Name: QTL Haritalama ve CRISPR / Cas9 Düzenlemesi, bir İlaç Direnç Geninin Belirlenmesi için emToksoplasma gondii /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Keşfedin Toxoplasma gondii'de sinefungin direnci genini belirlemek için QTL haritalama ve CRISPR/Cas9 düzenleme yöntemlerini. Bu teknik, parazitolojide ilaç direnci mekanizmalarını anlamaya katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu protokollerin dayandığı orijinal yayına yaptıkları katkılarından ötürü L. David Sibley ve Asis Khan&#39;a teşekkür etmek isteriz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü AI108721 tarafından finanse edildi.

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu protokoller, kombine edildiğinde T. gondii&#39;de bir ilaç direnç geninin tanımlanmasına izin veren çeşitli yöntemler sunmaktadır. Özellikle ikisi, projeye ayrılmaz, nispeten tecrübeli QTL haritalama yöntemi ve yakın zamanda geliştirilen CRISPR / Cas9 gen düzenleme yöntemi. Lander ve Botstein 1989&#39;da genetik lokusları fenotiplerle ilişkilendiren QTL haritalamasını gösteren etkili gazetelerini yayınladılar. Daha yakın zamanda 2012&#39;de Dounda ve Charpentier, Streptococcus pyogenes 22&#39;deki CRISPR / Cas9 düzenleme sistemini, T. gondii 13 , 17 dahil olmak üzere birçok farklı modelde hızla genetik bir araç olarak uyarlanmıştı. Burada, QTL haritalamasının sonuçta WGS tabanlı SNP tespiti ile tanımlanan ilaç direnci mutasyonunu içeren lokusunu tanımladığı ve CRISPR / Cas9 düzenleme yoluyla sağlanan iki usul de faydalıydı<html> SNR1&#39;in sinefungin ilaç direnç geni olduğunu onaylamak için. ME49-FUDR r X VAND-SNF r çapraz 8 orijinal olarak bir virulans fenotipi 19&#39;u sorgulamak için geliştirildi, ancak ebeveyn suşlarının, nedensel genin bilinmediği ek fenotipik bir farka, VAND ebeveynde sininefungine direncine sahip olduğu da oldu. Bu, ebeveynlerde ek fenotipik farklılıklar görüldüğünde, yeniden melezleştirilebilmeleri için haçların bir yararı olduğunu vurgular. Virülansla ilgili birçok genin 37 , 38 , 39 , 40lu çoklu fenotipleri haritalamayla bulunduğu başka Tip Toxoplasma çapraz, tip 2 x tip 3 için durum böyledir. Bugüne kadar, dört farklı T. gondii haçı tanımlanmış ve fenotiplerden sorumlu genleri haritalamak için kullanılmıştırSs = &quot;xref&quot;&gt; 8 , 37 , 41 , 42 , bunların hepsi, genetik temel bilinmeyen yeni fenotipleri haritalamak için tekrar kullanılma potansiyeline sahiptir. Bu çizgiler boyunca, bilinen global genetik çeşitliliği temsil eden 62 T. gondii suşunun genomları sıralanmıştır 43 . İlginç fenotiplerde farklılık gösteren suşlar için bu havuzdan yeni çaprazlar yapılabilir. QTL haritalamanın avantajlarını vurguladıktan sonra, bir haç oluşturulmasının küçük bir taahhüt olmadığı söylenebilir. Nedensel genleri tanımlamak için kullanılabilecek diğer yöntemler de vardır. Güçlü bir teknik, fenotipler için taranabilen mutantlar oluşturmak için kimyasal mutajenez kullanır. Nedensel geni bulmak için, mutantlar ya kosmid kütüphaneleri 44 ile tamamlanabilir ya da nedensel mutasyonu bulmak için genom resequencing yöntemleri kullanılabilir 45 . Ay içinColeman ve arkadaşlarının yaptığı iki JoVE makalesine bakın . Ve Walwyn ve ark. Bu yaklaşımları özetleyen 46 , 47 . Nedensel SNF r mutasyonunun tanımlanmasına yol açan adımların çoğu (Protokoller 2 ve 3), akademik kullanım için serbestçe temin edilebilen yazılımlarla yapılan hesaplama yöntemlerine güvenir. Her basamak için ayrıntılı komutlar sağlanır ve uygun dosyalarla çalıştırıldığında, kullanıcının nedensel SNF r SNP&#39;yi bulmak için gerekli olan veri kümelerini yeniden oluşturmasına izin verir. Komutlardaki bazı söz dizimlerinin, kullanıcı tercihine göre değiştirilebilen dosya adlarına veya dizin yapısına ($ PATH) işaret ettiğini unutmayın. Burada verilen komutlar kesinlikle ÇTL analiz ve WGS tabanlı SNP tanımlama ile bir haç analiz yollarını tüketmemesine rağmen, bu makalede açıklanan deney tekrarlamak için yeterince kapsamlı ve kullanıcı m<html> Bu yaklaşımların adım adım bir şekilde nasıl kullanıldığını bilen cevher. QTL haritalama ve WGS dizisi tabanlı SNP bulgusu, bir aday SNF r genini tanımlamak için yeterli olmasına rağmen, ilacın direncindeki rolünü doğrulamak için ek deneylere ihtiyaç vardır. Bu, ikisi de CRISPR / Cas9 gen editörü kullanılarak elde edilebilen, gen parçalanması veya nakavt teknikleri vasıtasıyla ikna edici şekilde gösterilebilir. CRISPR / Cas9&#39;un Indel mutasyonları üretmek veya T. gondii&#39;de bir hedef genin içine transgenik yapılar yerleştirmek için ayrıntılı yöntemleri verilmiştir. CRISPR / Cas9&#39;un sunduğu hedefleme özgüllüğü, geleneksel yöntemlere kıyasla gen düzenleme verimliliğini artırır. Ayrıca, bu, verimli bir şekilde, daha önce değiştirilmesi zor olan genetik çalışmalar için laboratuarda uyarlanmamış suşların kullanılmasını mümkün kılmıştır 13 . Bebeklik döneminde, CRISPR / Cas9 zaten genin kesintiye uğraması için kullanılmıştırLass = &quot;xref&quot;&gt; 2 , 13 , 17 , 18 , 48 , 49 , genleri 17 etiketleyin ve T. gondii&#39;de 16 , 19 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 gen nakavtlerini yapın , Gelecekteki diğer birçok çalışma için. SNR1&#39;in inaktivasyonunun sinefungin direncine yol açtığının keşfi, SNR1 lokusunu, transgen takılması veya genetik tamamlama için umut verici bir yer haline getirir. Transgenin SNR1 lokusuna entegrasyonunu yönlendirmek için CRISPR / Cas9 aracılı gen hedeflemenin başarısını en üst düzeye çıkarmak için aşağıdaki hususlar dikkate alınmalıdırDeneysel tasarım sırasında kırmızı. İlk olarak, bir seçim markeri, suş yapımının etkinliğini arttırmak için transjenik yapıya dahil edilmesi önerilir. Bir seçim işareti dahil edilirse, hem pozitif hem negatif seçim kullanılabilir, böylece çiftli seçilen parazitlerin neredeyse% 100&#39;ü, SNR1 lokusunda entegre edilmiş GOI ile transgenik olur. Buna karşılık, eğer transjenik yapı ek seçilebilir özellikler içermezse ve SNR1 lokusundaki negatif seçime dayanıyorsa, başarılı transgenesisin etkinliği büyük ölçüde CRISPR plasmidinin ve transgenik yapının kotransfeksiyonunun verimliliğine bağlıdır. İkincisi, homolog olmayan bir DNA fragmanının CRISPR / Cas9 aracılı bölgeye özgü entegrasyonu sıklıkla tamamlama ve transgenez için kullanılır, ancak, bu tür durumlarda her iki yönde de olabilir, ekleme yöneliminin garanti edilemeyeceği unutulmamalıdır. Bu, probleme neden olabilirMs bazı uygulamalar için. Örneğin, farklı gen alellerine sahip bir mutantı tamamlamak için, tüm alellerin aynı yönde yerleştirildiğinden ve oryantasyonda tutarsızlıkların ekspresyon farklılıklarına neden olabileceğinden emin olmak zordur. Bu tür uygulama için, uygun entegrasyon yönelimini sürdürecek SNR1 lokusuna homolog diziler içeren DNA yapıları önerilir ( Şekil 6 ). Üçüncü olarak, transfeksiyon sırasında, CRISPR plasmid ile transgenik DNA molekülü arasındaki oran, başarılı bir transgenik suş yapımı için kritik önem taşır. Bu oran seçim stratejilerine göre ayarlanmalıdır. Aşağıdaki yönergeler önerilir: 1) Transgenik yapı bir ilaca dirençli işaretleyici içeriyorsa ve ilgili ilaç transgenik parazitleri üretmek için kullanılan tek seçimse, yani sinefungin kullanılmazsa, transjenik yapı ile CRISPR plazması arasındaki önerilen molar oranKimlik 1: 5. Bu durumda daha fazla CRISPR plazmidinin kullanılması, transgenik yapı kazanan parazitlerin CRISPR plazmidini de alması olasılığını artırır, bu nedenle ilaca dirençli parazitlerin, CRISPR hedefleme alanına eklenen işaretleyiciye sahip olma olasılığı daha yüksektir. Oran ters çevrilirse, transgenik yapı kazanan parazitlerin çoğunda CRISPR plasmid bulunmaz. Sonuç olarak, uyuşturucuya dirençli parazitlerin büyük çoğunluğu, CRISPR / CAS9 aracılı bölgeye özgü eklemeyle ilişkili olmayan rasgele entegrasyon vasıtasıyla transjenik yapı elde eder. 2) Transjenik yapı bir ilaca dirençli işaretleyici içeriyorsa ve karşılık gelen ilaç transjenik parazitleri seçmek için sinefungin ile birlikte kullanılıyorsa, transgenik yapı ile CRISPR plazmid arasındaki önerilen molar oran 1: 1&#39;dir. Bu strateji, transjenik suş yapımının en yüksek etkinliğini sağlar. 3) Transgenik yapı, negatif seçime bağlı olarak seçilebilir bir yapıcı içermiyorsaTransgenik parazitlerin elde edilmesi için sinefungin tarafından tek başına, transjenik yapı ile CRISPR plasmid arasındaki önerilen molar oran 5: 1&#39;dir. Bu tasarımın mantığı yukarıdaki ilk kılavuzdaki ile aynıdır. Protokol 5&#39;teki hem pirimetamin hem de sinefungin seçildiğinden, DHFR * mini geni ve CRISPR plasmidini hedefleyen SNR1 arasındaki oran 1: 1 olarak ayarlandı. Birlikte ele alındığında, burada özetlenen yöntemler, SNR1 2&#39;yi tanımlayan orijinal yayında anlatılamayacak bir ayrıntı seviyesine sahiptir. Bu protokoller; Özellikle, komut satırı sözdizimi, kullanılan programların ardışık düzenleri ve CRISPR / Cas9&#39;un kullanılması, fenotiplerden sorumlu yeni genleri belirlemek için gelecekteki çalışmalara yardımcı olmalıdır.

Ev sahibi aralığı, bir parazit prevalansının kapsamını belirler. Bazı parazitlerin buluntularını sınırlayan çok spesifik ev sahibi gereksinimleri vardır, diğerleri genelcilerdir. Böyle bir genelci Toxoplasma gondii ( T. gondii) &#39;dir . Bu parazit, tüm memelilere ve birçok kuşa bulaşabildiği için dünya çapında bulunur. İnsanlar da duyarlıdır ve tahminen küresel nüfusun yaklaşık 1 / 3&#39;ünün enfekte olduğu tahmin edilmektedir. Neyse ki, sağlam bir bağışıklık tepkisi normalde parazitin büyümesini kontrol eder, ancak bağışıklık sisteminin tehlikeye atıldığı durumlarda parazite kontrol edilemeyecek şekilde büyür ve genellikle ensefalik hastalıklara neden olabilir. Ayrıca, bu parazit, önceden enfekte olmamış kadınlara, parazit yayılımını hızla sınırlamak için bağışıklık sisteminden yoksun oldukları için, enfekte olmuşlarsa, doğumsal hastalıklara neden olabilir. Buna ek olarak, görme kaybına neden olabilecek oküler toksoplazmoz yükü vardır 1 . Bu reaso içinNs T. gondii , çalışma odağı haline geldi ve çalışması için geliştirilen birçok moleküler yöntemden dolayı Apicomplexan parazitleri için bir model oluşturdu. Burada tartışılacak iki yöntem Quantitative Trait Locus (QTL) haritalama ve Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR) / Cas9 gen editörüdür. QTL haritalama ve CRISPR / Cas9 düzenleme, sırasıyla, T. gondii virulans genlerini belirlemek ve / veya karakterize etmek için önceki çalışmalarda kullanılan ileri ve geri genetik yaklaşımlardır. Burada, bu yöntemler bir sinüs fınnın direnci (SNF r ) geni, TgME49_290860 ve onun ortologları ( SNR1 olarak açıklanmıştır) 2&#39;nin işlevini tanımlamak ve doğrulamak için birleştirilmiştir. T. gondii çok çeşitli ara konaklara bulaşmasına rağmen, yaşam döngüsünü tamamlamak için zararlıların bağırsak epitel hücrelerini geçmesi ve bulaştırması gerekir. Kediler, parazitin barındırdığı kesin ev sahipliği yaparlar.Ekspresyon aşamaları üretilir ve mayozla genetik rekombinasyon oluşur. Bir QTL çalışması yapmak için bir genetik çapraz oluşturmalı ve Toksoplazma durumunda bu, fenotipik bir özellik olan ebeveyn lekelerinde farklı olan iki farklı parazit türü geçirerek, bir kedi vasıtasıyla rekombinant nesli üretmektir 3 . Kedilere beslenmeden önce, ebeveyn suşları, dölün çift ilaç seçimi ile rekombinantların daha verimli tanımlanabilmesini sağlamak için ayrı ilaçlara dirençlidir. Bu amaçla T. gondii&#39;de üç ilaç kullanılmıştır; Direnç geni 5 olduğu ürasil fosforibosil transferaz ( FUDR ), direnç geni 6 olan Adenosin Kinaz ( AK ) ve sinefungin (SNF) olan adenozin arabinosid (ARA) 7 dir . Birkaç genetik haç varT. gondii için yaratıldı fakat sadece ME49-FUDR r X VAND-SNF r çaprazının 24 nesli, bütün genom sıralama (WGS) 8 kullanılarak genotiplendi. Bu, VAND ebeveyni, ilaca duyarlı VAND (VAND-SNFs) suşunun kimyasal mutajeneziyle sinefungine dirençli hale getirildiğinde, bu çapraz kullanılarak SNF direnç geninin haritalanması ve tanımlanması imkânını açtı ve VAND referans genomu, VAND- SNF s soyundan ötürü, soyu soyunun sinefungini dirençli hale getiren kalıtsal ebeveyn VAND-SNF r mutasyonu da dahil olmak üzere, soy WGS ve VAND-SNF referans genomu arasındaki tüm polimorfizmlerin tanımlanmasına izin verilir. SNF r soyındaki nedensel tek nükleotid polimorfizmini (SNP) tanımlamak için, verileri analiz etmek için çeşitli hesaplama tabanlı açık kaynak kaynakları kullanılabilir. ME49-genetik harita oluşturmak için,FUDR r X VAND-SNF r Çapraz REDHORSE yazılım paketi 9 , genetik geçişlerin genomik konumlarını doğru bir şekilde saptamak için anne ve babanın WGS hizalamalarını kullanmaktadır. Bu haritalama bilgisi daha sonra, Q istatistik programlama yazılımındaki &#39;qtl&#39; ​​paketi 10 ile uyumlu bir veri kümesi biçimlendirmek için fenotipik verilerle (yavrudaki SNF r ) birleştirilebilir ve burada QTL taraması ile ilişkili önemli lokusları ortaya çıkarabilir fenotip. QTL lokusunda yer alan nedensel SNP&#39;yi tanımlamak için, neslin WGS okumaları, SNP&#39;lerin VarScan mpileup2snp varyant arayan programı 12 kullanılarak çağrılabilir Bowtie 2 uyum programı 11&#39;i kullanarak sinüs fungus hassas VAND genomuna ayrı ayrı hizalanabilir. Bu SNP&#39;leri kullanarak, QTL lokusundan sonra SNF r&#39;de var olan polimorfizmler taranabilir ancak taranamazSNF&#39;nin soyunda. Bir genin kodlama bölgesinde tanımlanan nedensel SNP ile, SNF s geninin genetik modifikasyonu, ilaç direnci fonksiyonunu doğrulamak için bir SNF s soyunda gerçekleştirilebilir. CRISPR / Cas9 genom düzenleme sistemi kısa süre önce Toxoplasma 13&#39;te kuruldu ve bu parazitin karmaşık biyolojisinin araştırılması, özellikle laboratuar dışı uyarılmış suşlardaki genetik çalışmalar için önemli araçlar eklendi. WT Toxoplasma hücrelerinde yüksek derecede aktif Homolog Olmayan Sona Katlanma (NHEJ) aktivitesi nedeniyle, hedeflenen genom modifikasyonunun gerçekleştirilmesi zordur çünkü eksojen olarak girilen DNA son derece yüksek frekansta 14 genoma rasgele entegre edilmiştir. Lokusa spesifik modifikasyonun başarı oranını arttırmak için, homolog rekombinasyonun verimliliğini arttırmak ve / veyaE NHEJ etkinliği 15 , 16 . Bu yaklaşımlardan bir tanesi CRISPR / Cas9 sistemi. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, CRISPR / Cas9 sistemi, bölgeye özgü değişiklikleri uygulamada etkin ve tasarım için kolay 13 , 17 , 18 . Buna ek olarak, parazite 13 , 19 ekstra bir değişiklik yapmadan herhangi bir Toxoplasma suşunda kullanılabilir. CRISPR / Cas9 sistemi, 20 , 21 ve 22 fajları gibi mobil genetik elementlerin istilasını savunmak için kullanan Streptococcus pyogenes&#39;in uyarlanabilir bağışıklık sisteminden kaynaklanmaktadır. Bu sistem, RNA-kılavuzlu DNA endonukleaz enzimi Cas9&#39;u, hedefe çift sarmallı DNA kopması (DSB) sokmak için kullanır; bu, daha sonra repa olurHata endeksli NHEJ tarafından kısa indel mutasyonları vasıtasıyla hedef genlerin inaktive edilmesi veya hedef lokusunu tam olarak tasarlanan 23,24 ile değiştirmek için homolog yönlendirmeli rekombinasyon yoluyla tahliye edilir. Hedef spesifıklık, hedef DNA 22&#39;ye % 100 homologluk gösteren ayrı ayrı tasarlanan 20 nt diziyi içeren tek kılavuz RNA (gRNA) adlı küçük bir RNA molekülü tarafından belirlenir. GRNA molekülü ayrıca Cas9 tarafından tanımlanan, nükleazı hedef bölgeye yönlendiren ve Protospacer Bitişik Motifi (PAM, sıra &#39;NGG&#39;) olan 25 , 26 içeren imzalar içerir. Bu nedenle, gRNA molekülü ve PAM dizisi birlikte çalışarak genomda Cas9 bölünme yerini belirler. Biri, bölünme için farklı siteleri hedeflemek için kolayca gRNA dizisini değiştirebilir. CRISPR / Cas9 sistemi ilk kez Toxop&#39;da geliştirildiğindeLazanya, Cas9 nükleazını ve gRNA molekülünü ifade eden tek bir plasmid, hedefleme bölgesinde 13 , 17 DSB&#39;yi tanıtmak için kullanıldı. CRISPR / Cas9 sistemi, sadece homolog rekombinasyonla değil aynı zamanda ekzojen DNA 13&#39;ün homolog olmayan entegrasyonu ile alana spesifik genom modifikasyonunun verimliliğini büyük ölçüde arttırdığı gösterilmiştir 13 . NHEJ aktivitesi içeren vahşi türlerde bunu yapar. Bu nedenle, bu sistem esasen etkin genom düzenlemesi için herhangi bir Toxoplasma suşunda kullanılabilir. Tipik bir deneyde, hedefe spesifik CRISPR plazmiti ve hedefi değiştirmek için kullanılan DNA parçası, parazitlere birlikte transfekte edilir. Hedefi modifiye etmek için kullanılan DNA parçası, hedef lokus için homolog diziler içeriyorsa, homolog rekombinasyon, hedefin hassas şekilde değiştirilmesine izin vermek için CRISPR / Cas9 tarafından tanıtılan DSB&#39;yi onarmak için kullanılabilir. Öte yandan, eğer intRoduced DNA fragmanı homolog sekans içermez, yine de CRISPR / Cas9 hedefleme sitesinde entegre edilebilir. Sonuncusu genellikle seçilebilir işaretlerin eklenmesi veya negatif seçim 13&#39;e izin veren lokuslarda mutantların tamamlanması ile genlerin bozulması için kullanılır. Burada, SNR1 lokusu, CRISPR / Cas9&#39;un gen parçalanması ve transjenik parazitlerin üretimi için nasıl kullanılabileceğini göstermek için bir örnek oluşturmaktadır.

<table><tbody><tr><td>T25 şişeleri</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Sünnet Derisi Fibroblastları (HFF)</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1041</td><td></td></tr><tr><td>T. gondii ME49 suşu</td><td>ATCC</td><td>50840</td><td></td></tr><tr><td>T. gondiiVAND suşu</td><td>ATCC</td><td>PRA-344</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Sodyum Bikarbonat İçermez)</td><td>Yaşam Bilimleri</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS) Premium Sınıf</td><td>VWR International</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin&nbsp; 200 mM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin (10 mg/mL)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şişeler için 15710064 Hücre Sıyırıcı</td><td>VWR International</td><td>10062-904</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga 10 mL</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Künt iğneler 22 G x 1 "</td><td>BRICO Ürünleri</td><td>BN2210</td><td></td></tr><tr><td>Çekirdek Gözenek Filtresi 3.0 ve mikro; m, 25 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>110612</td><td></td></tr><tr><td>Swin-Lok Filtre Tutucu 25 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>420200</td><td></td></tr><tr><td>Hematitometre</td><td>Propper MFG</td><td>90001</td><td></td></tr><tr><td>Sinefungin</td><td>Enzo Yaşam Bilimleri</td><td>380-070-M001</td><td></td></tr><tr><td>Ar-Ge</td><td>R Vakfı</td><td>https://www.r-project.org/</td><td></td></tr> <tr><td>J/qtl</td><td>Churchill Grubu</td><td>http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml</td><td></td></tr><tr><td>Papyon2</td><td>John Hopkins Üniversitesi</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td><td></td></tr><tr><td>NCBI SRA Araç Seti</td><td>NCBI</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc</td><td></td></tr><tr><td>SAMtools</td><td>Wellcome Trust Sanger Enstitüsü</td><td>http://www.htslib.org/</td><td></td></tr> <tr><td>VarScan</td><td>Washington Üniversitesi, St Louis</td><td>http://varscan.sourceforge.net/</td><td></td></tr> <tr><td>MUMmer</td><td>JCVI & Univ Hamburg</td><td>http://mummer.sourceforge.net/</td><td></td></tr> <tr><td>pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #54467</td><td>T. gondii UPRT genini kesmek için CRISPR plazmidi</td></tr><tr><td>pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #59855</td><td>T. gondii TG*_290860 SNR1 genini kesmek için CRISPR plazmidi</td></tr><tr><td>pUPRT::D HFR-D</td><td>Addgene</td><td>Plazmid #58528</td><td>DHFR* mini gen</td></tr><tr><td>Q5 Bölgeye Yönelik Mutajenez Kiti şablonu&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E0552S</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep</td><td>Kiti QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>LB Et</td><td>Suyu Fisher Scientific</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat dibazik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin triposhpate (ATP)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>L-glutatyon (GSH)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 Elektroporasyon Sistemi</td><td>BTX</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporasyon Küveti ve nbsp; 4 mm</td><td>Harvard Aparatı</td><td>45-0126</td><td></td></tr><tr><td>Crytal Violet</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21932-14</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu TC plakası</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu TC plakası</td><td>Corning</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>Kapak camı 12 mm yuvarlak</td><td>VWR International</td><td>89015-724</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu TC plakası</td><td>Corning</td><td>353075</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Montaj Klonlama Kiti (Çok parçalı)</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Yüksek Kaliteli Polimeraz&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Pirimetamin</td><td>TCI AMERİKA</td><td>P2037-1G</td><td>Pirimetamine dirençli parazitler kullanırken kürasyon kullanın - Protokole bakın</td></tr></tbody></table>

qtl haritalama ve crispr / cas9 düzenlemesi, bir İlaç direnç geninin belirlenmesi için<emtoksoplasma gondii</em

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Bilimsel bilgi, özünde mevcut teknolojilere ve yöntemlere bağlıdır. Bu makale, Apicomplexan parazit Toxoplasma gondii&#39;de bir ilaç direnci geninin tanımlanması ve doğrulanmasına izin veren iki yöntem, bir Whole Genome Sequence (WGS) tabanlı genetik harita kullanan Nicel Trait Locus (QTL) haritalama yöntemi ve yöntem Kümelenmiş Regularly Arası Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR) / Cas9 tabanlı gen düzenleme. QTL haritalama yaklaşımı, bir genomik bölge (ler) ve bir fenotip arasında bir korelasyon olup olmadığını test etmeyi sağlar. Bir QTL taramasını çalıştırmak için iki veri seti, bir rekombinant çaprazın soyuna dayalı bir genetik harita ve bu çaprazın her bir nesli içinde değerlendirilen nicelenebilir bir fenotip gerekir. Bu veri kümeleri daha sonra, fenotip ile ilişkili önemli yerleri tanımlamak için bir QTL taraması üreten R / qtl yazılımı ile uyumlu olacak şekilde biçimlendirilir. Bu arama işlemini büyük ölçüde daraltabilirse deOlası adayları indekslemek için QTL&#39;ler nedensel genin tanımlanması gereken bir takım genleri içeren bölgelere yayılır. Soyun WGS&#39;sine sahip olmak, gen düzeyinde nedensel ilaç direnci mutasyonunu tanımlamak için kritik önem taşıyordu. Tanımlandıktan sonra, aday mutasyon uyuşturucuya duyarlı parazitlerin genetik manipülasyonu ile doğrulanabilir. Genetik olarak T. gondii&#39;yi modifiye etmek için en kolay ve etkili yöntem CRISPR / Cas9 sistemidir. Bu sistem, hem tek bir plasmidde hem de genomik hedefi tamamlayıcı 20 bp dizisini içeren tek bir kılavuz RNA (gRNA) ve hedefe bir çift sarmal DNA kopması (DSB) üreten Cas9 endonükleazı kodlayan sadece 2 bileşenden oluşur; Onarımı, kırılma bölgesi çevresindeki dizilerin eklenmesine veya silinmesine izin verir. Bu makale sinefungin direncinden sorumlu geni doğrulamak ve transgenik parazitler oluşturmak için CRISPR / Cas9 tabanlı genom düzenleme araçlarını kullanmak için ayrıntılı protokoller sağlar.

Bu makale, ilaç direncinden sorumlu bir genin tanımlanması için art arda kullanılabilen çeşitli yöntemleri ayrıntılı olarak özetlemektedir ( Şekil 1 ). ME49-FUDR r X VAND-SNF r çaprazının 24 nesli, Protokol 1&#39;de tarif edildiği gibi ilaç sinefunjinine direnç açısından değerlendirildi. Genetik haritayı ve soyun SNF r fenotipini kullanarak bir QTL taraması R / Qtl - Protokol 2 ( Şekil 2 ). Bu, yaklaşık 1 Mbp&#39;yi kapsayan IX kromozomunda bir belirgin zirveye neden oldu. Bu bölgede nedensel mutasyon bulunduğu gerçeğidir. Nedensel mutasyonu belirlemek için, WGS&#39;nin yavrularından gelen okumalar, Bowtie2 - Protokol 3.1 kullanılarak VAND-SNF&#39;nin referans genomu ile uyumlu hale getirildi, SNP&#39;ler VarScan mpileup2snp - Protokol 3.2 kullanılarak çağrıldı ve VAND genomundaki QTL loküsü MUMmer - ProtocOl 3.3. QTL lokusundaki döl SNP&#39;leri çıkarıldı ve SNF r nesli bir SNP&#39;ye sahipken SNF s yok bir desen için çıkarıldı ve tarandı, bu da döl SNP&#39;leri VAND-SNF&#39;nin referans genomuyla karşılaştırıldığında elde edildiği için mümkün oldu ( Şekil 3 ) . Yalnızca bir SNP, SNR1 olarak adlandırılan bir varsayılan amino asit taşıyıcı geninde bir erken durdurma kodonuyla sonuçlanan bu modeli eşleştirdi. SNR1&#39;in SNF r direnç geni olduğu teyidi, CRISPR / Cas9 sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. T. gondii geni düzenlenmesi için tasarlanmış yeni bir CRISPR / Cas9 plazmiti, dölgede tanımlanan SNF r mutasyonunun yakınında SNR1 genini hedefleyen bir gRNA içeren yapılmıştır - Protokol 4 ( Şekil 4A ). CRISPR / Cas9 plazmidini hedefleyen SNR1 , bir SNF s WT parazit suşuna elektroporasyona tabi tutuldu ve kült sırasında dirençli mutantlar elde edildi.0.3 uM sinefungin içerisinde üretildi. CRISPR / Cas9 plasmidini hedefleyen UPRT ile elektroporasyon yapıldığında SNF r parazitleri elde edilememiştir. Birkaç SNF r CRISPR mutantı klonlandı ve SNR1 gRNA hedefinin etrafındaki bölge dizildi. Her mutant, SNR1 geninin kodlama dizisini bozan bir indel içeriyordu ( Şekil 4B ). Bu yöntem, NHEJ ( Şekil 5) veya HR ( Şekil 6 ) - Ek Dosya 2 yoluyla SNR1 lokusuna bir hedefleme yapısı eklemek için de kullanılabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig1.jpg" /> Şekil 1: Protokollerde Açıklanan Denemeler İçin Şematik İş Akışı. ME49-FUDR r X VAND-SNF r çaprazını kullanarak SNF r geninin belirlenmesinde ve teyit edilmesinde ana adımlar, t&#39;de belirtilen uygun Protokollere atıfta bulunularak gösterilmiştir.Onun makalesi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig2.jpg" /> Şekil 2: R / qtl SNF r Fenotipinde QTL Taramasını çalıştırmak için kullanılan komutlar. Protokol 2&#39;de özetlenen komutlar, qtl paketini kullanarak R&#39;de çalıştırılmıştır. Temsilci komutlar ve çizimler gösterilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig3.jpg" /> Şekil 3: Nazik SNP&#39;nin Konumu. Döl WGS okumaları, Bowtie 2 ile birlikte VAND-SNF&#39;nin referans genomu ile uyumlu hale getirildi, SNP&#39;ler VarScan ile çağrıldı ve karşılık gelen<html> Ing VAND QTL lokusu MUMmer ile tanımlandı. QTL loküsünde yer alan SNP&#39;ler bir elektronik tabloya alındı ​​ve nedensel SNP tespit edildi. SNF r nesli (sarı), SNF sinsisi (yeşil), SNF r SNP (kırmızı) (bkz. Veri Dosyası 3 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig4.jpg" /> Şekil 4: SNR1&#39;in SNF r Geni olarak CRISPR / Cas9 kullanılarak onaylanması. ( A ) SNR1 lokusunda CRISPR / Cas9 indel mutasyonları (yeşil) indükledi. ( B ) SNR1&#39;deki temsilci, iki farklı SNR1 spesifik CRISPR plasmidinden (sırasıyla C5 ve C6) kaynaklanıyor. RH, WT suşudur ve C5 ve C6, SNF r mutantlarıdır. (B referans olarak alınmıştırS = &quot;xref&quot;&gt; 2). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig5.jpg" /> Şekil 5. CRISPR / Cas9 kullanılarak yerleştirme mutajenezi. ( A ) CRISPR / Cas9 aracılı bölgeye özgü entegrasyon ile SNR1 lokusuna tamamlayıcı veya transgenik genlerin eklenmesi. Eklenen DHFR * mini geninin olası iki oryantasyonu ve tanımlama için kullanılan primerler, F1 / 2 ve R1 / 2, tanısal PCR&#39;lerde kullanılan oligoların başlatma yerlerini temsil eder. ( B ) Bir snr1 :: DHFR * klonunun diagnostik PCR&#39;leri , RH bir WT kontrolü olarak kullanılır. GRA1p PCR, genomik DNA&#39;nın kalitesini şablon olarak kontrol eden bir kontrol olarak dahil edilmiştir. Yıldız işaretleri, spesifik olmayan bantlara sahip şeritleri gösterir (Şekil 5B referansen alınmıştırCe 2 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig6.jpg" /> Şekil 6: CRISPR / Cas9 kullanılarak gen nakavt. T. gondii&#39;de CRISPR / Cas9 aracılı homolog gen değişimi için klasik bir tasarım. Bu durumda yerleştirilen transgenin yönü sabittir. F1 / R1, F2 / R2 ve F3 / R3, tanı PCR&#39;lerinde kullanılan oligoların priming alanlarını temsil eder. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Veri Dosyası 1: ME49-FUDR r X VAND-SNF r Çapraz Dosya fVeya R / qtl, &quot;csv&quot; Formatında kullanın. R / qtl format = &quot;csv&quot; seçeneğiyle yüklenebilen bir .csv dosyası. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_1.csv" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a> Veri Dosyası 2: (chrid txt, genotype txt, markerpos.txt, mname.txt, fenonames.txt ve fenos.txt). ME49-FUDR r X VAND-SNF r Çapraz Dosyalar R / qtl &quot;gary&quot; Formatında kullanılır. Format = &quot;gary&quot; seçeneği ile R / qtl&#39;ye yüklenebilen altı .txt dosyası. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_2.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a> Veri Dosyası 3. SNF r&#39;de Progeny SNP&#39;li e-tablo r <stronG&gt; QTL Locus. Soy SNP&#39;leri içeren bir çalışma sayfası ve ebeveynlerin ve çarmıhın soyları ile fenotipik verileri içeren ikinci bir çalışma sayfası içerir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_3.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a> Ek Dosya 1: Ek Protokol Ayrıntıları. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_1_-_101916.docx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a> Ek Dosya 2: Protokol 5 - Negatif Seçimin SNR1 Lokusunda Genetik Tamamlama veya Transgenik Suş Oluşturma Kullanımı. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_2_-_101916.docx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a></a>

Detaylar, Toxoplasma gondii&#39;de bir ilaca direnç genini tanımlamak için bütün genom dizisi tabanlı bir genetik harita ile QTL haritalamasının nasıl kullanılacağı ve bunun, bir genomik hedefi verimli bir şekilde düzenleyen CRISPR / Cas9 sistemi ile nasıl doğrulanabileceği üzerine sunulmaktadır; bu durumda Ilaç direnci geni.

QTL Haritalama ve CRISPR / Cas9 Düzenlemesi, bir İlaç Direnç Geninin Belirlenmesi için<emToksoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Bu kantitatif özellik lokusu haritalama ve CRISPR/Cas9 genom düzenleme metodolojisinin genel amacı, Toxoplasma'da sinefungin direncinde rol oynayan bir geni tanımlamak ve ardından doğrulamaktır. Bu yöntemler; varyantların genetik temelleri, patogenez ve ilaç direnci gibi parazitolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniklerin temel avantajı, hassas QTL analizi için tüm genom dizileme verilerinin ve Toxoplasma'da etkili genetik manipülasyon için CRISPR/Cas9 genom düzenlemenin kullanılmasıdır.Prosedürü, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Dr. Robin Powellle gösterecektir. Toxoplasma gondii parazitleri, D10 medyumu ile T25 flasklara ekilmiş konfluent insan ön deri fibroblast veya HFF hücrelerinde büyütülür. Bireysel progeni klonlarının sinefungin direncini test etmek için, parazitlerin çoğunluğu konak hücreleri lizlemeye başlayana kadar her bir klonu yüksek parazit yoğunluğuna ulaşana kadar büyütün.Metin protokolünde açıklandığı şekilde parazit çözeltisini hazırladıktan sonra, bir pipet kullanarak 2,5 x 10⁵ paraziti, 0,3 µM çalışma konsantrasyonunda sinefungin ilaç içeren D10 besiyerli yeni bir T25 HFF kültür flaskına aktarın. Parazitleri 37 °C ve %5 CO2 ortamında yedi ila 10 gün boyunca büyütün. HFF hücre monokatmanını evirtilmiş faz kontrast mikroskobu altında gözlemleyin ve progeny'yi sinefungin ilaçtaki büyüme fenotipi açısından değerlendirin.Örneğin, büyüme yoksa sıfır ve monokatman büyümesi ile lizis gerçekleşmişse bir puan verin. Tüm soyyollarının puanlaması tamamlandığında, veriler kantitatif özellik lokusu veya QTL haritalaması için ikili bir fenotip olarak kullanılacaktır. Nedensel mutasyonu belirlemek için, soyyollarının tüm genom dizileme okumaları sinefungin duyarlı van strand referans genomuna hizalanır, SNP'ler belirlenir ve QTL lokusu, sinefungin direnci ile ilişkili bir SNP için taranır.SNR1'in sinefungin direnç geni olduğunun doğrulanması, CRISPR/Cas9 ile indüklenen indel mutasyonlar kullanılarak, vahşi tip sinefungin duyarlı bir arka planda SNR1'in inaktive edilmesiyle gerçekleştirilecektir. SNR1'e özgü CRISPR plazmidini oluşturmak için, özel olarak tasarlanmış primerler kullanılarak gerçekleştirilen PCR tabanlı bölge yönelimli mutajenezde UPRT hedefli CRISPR plazmidi kalıp olarak kullanılır. İlgilenilen geni içeren mutajenez ürünleri olan spesifik CRISPR plazmidleri, E.Coli hücrelerine transforme edilir.Ardından tekil kolonlar seçilip LB besiyerinde büyütülür ve ekstrakte edilen plazmidlerin boyutlarını kontrol etmek için DNA jel elektroforezi ile analiz yapılır. Hedefe özgü rehber RNA dizisini doğrulamak için plazmidlerle daha sonra dizileme yapılır. Hedefe özgü CRISPR plazmidi bir Toxoplasma hücresine aktarıldığında, rehber RNA, Cas9 nükleazını hedefe yönlendirerek hedefteki spesifik lokusta çift zincirli DNA kırılmasına neden olur.DNA kırılması daha sonra hata yapmaya meyilli, homolog olmayan uç ekleme aktivitesi ile onarılır ve bu durum hedef gende indel mutasyonlarına yol açar. Parazitleri SNR1'e özgü CRISPR plazmidi ile transfekte etmeden iki ila üç gün önce, konfluen bir HFF hücre monokatmanı içeren T25 flaskına, iki ila üç gün içinde %70 ila %80 oranında HFF hücre lizisi sağlamaya yetecek miktarda parazit ekleyin. HFF monokatmanının parazitler tarafından %70 ila %80 oranında lizis olduğunu doğrulamak için kültürü ters faz kontrast mikroskobu altında inceleyin.Besiyerini bir pipet yardımıyla nazikçe uzaklaştırın ve hücreleri beş mililitre cytomix tamponu ile flask yüzeyinden yıkayarak temizleyin. Parazit solüsyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Parazit solüsyonunu, 22 gauge küt uçlu iğne takılmış 10 mililitrelik bir şırıngadan iki ila üç kez geçirin.HFF hücrelerini ve hücresel döküntüleri uzaklaştırmak için, parazit çözeltisini üç mikron gözenek boyutuna sahip bir membrandan geçirerek yeni bir konik tüpe filtreleyin. Filtrelenen parazitleri 400 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün. Süpernatanı dökün ve çökelmiş parazitleri 10 mL cytomix tamponu ile yeniden süspande edin.Hemositometre ile parazit konsantrasyonunu belirlemek için 10 µL'lik bir alikot alın. Süspansiyonun geri kalanını 400 ×g'de 10 dakika santrifüj ederek tekrar peletleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve mililitrede 4 × 10⁷ parazit yoğunluğu elde etmek için peleti karışım tamponu içinde yeniden süspande edin.Dört mililitrelik bir gap küvetinde, 250 ila 300 mikrolitre parazit çözeltisini 7,5 mikrogram CRISPR plazmidi, altı mikrolitre ATP ve altı mikrolitre glutatyon ile karıştırın. T gondii transfeksiyona yönelik standart bir prosedürü takip ederek parazitleri elektroporasyona tabi tutun. CRISPR plazmidinin başka bir bölgeyi hedeflediği ayrı bir elektroporasyonu negatif kontrol olarak ekleyin.Elektropore edilen parazitleri, HFF hücreleri ekilmiş bir T25 flask içinde 37 °C'de iki gün boyunca büyütün. İndüklenen mutasyonları inceleme prosedürüne başlamak için, öncelikle flasktaki medyumu 0,3 µM sinefungin içeren beş mililitre D10 ile değiştirin. Dirençli havuz stabilize olana kadar parazitleri ve seçici medyumu en az üç pasaj boyunca tutun.Negatif kontrol grubunda parazit büyümesinin olmaması, ancak deneysel grupta güçlü bir parazit büyümesinin görülmesiyle belirtildiği üzere. Kolonyal suşlar elde etmek için sinefungin dirençli havuzu subklonlayın. Yeni çıkmış parazitleri toplayıp üç mikronluk membran filtrasyonu ile saflaştırın ve 150 µL D10 ortamında konfluent HFF hücreleri ekilmiş 96 kuyucuklu plakalara subklonlayın.Subklonlama kültürlerini, plakaları rahatsız etmeden, 37 °C'de bir CO2 inkübatöründe yedi ila 10 gün boyunca büyütün. Yedi ila 10 gün sonra, 96 kuyucuklu plakaları ters faz kontrast mikroskobu altında kontrol edin. Sadece tek bir plak içeren kuyucukları bulun ve bu kuyucukları işaretleyin.Her bir kuyuktaki hücreleri, HFF hücreleri ekilmiş 24 kuyuklu plakalara aktarın. 37 °C'de inkübe edin. Parazitler monokatmanı lizse etmeye başladığında, suşu korumak için parazit solüsyonundan 50 µL'yi yeni bir kuyuğa aktarın ve geri kalanını genomik DNA izolasyonu için hasat edin.Kalan parazit çözeltisini 1000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyerek çöktürün. Çöktürülmüş parazitleri PBS ile yıkayın ve tekrar santrifüjleyerek çöktürün. Ticari bir kit kullanarak veya kaynatma yöntemiyle çöktürülmüş hücrelerden genomik DNA'yı izole edin ve parazitleri 50 ila 100 µL PBS içinde yeniden süspande edin.Son olarak, dizileme için SNR1 geni fragmanı elde etmek amacıyla metin protokolünde açıklandığı şekilde PCR uygulayın. Ebeveyn FUDR dirençli ME49 ve sinefungin dirençli van suşları kullanılarak çaprazlama yoluyla türetilen yavruların, HFF monokatmanının büyümesi ve lizisi ile belirlenen sinefungin ilacına karşı dirençleri değerlendirildi. Bir QTL taraması, dokuzuncu kromozom üzerinde yaklaşık bir MBP'lik alanı kapsayan tek bir anlamlı pik ile sonuçlandı.Nedensel mutasyon bu bölgede yer almaktadır. Tüm genom dizilemesi mutasyonun tanımlanmasını sağlamıştır. QTL lokusundaki yavru SNP'leri bir hesap tablosuna aktarılmış ve sarı ile gösterilen sinefunginle dirençli yavruların bir SNP'ye sahip olduğu, yeşil ile gösterilen sinefungine duyarlı yavruların ise sahip olmadığı bir patern için taranmıştır.Sadece kırmızı ile belirtilen bir SNP, SNR1 adı verilen muhtemel bir amino asit taşıyıcı geninde erken bir stop kodonuyla sonuçlanan bu paternle eşleşmiştir. SNR1 hedefli CRISPR case nine plazmidi, sinefungin duyarlı vahşi tip bir parazit suşuna elektropore edildiğinde, sinefungin içeren ortamda kültüre edildiğinde dirençli mutantlar elde edilmiştir. Buna karşılık, başka bir bölgeyi hedefleyen bir CRISPR plazmidi ile hiçbir sinefungin dirençli parazit elde edilememiştir.Sinefungin dirençli birkaç CRISPR mutantı klonlandı ve SNR1 kılavuz RNA hedefinin etrafındaki bölge dizilendi. RH yabanı tipi suşu ile C5 ve C6 sinefungin dirençli mutantlarından elde edilen temsilci sonuçlar, her mutantta SNR1 geninin kodlama dizisini bozan bir indel olduğunu göstermektedir. Toxoplasma gondii ile çalışmanın, insanlara bulaşıcı olması nedeniyle tehlikeli olabileceğini unutmayın.Bu prosedür sırasında, parazit ile temas edebilecek kesici ve delici aletlerin uygun şekilde yönetilmesi gibi önlemler alınmalıdır. Bu prosedürün ardından, genetik komplementasyon veya transgenik parazit oluşturma gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, CRISPR/Cas9 aracılı bölgeye özgü ekzojen gen ekleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, geliştirilmesinin ardından, moleküler parazitoloji alanındaki araştırmacıların Toxoplasma gondii'nin karmaşık biyolojisini ve patogenez mekanizmalarını keşfetmelerine öncülük etmiştir.Bu videoyu izledikten sonra, genom dizileme verilerini kullanarak QTL analizinin nasıl yapılacağı konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız. Ayrıca, CRISPR/Cas9 gen düzenleme yöntemi kullanılarak Toxoplasma gondii'nin genetik metabolizasyonu hakkında bilgi edinmiş olacaksınız.

qtl-mapping-crisprcas9-editing-to-identify-drug-resistance-gene

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

İleri genetik, moleküler düzeyde nasıl aydınlatmak için güçlü bir...

Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants

Burada, tip I ve tip II olarak kullanmak için bir yöntem...

Genetik Manipülasyon<em&gt; Δku80</emFonksiyonel Genomik Analiz&gt; Suşlarının<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Biz kimyasal mutagenez ve tüm genom dizileme dayalı Chlamydia genetik analiz gerçekleştirmek için bir metodoloji tarif. Buna ek olarak, enfekte olmuş hücrelerde DNA'nın değişimi için bir sistem genetik haritalama için kullanılabilir olduğu tarif edilmektedir. Bu yöntem dönüşüm sistemleri ve moleküler genetik araçları eksik mikrobiyal sistemlerine geniş uygulanabilir.

Ileri Genetik Yaklaşımlar<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

İleri genetik, hücre otonom bağışıklığına direnç için önemli olan hücre içi patojenlerdeki genleri tanımlamak için güçlü bir yaklaşımdır. Mevcut yaklaşım, bağışıklık kaçışı için önemli olan yeni Toxoplasma gondii genlerini tanımlamak için doğuştan gelen bağışıklık hücrelerini, özellikle makrofajları kullanır.

İleri Genetik tanımak makrofajlar kullanılarak Ekranlar<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genler önemli direnç için IFN-γ-bağımlı hücre otonom bağışıklık

Biz glmSoluşturmak için bir yöntem tarif- Plasmodium falciparum CRISPR/Cas9 genom düzenleme kullanarak koşullu devirme mutantlar dayalı.

CRISPR/Cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit P. falciparum için

Burada, CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak , Trypanosoma cruzi 'nin ekstrellüler amastigote içine bir gen nakavt tanıtmak için bir protokol açıklanmaktadır. Büyüme fenotipi ya akenik amastigote kültürün hücre sayımı ya da ana hücre istilasından sonra hücreli formları proliferasyonu ile takip edilebilir.

CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak Trypanosoma cruzi 'Nin Amastigote aşamasına doğrudan bir gene Knockout tanıtımı

Burada tanımlanan floksed kaset allelic değişim mutagenezi, FLAEM kullanarak Chlamydia trachomatis hedefli, markerless gen delemesi için bir yöntemdir.

Klamidya trachomatis Floxed Kaset Allelic Exchange Mutagene tarafından Markerless Gen Deletion

Burada sunulan bir luciferase tabanlı büyüme tsay kullanarak Toxoplasma gondii in vitro hücre içi büyümeye karşı kimyasal bileşiklerin inhibisyon etkinliğini değerlendirmek için bir protokoldür. Bu teknik, ilgili hedef genin genetik olarak silinmesi ile inhibisyon özgüllüğünü doğrulamak için kullanılır. LHVS'nin TgCPL proteaza karşı inhibisyonu örnek olarak değerlendirilmektedir.

Luciferase Tabanlı Büyüme Testini Kullanarak Hücre İçi Toksoplazma Gondii Büyümesine Karşı Kimyasal Inhibitör Verimliliğin Belirlenmesi

Bu protokolün amacı, C. elegans genomunun monte edilmiş ribonikleoprotein kompleksleri ve tarama için dpy-10 co-CRISPR işaretleyicisi kullanılarak sorunsuz CRISPR/Cas9 düzenlemesini sağlamaktır. Bu protokol, C. elegans'ta eklemeler, silmeler, gen değiştirmeleri ve kodon ikameleri de dahil olmak üzere çeşitli genetik değişiklikler yapmak için kullanılabilir.

CRISPR/Cas9 C. elegans rbm-3.2 Geninin dpy-10 Co-CRISPR Tarama İşaretçisi ve Monte Edilmiş Ribonikleoprotein Kompleksleri kullanılarak düzenlenmesi.

AviTag-spesifik Konum Kısıtlı Aydınlatma Takviyeli Biyotinilasyon (ALIBi), ribozom popülasyonlarının etiketlenmesi ve afinite-affinite-arındırıcı olarak arındırılması amacıyla geliştirilen, sonraki dizileme ve proteomik analiz için geliştirilen yeni bir optogenetik olarak aktive edilmiş yöntemdir.

Rekombinant Peptit Etiketine Özgü Konum Kısıtlı Aydınlatma Güçlendirilmiş Biyotinilasyona Dayalı Subhücresel Ribozom Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Kimyasal genetik, bir kapı bekçisi kalıntısının, hedef lokusta farklı bir yan zincir içeren bir amino asit ile değiştirilmesini içerir. Burada, cdpk1'in hipomorfik bir alelini içeren mutant bir parazit oluşturduk ve mutant arka planda parazit tarafından benimsenen telafi edici yolları belirledik.

Bitki Benzeri Kinazların Hipomorfik Alelini Barındıran Mutant Bir Sıtma Parazitinde Telafi Edici Yolların Gelişimini Anlamak

Keşfedin Toxoplasma gondii'de sinefungin direnci genini belirlemek için QTL haritalama ve CRISPR/Cas9 düzenleme yöntemlerini. Bu teknik, parazitolojide ilaç direnci mekanizmalarını anlamaya katkı sağlar.

QTL Haritalama ve CRISPR / Cas9 Düzenlemesi, bir İlaç Direnç Geninin Belirlenmesi için

Daha fazla video keşfet