantitatif tam montajlı üç boyutlu vasküler görüntüleme için hızlı bir yöntem sunar. Yöntemin etkinliği, civciv embriyo modelinin faringeal ark arter sistemi kullanılarak, hesaplamalı akışkanlar dinamiği yoluyla ölçülen hemodinamik kuvvetler ile gösterilmiştir.

Kantitatif Çalışmalar için Küçük Hayvan Damar Sisteminin Hızlı Tam Montajlı Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Keşfedin sıçan mezenter kültür modelini mikrovasküler ağların time-lapse görüntülenmesi için. Bu yöntem anjiyogenezde endotel hücre etkileşimlerini ve anti-anjiyojenik ilaçların etkilerini değerlendirmeye olanak tanır.

bir

Daha fazla video keşfet