QTL Haritalama ve CRISPR / Cas9 Düzenlemesi, bir İlaç Direnç Geninin Belirlenmesi için

Bu kantitatif özellik lokusu haritalaması ve CRIPR/Cas9 genom düzenleme metodolojisinin genel amacı, Toksoplazmada sinfungin direncinde rol oynayan bir geni tanımlamak ve ardından doğrulamaktır. Bu yöntemler, varyantların genetik temelleri, patogenez ve ilaç direnci gibi parazitolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniklerin ana avantajı, Toxoplasma'da verimli genetik manipülasyon için hassas QTL analizi ve CRISPR / Cas9 genom düzenlemesi için tüm genom dizileme verilerinin kullanılmasıdır.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Dr.Robin Powell olacak. Toxoplasma gondii parazitleri, D10 besiyeri ile T25 şişelerine tohumlanmış, birleşik insan sünnet derisi fibroblast veya HFF hücrelerinde büyütülür. Bireysel döl klonlarını sinifoksin direnci açısından test etmek için, parazitlerin çoğu konakçı hücreleri parçalamaya başlayana kadar her klonu yüksek parazit yoğunluğuna büyütün.

Parazit çözeltisini metin protokolünde tarif edildiği gibi hazırladıktan sonra, sinifon ilacının 0.3 mikromolar çalışma konsantrasyonuna sahip D10 ortamı içeren yeni bir T25 HFF kültür şişesine 2.5 kez 10 ila beşinci parazitleri geçirmek için bir pipetleyici kullanın. Parazitleri yedi ila 10 gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de büyütün. HFF hücre tek tabakasını ters faz kontrast mikroskobu altında gözlemleyin ve sinüfungin ilacındaki büyüme fenotipi için dölleri puanlayın.

Örneğin, büyüme olmaması için sıfır puan alın ve tek katmanın büyümesi ve parçalanması için bir puan alın. Tüm döller puanlandıktan sonra, veriler nicel özellik lokusu veya QTL haritalaması için ikili bir fenotip olarak kullanılacaktır. Nedensel mutasyonu tanımlamak için, döllerin tüm genom dizileme okumaları, sinifona duyarlı van iplikçik referans genomuna hizalanır, SNP'ler çağrılır ve QTL lokusu, sinifon direnci ile ilişkili bir SNP için taranır.

SNR1'in sinifon direnç geni olduğunun doğrulanması, SNR1'in CRISPR/Cas9 ile indüklenen indel mutasyonları kullanılarak vahşi tip sinfungine duyarlı bir arka planda inaktive edilmesiyle gerçekleştirilecektir. SNR1'e özgü CRISPR plazmidini oluşturmak için, CRISPR plazmidini hedefleyen UPRT, özel tasarlanmış primerler kullanılarak PCR tabanlı bölgeye yönelik mutajenezde bir şablon olarak kullanılır. İlgilenilen geni spesifik CRISPR plazmitlerini içeren mutajenez ürünleri, E.Coli hücrelerine dönüştürülür.

Bireysel klonlar daha sonra toplanır ve LB ortamında büyütülür ve ekstrakte edilen plazmitler, boyutlarını kontrol etmek için DNA jel elektroforezi ile analiz edilir. Plazmitler daha sonra hedefe özgü kılavuz RNA dizisini doğrulamak için dizilenir. Hedefe özgü CRISPR plazmidi bir Toxoplasma hücresine sokulduğunda, kılavuz RNA, Cas9 çekirdeğini hedefe yönlendirir ve hedefteki spesifik lokustan çift sarmallı bir DNA kopmasına neden olur.

DNA kırılması daha sonra hataya eğilimli, homolog olmayan ve birleştirme aktivitesi ile sabitlenir ve hedef gende indel mutasyonlarına yol açar. Parazitleri SNR1'e özgü CRISPR plazmidi ile transveksiyondan iki ila üç gün önce, iki ila üç gün içinde% 70 ila% 80 HFF hücre lizisi elde etmek için birleşik bir HFF hücre tek tabakası içeren bir T25 şişesine yeterli parazit ekleyin. HFF tek tabakasının parazitler tarafından% 70 ila% 80 oranında parçalandığını doğrulamak için kültürü ters faz kontrast mikroskobu altında inceleyin.

Ortamı bir pipetle nazikçe çıkarın ve şişenin yüzeyindeki hücreleri beş mililitre cytomix tamponu ile yıkayın. Parazit çözeltisini 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Parazit solüsyonunu 22 gauge künt iğne ile 10 mililitrelik bir şırıngadan iki ila üç kez geçirin.

HFF hücrelerini ve hücresel kalıntıları çıkarmak için, parazit çözeltisini üç mikron gözenek boyutuna sahip bir zardan yeni bir konik tüpe süzün. Filtrelenmiş parazitleri 10 dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleme ile paletleyin. Süpernatanı dökün ve paletli parazitleri 10 mililitre cytomix tamponu ile tekrar askıya alın.

Bir hemositometre ile parazit konsantrasyonunu belirlemek için 10 mikrolitrelik bir alikotu çıkarın. Süspansiyonun geri kalanını 10 dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleme ile tekrar paletleyin. Süpernatanı çıkarın ve mililitre başına dört kez 10 ila yedinci parazitler arasında bir yoğunluk elde etmek için paleti karışım tamponunun içinde yeniden askıya alın.

Dört mililitrelik boşluklu bir küvette, 250 ila 300 mikrolitre parazit çözeltisini 7.5 mikrogram CRISPR plazmid, altı mikrolitre ATP ve altı mikrolitre glutatyon ile karıştırın. T gondii transveksiyonu için standart bir prosedürü izleyerek parazitleri elektroporatörlük edin. Bir CRISPR plazmidinin başka bir yeri hedeflediği negatif kontrol olarak ayrı bir elektroporasyon ekleyin.

Elektroporasyonlu parazitleri, iki gün boyunca 37 santigrat derecede HFF hücreleri ile tohumlanmış bir T25 şişesinde büyütün. İndüklenmiş mutasyonları inceleme prosedürüne başlamak için, önce şişedeki ortamı 0.3 mikromol sinoksidan içeren beş mililitre D10 ile değiştirin. Dirençli havuz stabil hale gelene kadar parazitleri ve seçim ortamını en az üç geçiş boyunca tutun.

Negatif kontrol grubunda parazit büyümesinin olmaması, ancak deney grubunda sağlam parazit büyümesi ile belirtildiği gibi. Koloni iplikleri elde etmek için sinifona dirençli havuzu alt klonlayın. Taze çıkış parazitlerini toplayın, üç mikron membran filtrasyonu ile saflaştırın ve 150 mikrolitre D10 ortamında birleşik HFF hücreleri ile tohumlanmış 96 oyuklu plakaya alt klonlayın.

Alt klonlama kültürlerini, plakaları rahatsız etmeden yedi ila 10 gün boyunca 37 santigrat derecede bir CO2 inkübatöründe büyütün. Yedi ila 10 gün sonra, 96 kuyulu plakayı ters faz kontrast mikroskobu altında kontrol edin. Sadece bir plak içeren kuyuları arayın ve bu kuyuları işaretleyin.

Hücreleri her bir oyuktan HFF hücreleri ile tohumlanmış 24 oyuklu plakaya aktarın. 37 santigrat derecede inkübe edin. Parazitler tek tabakayı parçalamaya başladığında, suşu korumak için 50 mikrolitre parazit solüsyonunu yeni bir kuyuya geçirin ve geri kalanını genomik DNA izolasyonu için hasat edin.

Parazit çözeltisinin geri kalanını 10 dakika boyunca 1000 kez G'de paletleyin. Paletli parazitleri PBS ile yıkayın ve tekrar paletleyin. Ticari bir kit kullanarak veya parazitleri 50 ila 100 mikrolitre PBS'de kaynatarak ve yeniden süspanse ederek paletlenmiş hücrelerden genomik DNA'yı izole edin.

Son olarak, dizileme için SNR1 geninin bir parçasını elde etmek için metin protokolünde açıklandığı gibi PCR gerçekleştirin. Ebeveyn FUDR'ye dirençli ME49 ve sinifona dirençli van suşları kullanılarak çapraz türetilmiş döllere, HFF tek tabakasının büyümesi ve parçalanması ile gösterildiği gibi ilaca, sinfungine direnç açısından erişildi. Bir QTL taraması, dokuzuncu kromozom üzerinde yaklaşık bir MBP'yi kapsayan önemli bir tepe ile sonuçlandı.

Nedensel mutasyon bu bölgede bulunur. Tüm genom dizilimi, mutasyonun tanımlanmasına yol açtı. QTL lokusu içindeki döl SNP'leri, bir elektronik tabloya aktarıldı ve sarı ile gösterilen sinfungin dirençli döllerin bir SNP'ye sahip olduğu ve yeşil ile gösterilen sinfungine duyarlı döllerin olmadığı bir model için tarandı.

Kırmızı ile gösterilen sadece bir SNP, SNR1 olarak adlandırılan varsayılan bir amino asit taşıyıcı geninde erken durdurma kodonu ile sonuçlanan bu modelle eşleşti. SNR1'i hedefleyen CRISPR vaka dokuzuncu plazmid, sinifona duyarlı vahşi tip bir parazit suşuna elektropore edildiğinde, sinifon içinde kültürlendiğinde dirençli mutantlar elde edildi. Buna karşılık, başka bir yeri hedef alan bir CRISPR plazmidi ile sinifona dirençli parazitler elde edilmedi.

SNR1 kılavuz RNA hedefinin etrafındaki bölgede birkaç sinfungin dirençli CRISPR mutantı klonlandı. RH vahşi tip suş ve C5 ve C6 sinfungin dirençli mutantlardan elde edilen sonuçların temsili, her mutantın SNR1 geninin kodlama dizisini bozan bir indel'e sahip olduğunu göstermektedir. Toxoplasma gondii ile çalışmanın insanlar için bulaşıcı olduğu için tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu işlem sırasında, parazitle temas edebilecek kesici aletlerin uygun şekilde kullanılması gibi önlemler alınmalıdır. Bu prosedürü takiben, genetik tamamlama veya transgenik parazit yapımı gibi ek soruları yanıtlamak için CRISPR / Cas9 aracılı bölgeye özgü eksojen gen yerleştirme gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, moleküler parazitoloji alanındaki araştırmacıların, Toxoplasma gondii'deki karmaşık biyolojiyi ve patogenez mekanizmalarını keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, genom dizileme verilerini kullanarak QTL analizinin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız. Ayrıca, CRISPR / Cas9 gen düzenlemesi kullanılarak Toxoplasma gondii'nin genetik metabulasyonu.