B lenfoblastoid hücre dizilerinde Kurulması için Basit Kırmızı Kan Hücresi Lizis Yöntemi

Bu basit yöntemin genel amacı, sadece az miktarda kan kullanarak ve başlatma ile kriyoprezervasyon arasında zaman tasarrufu sağlayarak yüksek ölümsüzleştirme verimliliğine sahip B lenfoblastoid hücre hatları veya B-LCL'ler oluşturmaktır. Bu, kırmızı kan hücrelerini parçalayarak insan B hücrelerini tam kandan ölümsüzleştirmek için yeni bir yöntemdir. B-LCL'ler, çeşitli çalışmaları yürütmek için değerli bir biyo-malzeme kaynağı sağlar.

Bu yöntemin temel avantajı, ölümsüzleştirme etkinliği ve yüksek hücre canlılığına sahip B-LCL'leri elde etmek için sadece 0,5 mililitre kanın yeterli olmasıdır. Epstein-Barr virüsü veya EBV ile B-LCL'leri oluşturmak, yaygın olarak kullanılan yöntem olan B lenfositlerini Ficoll yoğunluk gradyan santrifüjlemesi ile ayrı periferik kan mononükleer hücrelerine veya PBMC'ye dönüştürmek. Bununla birlikte, numune kırmızı kan hücresi lizizinin bir mililitresinden daha az olduğunda, ekleme başarısız olacaktır.

Bu yöntem için ilk olarak, PBMC'yi küçük kırmızı kan hücrelerinden izole etmenin bir yoğunluk gradyan ayırma yöntemi kullanarak zor olduğu zaman aklımıza geldi. EBV'yi hazırlamak için, birinci gün B95-8 hücrelerini çözerek başlayın ve bunları% 10 FBS, iki milimolar L-glutamin ve antibiyotiklerle desteklenmiş altı mililitre tam RPMI 1640 Ortamında bir T25 kültür şişesinde kültürleyin. Kültürü 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

İkinci gün, mikroskop altında hücre morfolojisini gözlemleyin. Hücreler parlak ve yuvarlak olduklarında iyi durumdadır. Kültüre 10 mililitre tam RPMI 1640 Medium ekleyin.

Dördüncü günde, 10 mililitre taze ortam ekleyin ve hücreleri bir T75 kültür şişesine aktarın. Daha sonra, sekizinci günde, 20 mililitre daha fazla ortam ekleyin ve hücreleri taze ortam eklemeden sekiz gün boyunca koruyun. 16. günde, hücreleri mikroskop altında kontrol edin.

Daha sonra 12 mililitre hücreyi 15 mililitrelik santrifüj tüplerine toplayın. Daha sonra, hücreleri eksi 80 santigrat derecede bir saat boyunca kriyoprezervasyon yapın ve kültürleri 37 santigrat derecede hızla çözün. Virüs parçacıkları hücrelerden salınana kadar donma çözülmesini üç kez daha tekrarlayın.

Kültürleri oda sıcaklığında 240 kez g'de 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı 0.22 mikron filtreden süzün. Tüp başına 12 mililitre süzüntü alın ve tüpleri eksi 80 santigrat derecede saklayın.

50 mililitrelik bir tüpe, EDTA K2 tarafından antikoagüle edilmiş 0,5 mililitre tam kan ekleyin. Tam kana bir mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin ve iyice karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında dört dakika inkübe edin. Ardından, lizis reaksiyonunu durdurmak için hızlı bir şekilde beş ila yedi mililitre 1x PBS ekleyin.

Kana kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekledikten sonra, iyice karıştırdığınızdan emin olun. Ters çevirme, reaksiyonun zamanında sonlandırılmasını sağlar. Daha sonra, tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 240 kez g santrifüjleyin.

Beyaz kan hücreleri tüpün dibinde çökelir. Süpernatanı atın ve yedi mililitre 1640 Temel Orta ekleyerek çökeltiyi yıkayın. Daha sonra yıkamayı tekrarlamadan önce çözeltiyi santrifüjleyin.

300 mikrolitre dönüşüm ortamı ile hücre peletini yeniden süspanse edin. Daha sonra EBV enfeksiyonunu gerçekleştirmek için, hücre süspansiyonuna mililitre başına 60 mikrolitre 20 mikrogram Siklosporin A ekleyin. EBV'nin bir kısmını 37 santigrat derecede hızlı bir şekilde çözün ve hücrelere 240 mikrolitre virüs ekleyin.

Süspansiyonu iyice karıştırın ve oyuk başına 200 mikrolitreyi 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Daha sonra plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. EBV enfeksiyonundan sonraki ilk ay boyunca, hücre kültüründeki ortamın yarısını haftada bir kez değiştirin.

Yedinci günde, mikroskop altında sadece kalın bir hücre parçası tabakası görülebilir. Enfeksiyondan bir ay sonra, lenfoblastoid hücre kümeleri kalın bir hücre parçaları tabakası altında görülebilir. Bu noktadan itibaren, hücre kümeleri mikroskop altında net bir şekilde görünene kadar her üç günde bir ortamın yarısını değiştirin.

Hücreleri yeniden askıya aldıktan sonra, süspansiyonu 24 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın. Daha sonra hücre büyüme hızına bağlı olarak, kültür ortamı sarıya döndüğünde, tam RPMI 1640 Ortamının hacmini iki katına çıkarın. Lenfoblastoid hücre kümeleri çıplak gözle görüldüğünde, kültürü bir T25 kültür şişesine aktarın.

Kültür ortamı sarardıkça, hacim 10 ila 15 mililitreye genişleyene kadar ortamın hacmini iki katına çıkarın. Dondurmadan önce, ortamı 24 saat önceden değiştirin. Daha sonra hücreleri dondurmak için hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve hücreleri saymak için bir hücre sayacı kullanın.

% 90 FBS ve% 10 DMSO içeren donmuş stok çözeltisi ile, süspansiyonu mililitre başına beş ila 10 kez 10 ila altıncı hücre yoğunluğuna ayarlayın. Daha sonra, donmuş hücreleri doğrudan sıvı nitrojene aktarmadan önce süspansiyonu dakikada bir santigrat derece ila eksi 80 santigrat derece arasında dondurun. Dönüşüm süreci sırasında, hücrelerin morfolojik değişiklikleri ışık mikroskobu ile görülebilir.

Yedi günlük enfeksiyondan sonra, küçük hücre kümeleri yoğunluk gradyan ayırma yöntemi kullanılarak açıkça görülebilirken, kırmızı kan hücresi lizis yönteminden sadece kalın bir hücre parçası tabakası görülebilir. Enfeksiyondan 30 gün sonra, lenfoblastoid hücre kümeleri, kalın hücre parçaları tabakasının altında görülebilir. Daha sık ortam değişiklikleriyle, hücre kalıntıları azalır ve hücre kümeleri açıkça görülebilir ve yoğunluk gradyan ayrımı ile oluşturulan kültüre benzer görünür.

Son olarak, B-LCL'lerin yaşayabilirliğini değerlendirmek için MTT testi kullanıldı. Burada gösterilen sonuçlar, kırmızı kan liziz yöntemi kullanılarak kültürlenen B-LCL hücresinin, yoğunluk gradyan ayırma yöntemi kullanılarak oluşturulan kültürden önemli ölçüde daha canlı olduğunu göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, EBV viral dönüşüm süreci, uygun şekilde gerçekleştirildiğinde 30 dakika içinde yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, daha önce lenfositlerin saflaştırılması olmadan basit ve zaman kazandıran bir kırmızı kan hücresi lizis yöntemi ile B-LCL'lerin nasıl kurulacağını iyi anlamış olmalısınız. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, EBV ile ilişkili hastalıkların genomik, transkriptomik ve proteomik çalışmalarının ilerlemesini ve bu uygulamanın mononükleer antikorların üretiminde ilerlemesini hızlandırdı. EBV gibi insan patojenleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman önlem alınması gerektiğini unutmayın.