İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

Bu yöntemin genel amacı, evreye özgü bir sinyal manipülasyonu yaklaşımı kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin Diferansiyasyonunu Primitif veya Definitif Hematopoetik Program'a yönlendirmektir. Bu yöntem, insan definitif hematopoiezinin sinyal ve transkripsiyonel regülatörlerinin anlaşılması gibi alandaki birçok temel soruyu yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, evreye özgü manipülasyonu anlık olarak uygulamasıdır.

Bu prosedürü, laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Carissa Dege uygulamaktadır. Protokole başlamak için, daha önce hazırlanmış, fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler) üzerinde %70 ila %80 konfluens düzeyine ulaşana kadar %5 CO2 içeren 37 °C'lik bir inkübatörde büyütülmüş İnsan Pluripotent Kök Hücre Hatlarını (HPSC'ler) temin edin. HPSC medyasını aspire edin ve her bir kuyucuğa bir dakika boyunca bekletilmek üzere 37 °C'de 1 mL %0,25 Trypsin EDTA ekleyin.

Bir dakika sonra, Trypsin'i aspire edin ve her kuyucuğa bir mililitre stok besiyeri ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri plakadan kazıyın. Ardından, her kuyucuğa bir mililitre yıkama tamponu ekleyin.

İki mililitrelik bir serolojik pipet yardımıyla, büyük kümeleri dağıtmak için hücreleri üç ila beş kez triture edin. Ardından hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. HPSC'leri 330 x G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüj işleminin ardından, HPSC medyumu ekleyin ve hücreleri yeniden süspande edin. Daha sonra, MAT kodlu plastik malzemelerin her bir kuyucuğuna iki mililitre yeniden süspande edilmiş HPSC ekleyin ve hücreleri gece boyunca inkübe edin. 24 saat sonra, medyumu aspire edin ve yerine bir dakika boyunca 37 °C 0.05% Trypsin EDTA ekleyin.

Trypsin EDTA'yı aspire edin. Bir mililitre stok besiyeri ekleyin ve hücreleri bir hücre kazıyıcı ile güçlü bir şekilde kazıyın. Ardından bir mililitre yıkama besiyeri ekleyin.

İki mililitrelik bir serolojik pipet ile hücreleri üç kez tritüre edin ve 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 220 x G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından besiyerini aspire edin, 20 mililitre yıkama besiyeri ekleyin ve hücreleri nazikçe yeniden süspande etmek için beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanın.

Santrifüjleme ve aspirasyon işlemlerinden sonra, Embrioid Cisimleri veya EB'leri Gün Sıfır medyumunda dikkatlice yeniden süspande edin. EB'leri içeren iki mililitre diferansiyasyon medyumunu, on mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak altı kuyucuklu düşük yapışkanlığa sahip bir hücre kültür kabının her bir kuyucuğuna paylaştırın. EB'leri 37 °C, %5 CO2, %5 O2 değerlerine sahip bir multigas inkübatöre yerleştirin.

Yirmi dört saat sonra, iki mililitre Birinci Gün medyumu ekleyin. Hücreleri multigas inkübatörde gece boyunca inkübe edin. 18 saat sonra, EB'leri beş mililitrelik bir serolojik pipetle nazikçe toplayın ve beş dakika boyunca 100 x G'de santrifüj edin.

Kültürün tamamını yıkayın ve on mililitre Iscove's Modified Dulbecco Medium veya IMDM ile birleştirin. Kalıntıları uzaklaştırmak için kültürü 100 X G'de beş dakika boyunca tekrar santrifüjledikten sonra medyumu aspire edin. EB'leri bir P1000 pipet kullanarak Day Two Media ile nazikçe yeniden süspande edin.

Ardından, altı kuyucuklu düşük yapışkanlı hücre kültürü plakalarının her bir kuyucuğuna iki mililitre EB dağıtın. Definitif veya primitif hematopoetik progenitörleri belirlemek için sırasıyla üç mikromolar CHIR99021 veya IWP2 ekleyin. Plağı 37-derece Celsius sıcaklıktaki bir multigas inkübatörde 30 saat boyunca inkübe edin.

30 saat sonra, EB'leri iki mililitrelik bir serolojik pipetle 50 mililitrelik konik bir tüpe aktararak izole edin ve 330 x G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. EB'leri nazikçe yeniden süspanse edin ve 10 mililitre IMDM ile yıkayın. EB'leri Üçüncü Gün Besiyerinde yeniden süspanse edin ve düşük yapışma özelliğine sahip altı kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna ikişer mililitre dağıtın.

Hücreleri 37 °C'lik bir çok gazlı inkübatörde 72 saat inkübe edin. 72 saatlik inkübasyonun ardından, her kuyucuğa iki mililitre Day Six Media ekleyin. Daha sonra EB'leri 37 °C'lik bir çok gazlı inkübatörde ek olarak 48 saat inkübe edin.

Diferansiyasyonun sekizinci gününde CHIR99021 ile işlem görmüş EB'leri izole edin ve bir sonraki bölüme geçin. EB'leri 330 x G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin.

Ardından EB'lere iki mililitre %0,25 Trypsin EDTA ekleyin. EB'leri beş saniye boyunca vorteksleyin ve EB'leri 37 °C'lik bir su banyosunda sekiz dakika inkübe edin. Daha sonra beş mililitre durdurma çözeltisi ekleyin ve EB'leri santrifüjleyin.

Ardından süpernatanı aspire edin. EB'leri beş mililitre Collagenase II içerisinde yeniden süspande edin. Tüpü beş saniye boyunca vorteksleyin ve ardından EB'leri 37-degree Celsius sıcaklıktaki bir su banyosunda inkübe edin. 60 dakika sonra, EB'leri beş saniye boyunca vorteksleyin ve beş mililitre durdurma çözeltisi ekleyin.

Santrifüjden sonra, süpernatanı aspire edin ve hücreleri bir mililitre FACS tamponunda yeniden süspande edin. Ayrışmamış hücre kümelerini uzaklaştırmak için hücreleri 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. Antikor markalaması ve CD34-pozitif hemojenik endotelyal progenitörlerin FACS izolasyonu ile devam edin.

FACS izolasyonunun ardından, hücreleri HE ortamında yeniden süspande edin. Hücreleri 96 kuyucuklu düşük yapışkanlıklı bir kültür plakasına 50 µL'lik alikotlar halinde dağıtın ve ardından hücreleri gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, hematopoetik progenitörler altı ila on hücreli kümeler halinde agregasyon göstermelidir.

Yeniden agreglemiş hücrelerden oluşan 50-µL'lik hacimleri, 24 kuyucuklu MAT kodlu bir plakanın merkezine dikkatlice aktarın. Hücreler yapışana kadar plakayı dört ila altı saat boyunca multigas inkübatöre nazikçe yerleştirin. Hücrelerin yapışmasına izin vermek için dört ila altı saat sonra, her bir kuyucuğa taze hazırlanmış 1 mL HE medyumu yavaşça ekleyin.

Hematopoetik hücreler görünene kadar hücreleri çok gazlı inkübatörde inkübe edin. Ardından, HE medyumunu hücrelerden nazikçe uzaklaştırarak ve akış kısmını toplamak için 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirerek definit hematopoetik progenitörleri hasat edin. Kalan aderent hücreler için, hücrelere 0,5 mililitre %0,25 Trypsin EDTA ekleyin ve bunları 37 derece Celsius'lik bir inkübatörde beş dakika boyunca inkübe edin.

Tripsinizasyon sonrası, her kuyucuğa 0,5 mililitre durdurma solüsyonu ekleyin. Tüm yapışkan ve yapışmayan hücreleri bir araya toplamak için hücreleri aynı 40 mikronluk hücre süzgecinden geçirin ve hücreleri santrifüjleyin. OP9 besiyerindeki OP9 DL4 hücrelerinin bulunduğu bir kuyucuğa, FACS ile izole edilmiş 2.000 ila 10.000 hücre ekleyin.

37 °C sıcaklıkta ve %5 CO2 içeren bir inkübatörde inkübe edin. Hücreleri her dört ila beş günde bir pasajlamak için, hücreleri 1 mL'lik bir pipetle triture edin. Topaklanmaları gidermek için 40 µm'lik bir filtreden geçirin.

Santrifüjden sonra medyumu aspire edin. Hücreleri iki mililitre taze T-hücresi medyumunda yeniden süspanse edin ve taze OP9 DL4 hücrelerinin üzerine yerleştirin. En az 21 günlük soğuk kültürden sonra, hücreleri güçlü bir şekilde trite edin ve hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için 40 mikronluk bir filtreden geçirin.

330 x G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve ardından standart akış sitometrisi ile devam edin. Akış sitometrisi, IWP2 ile işlem görmüş diferansiyasyon kültürlerinin belirgin bir CD34 pozitif, CD43 negatif ve CD34 düşük CD43 pozitif popülasyon verdiğini göstermektedir. CHIR ile işlem görmüş diferansiyasyon kültürlerinde ise diferansiyasyonun sekizinci gününde CD43 pozitif hücre oranı %1'in altındadır.

Dokuzuncu günde izole edilen IWP2 koşulları altında türetilmiş primitif hematopoetik progenitörler, metilselüloz analizlerinde ağırlıklı olarak primitif eritroid ve myeloid progenitörler oluşturacaktır. CHIR99021 tedavisiyle türetilen CD34 pozitif CD43 negatif popülasyon; endotelyal progenitörlerin yanı sıra CD34 pozitif, CD43 negatif, CD73 negatif, CD184 negatif hemojen endotel içeren heterojen bir popülasyondur; bu popülasyon FACS ile izole edildiğinde başlangıçta endotel benzeri hücrelerden oluşan bir monolayer oluşturacak ve ardından yuvarlak, refraktil, yapışkan olmayan hematopoetik hücrelerle sonuçlanan bir endotelyal-hematopoetik geçiş geçirecektir. Bu hematopoetik hücreler, CD34 ve CD45 ekspresyonu açısından akış sitometrisi ile değerlendirilebilir.

EHT analizlerinden izole edilen hematopoetik progenitörler, metilselüloz analizlerinde kullanılabilir ve büyük, burst benzeri eritroid koloni oluşturan birimler, küçük eritroid koloni oluşturan birimler ve miyeloid progenitörlerin oluşmasını sağlar. CHIR99021 türevli CD34 pozitif, CD43 negatif, CD73 negatif, CD184 negatif hematopoetik progenitörlerin ve IWP2 türevli CD34 pozitif, CD43 negatif hematopoetik progenitörlerin T-lenfosit analiz potansiyellerine ilişkin bu temsili akış sitometrisi analizleri, CHIR türevli progenitörlerde CD45 pozitif, CD56 negatif, CD4 pozitif, CD8 pozitif bir popülasyonun varlığını göstermekte olup bu durum, başlangıçtaki CD34 pozitif popülasyon içindeki hematopoetik potansiyelin göstergesidir. Bu videoyu izledikten sonra, insan pluripotent kök hücrelerinin primitif veya definit hematopoetik progenitörlere nasıl farklılaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.