Name: B lenfoblastoid hücre dizilerinde Kurulması için Basit Kırmızı Kan Hücresi Lizis Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Öğrenin, B lenfoblastoid hücre hatlarını (B-LCL) kurmak için basit kırmızı kan hücresi lizis yöntemini. Sadece 0,5 mililitre kanla yüksek canlılıkta hücre elde edin ve zamandan tasarruf edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Bilimler Akademisi'nin (KFZD-SW-205), Çin Bilimler Akademisi'nin stratejik biyolojik kaynaklar teknolojisi destek sisteminin (CZBZX-1) ana projeleri tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışma Genetik ve Gelişimsel Biyoloji Enstitüsü Etik Komitesi tarafından onaylandı ve protokol insan refahı için kurumsal kuralları takip eder. EB Virüs hazırlanması 1. <ol><li> 1. günde, 6 mL B95-8 hücreler ve kültür çözülme tam RPMI 1640 ortamı, bir% 10 fetal bovin serumu, 2 mM L-glutamin ve antibiyotikler (100 ug / ml streptomisin, 100 U / ml penisilin) ​​ile desteklenmiş T25 kültürü şişesi. 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübatörde kültür şişesi yerleştirin. </li><li> 2 gün, mikroskop altında hücre morfolojisi gözlemlemek. Onlar parlak ve yuvarlak olduğunda Hücreler iyi durumda. 10 ml tam RPMI 1640 ortamı ekleyin. </li><li> 4. günde, 10 ml taze tam RPMI 1640 ortamı ekleyin ve sonra T75 kültür şişesine aktarın. </li><li> 8. günde, 20 ml tam RPMI 1640 ortamı ilave edin. </li><li> Yani taze orta, açlık eklemeden 8 gün boyunca hücreleri korumak. </li><li> günde 16, hücreleri gözlemlemekmikroskop altında gözlenmiştir. 15 ml bir santrifüj tüpüne, 12 ml / tüp hücreleri toplamak. </li><li> 1 saat boyunca -80 ° C&#39;de dondurularak korumak ve daha sonra hızlı bir şekilde 37 ° C&#39;de eritin. Virüs partikülleri hücrelerin serbest kadar 3 kez tekrarlayın. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 240 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> -80 ° C de 0.22 mikron filtre, kısım, 12 ml / tüp ve mağaza süpernatanın filtre. </li></ol> Kırmızı Kan Hücresi Lizis Tampon ile Tüm Kanı 2. Tedavi <ol><li> 15 ml tüp EDTA · K 2 tarafından Antikoagüle 0.5 mL tam kan ekleyin. </li><li> Bütün kan (kullanmadan önce 0,22 um filtre ile filtre edildi ve oda sıcaklığına kadar çözündürüldü) 1 ml kırmızı kan hücre parçalama tamponu kondu ve iyice karıştırın. 4 dakika boyunca oda sıcaklığında karışım yerleştirin. durdurma reaksiyonu hızlı 7 mL 1x PBS - O 5 ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 240 x g&#39;de santrifüjleyin. Beyaz kan hücrelerinin, tüpün alt çökelecektir. </li><li> supernatant atmak ve 7 ml 1640 temel orta ekleyerek yağış yıkayın. Oda sıcaklığında 240 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj. İki kez tekrarlayın. </li><li> (% 20 fetal bovin serumu ve 10 ug / ml fitohemaglutinin (PHA) ihtiva eden, RPMI 1640 ortamı) 300 uL dönüşüm ortamı içinde hücre pelletini. </li></ol> 3. EBV enfeksiyonu <ol><li> Hücre süspansiyonu 20 ug / mL, siklosporin A, 60 ul (CSA) ekleyin. </li><li> Hızla 37 ° C&#39;de EBV bir kısım Çözülme. hücre süspansiyonu 240 mcL EBV ekleyin. </li><li> İyice karıştırın ve oyuk başına, 96 çukurlu bir levhaya 200 uL hücre süspansiyonu yerleştirin. , Buharlaşmayı önlemek 96 oyuklu plakanın çevresindeki her bir oyuğa 200 uL 1x PBS ekleyin. 37 ° C&#39;de bir% 5 CO2 inkübatörü içinde plaka koyun. </li></ol> B-LCLs&#39;in 4. Genişleme ve Kryoprezervasyon <ol><li> EBV enfeksiyonu sonrası ilk ay haftada bir kez orta yarısı değiştirin. Sadece kalın layeHücre fragmanları R 7. günde (Şekil 2) mikroskop altında görülebilir. EBV enfeksiyonu Bir ay sonra, lenfoblastoid hücre kümeleri mikroskobu (Şekil 2) altında hücre parçalarının kalın bir tabaka altında görebilir. </li><li> Hücre kümeleri açıkça mikroskop (Şekil 2) altında görünür olana kadar her 3 günde bir orta yarısı değiştirin. Tipik haliyle, bu işlem, 10 ila 20 gün sürer. </li><li> Karıştırma işleminden sonra, hücreler pipetleme ve 24 yuvalı plakaya aktarılır. sarı döner iken tam RPMI 1640 ile kültür ortamı hacmi ikiye katlayın. Bu işlem, hücre büyümesinin hızına bağlıdır. </li><li> Daha sonra, T25 kültür şişelerinde hücreleri transferi. 15 ml - orta hacmi 10 genişler kadar sarıya döner olarak kültür ortamı hacmi ikiye katlayın. </li><li> dondurmadan önce orta 24 saat değiştirin. 240 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje hücre süspansiyonu. FR 10 x 10 6 / mL - 5 bir yoğunlukta bir hücre sayacı ve dondurularak ile hücre sayımı% 90 FBS ve% 10 dimetilsülfoksit (DMSO) ihtiva eden Özen stok çözeltisi. -80 ° C&#39;ye kadar ve dakika başına 1 ° C bir hızda dondurma ve daha sonra doğrudan sıvı azot içine aktarın. </li></ol> 5. 3- (4,5-dimetiltiyazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolyum bromürde (MTT) deneyi 17 <ol><li> % 10 fetal sığır serumu ihtiva eden 1640 ortamı ile bir B-LCLs&#39;in tek bir hücre süspansiyonu hazırlanır. De üzerinde 96 oyuklu plaka başına tohum 3 x 10 4 hücre, oyuk başına 100 uL. </li><li> 16 saat - 12 ve 37 ° C &#39;de CO2 inkübatör% 5 plaka koyun. </li><li> Hücreler büyüdükten edildiği çukurlara MTT (5 mg / ml) ilave edilir ve 37 ° C&#39;de 4 saat boyunca ışıktan uzak tutulur. </li><li> 168 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj hücre plakası. </li><li> Süpernatantı ve oyuk başına 100 uL DMSO ilave edin. NOT: Dikkatli olun. iğne şeklindeki boya kristalleri dokunmayın. </li><li> kristalleri tamamen çözünmesi için düşük hızda 10 dakika için plakayı sallayın. </li><li> 570 nm ölçün emmeBir mikrolevha spektrofotometre kullanılarak. </li></ol>

<ol><li>Mohyuddin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+instability+in+EBV-transformed+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines.</a> Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).</li>
<li>Hu, V. W., Frank, B. C., Heine, S., Lee, N. H., Quackenbush, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+lymphoblastoid+cell+lines+from+monozygotic+twins+discordant+in+severity+of+autism+reveals+differential+regulation+of+neurologically+relevant+genes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of lymphoblastoid cell lines from monozygotic twins discordant in severity of autism reveals differential regulation of neurologically relevant genes.</a> BMC Genomics. 7, 118(2006).</li>
<li>Toda, T., Sugimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+Epstein-Barr+virus-transformed+B-lymphoblasts+and+the+proteome+database%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of Epstein-Barr virus-transformed B-lymphoblasts and the proteome database.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 197-206 (2003).</li>
<li>Chiorazzi, N., Wasserman, R. L., Kunkel, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Epstein-Barr+virus-transformed+B+cell+lines+for+the+generation+of+immunoglobulin-producing+human+B+cell+hybridomas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Use of Epstein-Barr virus-transformed B cell lines for the generation of immunoglobulin-producing human B cell hybridomas.</a> J Exp Med. 156 (3), 930-935 (1982).</li>
<li>Traggiai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells%3A+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).</li>
<li>Hussain, T., Kotnis, A., Sarin, R., Mulherkar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+%26+characterization+of+lymphoblastoid+cell+lines+from+patients+with+multiple+primary+neoplasms+in+the+upper+aero-digestive+tract+%26+healthy+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment & characterization of lymphoblastoid cell lines from patients with multiple primary neoplasms in the upper aero-digestive tract & healthy individuals.</a> Indian J Med Res. 135 (6), 820-829 (2012).</li>
<li>Neitzel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Routine+Method+for+the+Establishment+of+Permanent+Growing+Lymphoblastoid+Cell-Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A Routine Method for the Establishment of Permanent Growing Lymphoblastoid Cell-Lines.</a> Hum Genet. 73 (4), 320-326 (1986).</li>
<li>Oh, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+the+rapid+establishment+of+Epstein-Barr+virus+immortalization+of+human+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes.</a> Cell Prolif. 36 (4), 191-197 (2003).</li>
<li>Louie, L. G., King, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel-Approach+to+Establishing+Permanent+Lymphoblastoid+Cell-Lines+-+Epstein-Barr-Virus+Transformation+of+Cryopreserved+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A Novel-Approach to Establishing Permanent Lymphoblastoid Cell-Lines - Epstein-Barr-Virus Transformation of Cryopreserved Lymphocytes.</a> Am J Hum Genet. 48 (3), 637-638 (1991).</li>
<li>Tremblay, S., Khandjian, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+use+of+long-term+frozen+lymphocytes+for+the+establishment+of+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">Successful use of long-term frozen lymphocytes for the establishment of lymphoblastoid cell lines.</a> Clin Biochem. 31 (7), 555-556 (1998).</li>
<li>Reidy, J. A., Wheeler, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+age+and+Epstein-Barr+virus+transformation+of+cryopreserved+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Sample age and Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 28 (6), 383-384 (1992).</li>
<li>Amoli, M. M., Carthy, D., Platt, H., Ollier, W. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBV+immortalization+of+human+B+lymphocytes+separated+from+small+volumes+of+cryo-preserved+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">EBV immortalization of human B lymphocytes separated from small volumes of cryo-preserved whole blood.</a> Int J Epidemiol. 37, suppl 1 41-45 (2008).</li>
<li>Lacelle, C., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+lymphoblastoid+cell+lines+from+frozen+blood+of+extremely+old+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Establishing lymphoblastoid cell lines from frozen blood of extremely old individuals.</a> Mech Ageing Dev. 123 (10), 1415-1418 (2002).</li>
<li>Tohda, H., Oikawa, A., Kudo, T., Tachibana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+greatly+simplified+method+of+establishing+B-lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A greatly simplified method of establishing B-lymphoblastoid cell lines.</a> Cancer Res. 38 (10), 3560-3562 (1978).</li>
<li>Ventura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Simple+Method+for+the+Epstein-Barr+Virus+Transformation+of+Lymphocytes+from+Members+of+Large+Families+of+Reunion+Island%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Hered%22%5BJournal%5D)">Use of a Simple Method for the Epstein-Barr Virus Transformation of Lymphocytes from Members of Large Families of Reunion Island.</a> Hum Hered. 38 (1), 36-43 (1988).</li>
<li>Chenevixtrench, G., Kerr, B., Walters, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoblastoid+Cell-Lines+from+Frozen+Whole-Blood+-+a+Quick+and+Economical+Safeguard+for+Linkage+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Lymphoblastoid Cell-Lines from Frozen Whole-Blood - a Quick and Economical Safeguard for Linkage Analysis.</a> Am J Hum Genet. 46 (1), 635-636 (1990).</li>
<li>Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-Examination+and+Further+Development+of+a+Precise+and+Rapid+Dye+Method+for+Measuring+Cell-Growth+Cell+Kill%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Re-Examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell-Growth Cell Kill.</a> J Immunol Methods. 119 (2), 203-210 (1989).</li>
<li>Bogoslovsky, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+and+enumeration+of+endothelial+progenitor+and+endothelial+cells+from+peripheral+blood+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Med%22%5BJournal%5D)">Preservation and enumeration of endothelial progenitor and endothelial cells from peripheral blood for clinical trials.</a> Biomark Med. 9 (7), 625-637 (2015).</li>
<li>Ambach, A., Bonnekoh, B., Gollnick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+flow+cytometric+immuno-staining+of+T-cell+perforin+is+preserved+using+diethylene+glycol+for+erythrocyte-lysis+but+lost+by+the+use+of+ammonium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Routine flow cytometric immuno-staining of T-cell perforin is preserved using diethylene glycol for erythrocyte-lysis but lost by the use of ammonium chloride.</a> Exp Dermatol. 12 (6), 825-831 (2003).</li>
<li>Beck, J. C., Beiswanger, C. M., John, E. M., Satariano, E., West, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transformation+of+cryopreserved+lymphocytes%3A+A+resource+for+epidemiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: A resource for epidemiological studies.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 10 (5), 551-554 (2001).</li>
<li>Tosato, G., Cohen, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Epstein-Barr+Virus+%28EBV%29-immortalized+B+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of Epstein-Barr Virus (EBV)-immortalized B cell lines.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 7, Unit 7 22(2007).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu, kırmızı kan hücrelerinin lize kandan insan B hücrelerini ölümsüz için yeni bir yöntemle geliştirilmesi rapor etmekte ve B-LCLs&#39;in MTT testi ile değerlendirildi oluşturulan kendi hücredeki mevcudiyetini göstermektedir. Sonuçlar alyuvar lisiz yöntemi ile kurulan B-LCLlerin hücre canlılığı yoğunluk gradyan ayırma yöntemi çok daha yüksek olduğunu göstermiştir. Kırmızı kan hücresi parçalama yöntemin başlıca avantajı, basit ve yüksek başarı oranına ve hücre yaşayabilirliği ile kalıcı bir hücre hattı kurmak için kan (0...

Dinlenen B hücreleri, Epstein-Barr virüsü (EBV) tarafından in vitro olarak aktif olarak çoğalan B lenfoblastoid hücre dizilerine (B-LCL'ler) dönüştürülebilir. B-LCL'ler, farklılaşma ve gelişme açısından germ hücrelerine benzer ve B-LCL'lerin somatik mutasyon oranı, ihmal edilebilir genetik ve fenotipik değişiklikle sadece %0,3 idi1. Bu nedenle, periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) için vekiller olarak B-LCL'ler, EBV ile ilişkili hastalıkların genomik, transkriptomik ve proteomik çalışmalarının ilerlemesini önemli ölçüde hızlandırmıştır2,3. Ayrıca, B-LCL'ler monoklonal antikorların taranmasında da önemli bir uygulamaya sahiptir4,5. 
B lenfositlerinin EBV ile ölümsüzleştirilmesi için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. En yaygın prosedürler arasında B lenfositlerinin izolasyonu ve enfeksiyöz EBV üretmek için B95-8 hücre hatlarının kullanılması yer alır. İzolasyondan dönüşüme kadar bu yöntemler üç stratejiye ayrılır. Bu çalışmada yoğunluk gradyan ayırma yöntemi olarak adlandırılan yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ve EBV transformasyonu ile doğrudan6-8 lenfositler taze kandan ayrılmaktadır. Bununla birlikte, diğer teknikler taze kanın taşınması zorluğunun üstesinden gelir ve saflaştırılmış lenfositlerin dondurulması ve ardından çözülme ve EBV enfeksiyonu9-11 için bir prosedür kullanır. Dondurularak saklanmış tam kan, B lenfositlerinin izolasyonu ve transformasyonu için de kullanılabilir12,13. B lenfositlerini ayırmak için yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeye ek olarak, bazı araştırmacılar B lenfositlerini12 seçmek için bir manyetik hücre sıralayıcı kullanır. Bununla birlikte, manyetik ayırma pahalı, karmaşık ve zaman alıcı bir işlemdir. Bu yöntemler B lenfositlerini yüksek başarı oranı ile ölümsüzleştirmek için faydalı olsa da, çok sayıda klinik örneğin tedavi edilmesi gerekliliği ve nispeten küçük hacimdeki kan, kalıcı hücre hattı oluşturulması için daha basit bir yöntem gerektirmektedir.
Daha az yaygın olarak kullanılan bir başka yöntem, EBV enfeksiyonu ve B-LCL'lerin kurulması için çekirdekli hücrelerin kaynağı olarak tam kanın kullanılmasıdır. Bu yöntemler, ayırma prosedürünü atlayarak tekniği basitleştirir. Hücre hatlarını elde etmek için sadece küçük bir miktar, taze14 veya dondurulmuş15,16 tam kan yeterlidir. Ne yazık ki,15,16 numaralı belgelerden ve birkaç doğrulama testimizin başarısında büyük farklılıklar vardır. Ayrıca, dönüştürülmüş koloniler, büyük kirletici safsızlıklar nedeniyle mikroskop altında neredeyse hiç tanınmaz. Bu nedenle, dönüşüm için daha güvenilir bir yöntem gereklidir.
Yukarıdaki düşüncelere dayanarak, lenfositlerin önceden saflaştırılması olmadan B-LCL'leri oluşturmak için kırmızı kan hücresi lizis yöntemi olarak adlandırılan yeni bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem uygundur, zaman kazandırır ve çok sayıda numuneye uygulanabilir. Bebeklerden ve yaşlılardan sağlıklarına önemli ölçüde zarar vermeden kolayca elde edilebilen B-LCL'leri elde etmek için 0.5 mL kadar az tam kan yeterliydi.

<table><tbody><tr><td>Santrifüj</td><td>Techcomp</td><td>CT6T</td><td>Santrifüjleme</td></tr><tr><td>Otomatik Hücre Sayacı&nbsp;</td><td>Countstar</td><td>&nbsp; IC 1000&nbsp;</td><td>Hücre sayımı için&nbsp;</td></tr><tr><td>Epoch Mikroplaka Spektrofotometresi</td><td>BioTek Instruments</td><td>SN263839</td><td>Absorbansı ölçmek için</td></tr><tr><td>96 kuyulu hücre kültürü kümesi</td><td>Corning Incorporated</td><td>3599</td><td>Polistiren plakalar</td></tr><tr><td>24 kuyulu hücre kültürü kümesi</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>Polistiren plakalar</td></tr><tr><td>25 cm2 hücre kültürü şişesi</td><td>Nest</td><td>707001</td><td>Polistiren ve nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>B-LCL'lerin Bileşeni Orta</td></tr><tr><td>RPMI Orta 1640</td><td>Gibco</td><td>31800-022</td><td>B-LCL'ler için orta</td></tr><tr><td>L-Glutamin&nbsp; &nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0374</td><td>B-LCL'lerin bileşeni</td></tr><tr><td>ortam 100x streptomisin penisilin çözeltisi BioRoYeeBRY-2309</td><td>BioRoYee</td><td>BRY-2309</td><td>B-LCL'lerin orta</td></tr><tr><td>Ficoll paque artı</td><td>GE&nbsp; Sağlık Hizmetleri</td><td>17-1440-03</td><td>in vitro lenfosit izolasyonu için</td></tr><tr><td>PHA-M</td><td>Sigma</td><td>L8902</td><td>Lenfosit proliferasyonunu uyarmak için</td></tr><tr><td>Cyclosporin A</td><td>Cayman&nbsp; Kimyasal</td><td>12088</td><td>T hücrelerinin sitotoksisite etkisini inhibe etmek için</td></tr><tr><td>Kırmızı hücre lizis tamponu</td><td>Tiangen</td><td>RT122-01</td><td>Kırmızı kan hücresini parçalamak için</td></tr><tr><td></td><td>MTT Amresco</td><td>0793</td><td>Hücre canlılığının tespiti için</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Hücreleri dondurmak için</td></tr></tbody></table>

b lenfoblastoid hücre dizilerinde kurulması için basit kırmızı kan hücresi lizis yöntemi

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

B lenfositlerinin Epstein Barr virüsü tarafından in vitro olarak ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarına dönüştürülmesi için bir dizi yöntem mevcuttur. Kırmızı kan hücresi parçalama yöntemi olan B-LCL'lerin kurulması için güçlü ve basit bir stratejiye sahip yeni bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, kırmızı kan hücresi çıkarılması ile PBMC ayırma prosedürünü basitleştirdi ve %100 başarı oranıyla nispeten kısa bir sürede büyük hücre sayılarına çoğalabilen EBV ölümsüzleştirilmiş hücre hatları oluşturmak için 0,5 mL kadar az tam kan kullandı. Yöntem basit, güvenilir, zaman kazandıran ve çok sayıda klinik numunenin tedavisi için uygulanabilir.

Dönüşüm işlemi sırasında hücrelerin morfolojik değişimler ışık mikroskobu (Şekil 2) tarafından görüntülenmiştir. Hücre parçaları yalnızca kalın tabaka alyuvar lisiz yöntemi görebilir ise küçük hücre kümeleri, 7 günlük enfeksiyon sonrası yoğunluk gradyan ayırma yöntemi ile açık bir şekilde görülebildi. Bununla birlikte, lenfoblastoid hücre kümeleri 30 gün enfeksiyondan hücre parçalarının kalın bir tabaka altında görebilir. daha sık orta değişiklikle, hücre enkaz azalır ve...

B-LCLs&#39;in kurulması için basit bir kırmızı kan hücre parçalama yöntemi kan küçük bir miktar gerektiren ve dondurarak saklama için başlangıcından itibaren zaman tasarrufu, yüksek ölümsüzleşme verimliliği ile geliştirilmiştir.

B lenfoblastoid hücre dizilerinde Kurulması için Basit Kırmızı Kan Hücresi Lizis Yöntemi

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Bu basit yöntemin genel amacı, sadece az miktarda kan kullanarak ve başlatma ile kriyoprezervasyon arasındaki süreyi kısaltarak, yüksek ölümsüzleştirme verimliliğine sahip B lenfoblastoid hücre hatları veya B-LCL'ler oluşturmaktır. Bu, eritrositlerin liz edilmesi yoluyla tam kandan insan B hücrelerini ölümsüzleştirmek için kullanılan yeni bir yöntemdir. B-LCL'ler, çeşitli çalışmalar yürütmek için değerli biyomalzeme kaynakları sağlar.Bu yöntemin temel avantajı, ölümsüzleştirme verimliliği ve yüksek hücre canlılığına sahip B-LCL'ler elde etmek için yalnızca 0,5 mililitre kanın yeterli olmasıdır. Epstein-Barr virüsü (EBV) ile B lenfositlerini dönüştürerek B-LCL'ler oluşturmak için yaygın olarak kullanılan yöntem, Ficoll yoğunluk gradyanı santrifügasyonu ile periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC) ayırmaktır. Ancak, örnek miktarı bir mililitreden az olduğunda, eritrosit lizisi başarısız olacaktır.Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, yoğunluk gradyanı ayırma yöntemi kullanarak küçük kırmızı kan hücrelerinden PBMC izole etmenin zor olduğunu fark ettiğimizde ortaya çıktı. EBV hazırlamak için, birinci günde B95-8 hücrelerini çözerek başlayın ve %10 FBS, 2 mM L-glutamin ve antibiyotiklerle desteklenmiş altı mililitre tam RPMI 1640 Medium içeren bir T25 kültür flaskında kültüre edin. Kültürü 37 °C ve %5 karbondioksit altında inkübe edin.İkinci günde, mikroskop altında hücre morfolojisini gözlemleyin. Hücreler parlak ve yuvarlak olduklarında durumları iyidir. Kültüre 10 milliliters tam RPMI 1640 Medium ekleyin.Dördüncü günde, 10 milliliters taze besiyeri ekleyin ve hücreleri bir T75 kültür flaskına aktarın. Ardından, sekizinci günde 20 milliliters daha besiyeri ekleyin ve taze besiyeri eklemeden hücreleri sekiz gün boyunca sürdürün. 16. günde, hücreleri mikroskop altında kontrol edin.Ardından, 12 mililitre hücreyi 15 mililitrelik santrifüj tüplerine toplayın. Daha sonra, hücreleri eksi 80 °C'de bir saat boyunca kriyoprezerve edin ve kültürleri 37 °C'de hızla çözün. Virüs partikülleri hücrelerden salınana kadar dondurma-çözme işlemini üç kez daha tekrarlayın.Kültürleri oda sıcaklığında, 240 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, süpernatantı 0,22 micron filtreden süzün. Filtratın tüp başına 12 mL'lik alikotlarını hazırlayın ve tüpleri -80 °C'de saklayın.50 mililitrelik bir tüpe, EDTA K2 ile antikoagüle edilmiş 0,5 mililitre tam kan ekleyin. Tam kanın üzerine bir mililitre eritrosit liziz tamponu ekleyin ve iyice karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında dört dakika boyunca inkübe edin. Ardından, liziz reaksiyonunu durdurmak için hızlıca beş ila yedi mililitre 1x PBS ekleyin.Kana kırmızı kan hücresi liziz tamponu ekledikten sonra iyice karıştırdığınızdan emin olun. Ters yüz etme işlemi, reaksiyonun zamanında sonlandırılmasını sağlar. Ardından, tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 240 ×g'de santrifüjleyin.Beyaz kan hücreleri tüpün dibine çökecektir. Süpernatantı atın ve yedi mililitre 1640 Basic Medium ekleyerek çökeleği yıkayın. Ardından, yıkama işlemini tekrarlamadan önce çözeltiyi santrifüjleyin.Hücre peletini 300 µL transformasyon ortamı ile yeniden süspande edin. Ardından EBV enfeksiyonunu gerçekleştirmek için, hücre süspansiyonuna 20 µg/mL konsantrasyonunda 60 µL Siklosporin A ekleyin. Bir EBV alikotunu 37 °C'de hızlıca çözdürün ve hücrelere 240 µL virüs ekleyin.Süspansiyonu iyice karıştırın ve 96 kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa 200 µL aktarın. Ardından plakayı 37 °C ve %5 CO2 ortamında inkübe edin. EBV enfeksiyonundan sonraki ilk ay boyunca, hücre kültürü ortamının yarısını haftada bir kez değiştirin.Yedinci günde, mikroskop altında yalnızca kalın bir hücre fragmanları tabakası görülür. Enfeksiyonun bir ayı dolduktan sonra, kalın bir hücre fragmanları tabakasının altında lenfoblastoid hücre kümeleri görülür. Bu noktadan itibaren, hücre kümeleri mikroskop altında net bir şekilde görülene kadar her üç günde bir besiyerinin yarısını değiştirin.Hücreleri yeniden süspanse ettikten sonra, süspansiyonu 24 kuyucuklu bir plağın kuyucuklarına aktarın. Ardından, hücre büyüme hızına bağlı olarak, kültür ortamı sarıya döndüğünde, tamamlayıcı RPMI 1640 Medium hacmini iki katına çıkarın. Lenfoblastoid hücre kümeleri çıplak gözle görülebildiğinde, kültürü bir T25 kültür flaskına aktarın.Kültür ortamı sarardığında, hacim 10 ila 15 mililitreye çıkana kadar ortam hacmini iki katına çıkarın. Dondurmadan 24 saat önce ortamı değiştirin. Ardından hücreleri dondurmak için hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve hücreleri saymak için bir hücre sayacı kullanın.%90 FBS ve %10 DMSO içeren dondurulmuş stok solüsyon ile süspansiyonu mililitre başına 5 ila 10 x 10⁶ hücre yoğunluğuna ayarlayın. Ardından, dondurulmuş hücreleri doğrudan sıvı azota aktarmadan önce, süspansiyonu dakikada bir santigrat derece hızla -80 °C'ye kadar dondurun. Transformasyon sürecinde, hücrelerin morfolojik değişiklikleri ışık mikroskobu ile gözlemlenebilir.Enfeksiyonun yedinci gününden sonra, yoğunluk gradyanı ayırma yöntemi kullanıldığında küçük hücre kümeleri net bir şekilde görülürken, eritrosit liz yöntemiyle sadece kalın bir hücre fragmanları tabakası görülmektedir. Enfeksiyondan 30 gün sonra, hücre fragmanlarının kalın tabakasının altında lenfoblastoid hücre kümeleri görülür. Besiyeri değişimleri daha sık yapıldığında, hücre döküntüleri azalır ve hücre kümeleri net bir şekilde görülerek yoğunluk gradyanı ayırma ile oluşturulan kültüre benzer bir görünüm kazanır.Son olarak, B-LCL'lerin canlılığını değerlendirmek için MTT testi kullanılmıştır. Burada gösterilen sonuçlar, kırmızı kan hücreleri liziz yöntemi kullanılarak kültüre edilen B-LCL hücrelerinin, yoğunluk gradyanı ayırma yöntemiyle oluşturulan kültürden anlamlı derecede daha canlı olduğunu göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, EBV viral transformasyon işlemi uygun şekilde gerçekleştirildiğinde 30 dakikada tamamlanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, lenfositlerin önceden saflaştırılmasına gerek kalmadan, basit ve zaman kazandıran bir eritrosit liz yöntemiyle B-LCL'lerin nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, EBV ilişkili hastalıkların genomik, transkriptomik ve proteomik çalışmalarının ilerlemesini ve monoklonal antikor üretimindeki uygulamasını hızlandırmıştır. EBV gibi insan patojenleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür uygulanırken her zaman gerekli önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

a-simple-red-blood-cell-lysis-method-for-establishment-b

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bir gen yapısı ve fonksiyonu analizi verimli bir...

B Hücreleri Rekombinant Retroviral Üretim ve Enfeksiyon

Epstein-Barr virüsü ile transforme B hücre hatları üretmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, üç gün sonra enfeksiyon gibi erken olarak dönüşüm geçirmesi mukadder B hücreleri belirleyebilir bir roman tahlil göstermektedir.

Epstein-Barr Virus Büyüme dönüştürülmüş lenfoblastoid hücre dizilerinde kurulması

Tam kan sitotoksisite deneyi (WCA), flüoresans mikroskopisi ve otomatik görüntü işleme ile yüksek verimli hücre konumlandırma teknolojisini içeren tarafından geliştirilmiş bir sitotoksisite analizidir. Burada, bir anti-CD20 antikoru ile tedavi edilen lenfoma hücrelerinin enfekte hücre sitotoksisitesi analiz sağlamak için insan kanında gerçek zamanlı olarak analiz edilebilir açıklar.

İnsan Tüm Kan gerçek zamanlı sitotoksisite deneyleri

Nötrofiller en bol bulunan beyaz kan hücresi türüdür. Nötrofillerin insan kanından yoğunluk gradyan ayırma yöntemi ile izolasyonu ve insan promiyelositik (HL60) hücrelerinin granülositik yol boyunca farklılaşması burada açıklanmaktadır; lenfoma hücrelerinin anti-lenfoma ajanlarına duyarlılığı üzerindeki rolünü test etmek.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Bu yazıda, in vitro ve enjeksiyondan sonra farelerde akut lösemide C1498 hücre kültürlerinin karakterize etmek için kullanılabilen bir teknik prosedürü sağlar. Fenotipik ve fonksiyonel analizler flow sitometri, immünofloresan mikroskopi, histokimya ve Mayıs-Grünwald Giemsa boyama kullanılarak gerçekleştirilir.

Fare C1498 Cep Hattı ve İlişkili Lösemi Fare Modeli Karakterizasyonu için Detaylı Protokolü

Lenfositler, adaptif immün yanıtlarda ana oyunculardır. Burada, in vitro ve in vivo lenfosit aktivasyonunda istenen moleküllerin fizyolojik fonksiyonlarını belirlemek için bir lenfosit saflaştırma protokolü sunuyoruz. Açıklanan deneysel prosedürler, kontrol ve genetik olarak değiştirilmiş lenfositler arasındaki fonksiyonel kapasiteleri karşılaştırmak için uygundur.

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

Biz bu çalışmada bir transgenik fareden türetilen lenfositlerin kullanılarak yeni floresans bazlı analiz sunuyoruz. Bu deney, inhibe veya lenfosit aktivasyonunu teşvik ya kapasitesine sahip küçük moleküller, yüksek verimli tarama (HTS) için uygundur.

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

T-lenfosit mitogenezine blastojenik transformasyon eşlik eder, bunun üzerine hücre hacmi hücre bölünmesinden önce genişler. Burada, hücre çaplarını ölçme yeteneğine sahip otomatik bir hücre sayacı kullanarak T lenfositlerinde blastogenezi ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Bağışıklık ilaçlarının tanımlanmasında T lenfositlerinde mitojen kaynaklı blastojenez hızlı bir şekilde belirlenmesini

NK ve T Hücre klonlar CAEBV hastalardan elde etmek için basit bir yöntem yüksek verimlilik, periferik kan küçük bir miktar ve düşük doz IL-2 ile geliştirilmiştir.

NK ve kronik aktif Epstein - Barr virüsü enfeksiyonu olan hastalarda T hücre satırlarından kurmak için etkili ve basit bir yöntem

Kronik Lenfositik Lösemi (CLL) Batı dünyasında en sık görülen lösemi var. NFAT transkripsiyon faktörleri önemli düzenleyiciler geliştirme ve harekete geçirmek içinde çok sayıda hücre tipleri vardır. Burada, NFAT2, roman hedef genlerin tanımlamak için insan CLL hücrelerinde kromatin immunoprecipitation (ChIP) kullanımı için bir iletişim kuralı mevcut.

Roman NFAT2 hedef genleri kronik lenfositik lösemi olarak tanımlamak için bir kromatin Immunoprecipitation tahlil

Burada, enfeksiyonun kan aşamasında Plasmodium'a hücresel bağışıklık mekanizmalarını aydınlatmaya yardımcı olacak yeni bir yöntem tarif ediyoruz. Bu, sitotoksik lenfositler tarafından enfekte kırmızı kan hücresi öldürmeyi ölçen in vitro bir testtir.

In Vitro Sitotoksik Lenfositler Tarafından Plazmodyum ile Enfekte Kırmızı Kan Hücresi Öldürme Testi

Öğrenin, B lenfoblastoid hücre hatlarını (B-LCL) kurmak için basit kırmızı kan hücresi lizis yöntemini. Sadece 0,5 mililitre kanla yüksek canlılıkta hücre elde edin ve zamandan tasarruf edin.

B lenfoblastoid hücre dizilerinde Kurulması için Basit Kırmızı Kan Hücresi Lizis Yöntemi

Daha fazla video keşfet