Hazırlama ve Değerlendirilmesi ^99m Bioorthogonal Kimya Kullanarak Öncesi hedeflemek için üç dişli Şelatlar Tc-etiketli

Bu prosedürün genel amacı, hedefleme vektörleri olarak trans-siklookten modifiye edilmiş biyomoleküller ile biyoortogonal kimya kullanılarak önceden hedeflenmiş görüntüleme için teknesyum-99m etiketli tetrazinler üretmektir. Bu yöntem, yeni radyo ilaçlarının geliştirilmesi için önemli bir yeni platform sağlar. Ön hedefleme yoluyla, burada açıklanan teknesyum kompleksleri, çok çeşitli organları, dokuları ve biyo-belirteçleri görüntülemek için kullanılabilir.

Bu teknik, tanısal tıpta en yaygın kullanılan tıbbi izotop olan teknesyum-99m ile radyo etiketli tetrazinler üretmek için sağlam bir adım adım yöntem sağladığı için avantajlıdır. Bu teknik, küçük moleküller ve antikorlar dahil olmak üzere farklı hedefleme vektörleri ile kullanılabilir. Teknesyumu beta yayan renyum izotopları ile değiştirerek radyo tedavisi için de kullanılabilir.

Hayvan prosedürlerinin bir kısmını gösteren, laboratuvarımızdaki biyoloji teknisyeni Nancy Janzen olacak. Radyo etiketleme prosedürüne başlamak için, bir mikrodalga şişesinde, sekiz miligram potasyum boranokabonat, 15 miligram sodyum karbonat, 20 miligram sodyum tetraborat dekahidrat ve 25 miligram potasyum sodyum tartrat tetrahidrat birleştirin. Şişeyi 10 dakika boyunca argon gazı ile temizleyin.

Daha sonra, şişeye 1.110 megabekerel aktivitesi ile% 0.9 salin içinde dört mililitre teknesyum-99m perteknetat ekleyin. Reaksiyon karışımını bir mikrodalga reaktörüne yükleyin ve 10 saniye karıştırın. Daha sonra, triaqua trikarbonil teknesyum-99m katyonunu elde etmek için karışımı 110 santigrat derecede 3,5 dakika ısıtın.

Çözelti pH'ını 3,5 ila dörde ayarlamak için yaklaşık 400 mikrolitre bir molar hidroklorik asit ekleyin. Daha sonra, her tetrazin ligandı için, iki miligram ligandı 250 mikrolitre metanol içinde çözün. Her ligand çözeltisine 74 megabekerel aktivitesi ile 250 mikrolitre teknesyum-99m kompleksi ekleyin.

Karışımı bir mikrodalga reaktöründe 60 santigrat derecede 20 dakika ısıtın. T-Bütil koruma gruplarına sahip tetrazin ligandları için, çözeltiyi bir mikrodalga şişesinden 20 mililitrelik bir sintilasyon şişesine aktarın ve daha sonra çözücüyü buharlaştırın ve her bir kompleksi hacimce bire bir diklorometan ve trifloroasetik asit çözeltisinin bir mililitresinde yeniden çözün. Daha sonra, çözeltiyi bir mikrodalga şişesine aktarın ve ligandların korunmasını sağlamak için bu kompleksleri bir mikrodalga reaktöründe 60 santigrat derecede altı ila 10 dakika ısıtın.

Kompleksleri oda sıcaklığına soğutun ve ardından çözücüyü buharlaştırın. HPLC saflaştırmasına devam etmeden önce kalıntıları 500 mikrolitre asetonitril veya metanol ve sudan oluşan bire bir sulu çözelti içinde yeniden çözün. Her bir radyo etiketli tetrazin kompleksini, eluent boyunca% 0.1 trifloroasetik asit ile 20 dakika boyunca suya 30 ila 70 ila 40 ila 60 asetonitril elüsyon gradyanı ile saflaştırmak için C18 ters fazlı HPLC kullanın.

Gama izinde kaçtığı gösterildiğinde saflaştırılmış ürünü toplayın. Daha sonra, etiketli her bir kompleksi, suda% 20 metanol içinde 0.125 miligram karşılık gelen radyum-tetrazin kompleksi çözeltisi ile birlikte enjekte edin. Gama zirvesinin kimliğini doğrulamak için UV izindeki renyum kompleksi zirvesinin ve gama izindeki teknesyum kompleksi zirvesinin tutma sürelerini karşılaştırın.

Çözücüyü her saflaştırılmış teknesyum-tetrazin kompleksinden çıkarın. Her kompleksi,% 0.5 sığır serum albümini ve% 0.01 polisorbat 80 ile fosfat tamponlu salin içinde mikrolitre başına 7.4 kilobekerel konsantrasyonda formüle edin. Her fare deneği için, kilogram başına 20 miligramlık bir doz hazırlamak için tuzlu su içinde TCOPB türevinin mikrolitre başına beş mikrogramlık bir çözeltisinden 100 mikrolitrelik bir şırıngaya çekin.

Dozaj şırıngasına 30 gauge bir iğne bağlayın. Fare öznesini fiziksel bir kısıtlama aygıtına yerleştirin. Kuyruğun yan yüzeyindeki damarları, kuyruğun ucundan yaklaşık iki santimetre uzakta tanımlayın ve alanı alkollü bir bezle silin.

Şırınga iğnesini damara paralel sığ bir açıyla yerleştirin. TCOBP türevini yavaşça enjekte edin. İğneyi çıkarın ve kanama durana kadar enjeksiyon bölgesine hafif bir basınçla temiz bir gazlı bez sünger uygulayın.

TCOBP türevinin enjeksiyonundan bir saat sonra, kuyruk veni enjeksiyonu ile yaklaşık 0.74 megabekerel aktivitesi ile istenen teknesyum-99m tetrazin kompleksinin 100 mikrolitrelik bir dozunu uygulayın. Enjeksiyon sırasında teknesyum kompleksinin 100 mikrolitrelik bir test numunesinin aktivitesini ölçmek için bir doz kalibratörü kullanın. Test örneğini daha sonraki ölçümler için saklayın.

Enjeksiyondan altı saat sonra fareyi %3 izofluran ve %2 oksijen gazı karışımı ile uyuşturun. Anesteziye devam etmek için fareyi burnu burun konisine gelecek şekilde sırt üstü yatırın ve ksifoid sürecini bulun. Heparin ile önceden işlenmiş bir şırıngaya 25 gauge iğne bağlayın.

İğneyi, ksifoid işleminin altında 20 derecelik bir açıyla, orta hattın hafifçe soluna yerleştirin. İğne tam olarak yerleştirildikten sonra, iğne göbeğinde kan olup olmadığını kontrol etmek için pistonu yavaşça geri çekin ve başarılı bir kalp delinmesini onaylayın. İğneyi gerektiği gibi yeniden ayarlayın.

Kalp delindikten sonra, şırıngaya yavaşça bir mililitre kan çekin. Kan örneğini önceden tartılmış bir sayma tüpüne aktarın. Anestezi altındayken rahim ağzı çıkığı ile fareyi ötenazi yapın.

Ötenazi yapılmış hayvanı plastik bir torbaya koyun ve tüm vücut aktivitesini bir doz kalibratörü ile ölçün. Ardından diz ve omuz kemiklerini, safra kesesini, böbrekleri, karaciğeri, tiroid ve soluk borusunu ve kuyruğu toplayın. İçerikleri ile birlikte mide, ince bağırsakları, kalın bağırsakları ve çekumu ve idrar kesesini toplayın.

Safra ve idrar keseleri dışında toplanan tüm dokulardan kanı fosfat tamponlu tuzlu su içinde durulayın. Kurulayın, dokuları kurutun ve her dokuyu önceden tartılmış bir sayma tüpüne yerleştirin. Karkasın kalıntı aktivitesini ölçün.

Her doku örneğini tartın ve dokunun kütlesini tek başına hesaplayın. Teknesyum kompleksi test numunesinin beş mikrolitrelik bir alikotunun aktivitesini ölçmek için çok dedektörlü bir gama sayacı kullanın. Dakika başına sayım olarak elde edilen değeri ve enjeksiyon sırasında ölçülen aktiviteyi kullanarak bir dönüştürme faktörü hesaplayın.

Gama dedektörü ile her doku ve sıvı örneğinin aktivitesini ölçün. Değerleri microcurie'ye dönüştürün ve doku gramı başına enjekte edilen yüzde do'yu belirlemek için her değeri organ ağırlığına göre normalleştirin. Bu işlemi, TCOPB türevinin negatif kontrol serisi olarak enjeksiyonu olmadan ek farelerle tekrarlayın.

Bu yöntem kullanılarak, bağlayıcı ve anahtar-lider kombinasyonlarında farklılık gösteren beş tetrazin kompleksi, teknesyum-99m ile etiketlendi. Kemikte yüksek kalsiyum döngüsü olan bölgelere lokalize olan bir TCOPB türevi, farelerin omuz ve diz eklemlerini önceden hedeflemek için kullanıldı. Her bir tetrazin bileşiği için kemik için gram doku başına enjekte edilen dozun kana yüzde oranları hesaplandı.

Beş bileşiğin tümü kanı hızlı bir şekilde temizledi ve kemiği hedef aldı, bu da tetrazin bileşikleri ile TCOBP türevi arasındaki seçici biyoortogonal eşleşme reaksiyonunun in vivo olarak meydana geldiğini gösterdi. Üçüncü bileşik, kandan hedefleme ve temizlemenin en iyi kombinasyonunu gösterdi. Negatif kontrol deneyleri, radyo etiketli tetrazin komplekslerinin, TCOBP türevinin yokluğunda kemiğe önemli ölçüde lokalize olmadığını gösterdi.

Örneğin, TCOBP türevi uygulanmadığında, bileşik iki safra kesesi ve bağırsaklarda yüksek seviyelere sahipti, ancak kemikte çok azdı. Test edilen beş bileşik arasında TCOBP türevini alan farelerde doku lokalizasyonunda geniş farklılıklar gözlendi. Örneğin, kalın bağırsak, karaciğer veya idrar ve mesanede diğer komplekslere kıyasla çok az bileşik üç görülürken, bileşik üçten çok daha fazlası kemikte görüldü.

Bir kez ustalaştıktan sonra, burada açıklanan etiketleme tekniği, doğru şekilde gerçekleştirilirse baştan sona iki saatten daha kısa sürede gerçekleştirilebilir. Bu tekniği denerken, teknesyum çözeltisine eklenmeden önce tüm reaktiflerin doğru bir şekilde tartıldığından ve tuzların argon ile temizlendiğinden emin olmak önemlidir. Teknesyum çözeltisinin pH'ının, tetrazin ligandı eklenmeden önce 3.5 ila dörde ayarlanması da çok önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, teknesyum etiketli tetrazinlerin nasıl hazırlanacağı ve saflaştırılacağı ve bunların ön hedefleme ve biyoortogonal kimya kullanarak yeni radyo farmasötikleri oluşturmak için nasıl kullanılabileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Radyoaktivite ile çalışırken, yayılan radyasyonun türünü ve numunelerin en iyi şekilde nasıl korunacağını ve işleneceğini anlamak gibi uygun önlemleri almayı unutmayın.