İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

Bu yöntemin genel amacı, İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin Farklılaşmasını, aşamaya özgü bir sinyal manipülasyonu yaklaşımı kullanarak İlkel veya Kesin Hematopoietik Programa yönlendirmektir. Bu yöntem, insan kesin hematopoezinin sinyal ve transkripsiyonel düzenleyicilerini anlamak gibi alandaki birçok önemli soruyu ele alabilir. Bu tekniğin temel avantajı, anında aşamaya özgü manipülasyon kullanmasıdır.

Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Carissa Dege'dir. Protokole başlamak için, fare embriyonik lif patlamaları veya MEF'ler üzerinde yetiştirilen önceden hazırlanmış İnsan Pluripotent Kök Hücre Hatları veya HPSC'leri, yüzde beş CO2 ile 37 derecelik bir inkübatörde %70 ila %80 oranında birleşene kadar elde edin. HPSC ortamını aspire edin ve her bir oyuğa bir dakika boyunca bir mililitre 37 santigrat derece %0.25 Tripsin EDTA ekleyin.

Bir dakika sonra, Tripsin'i aspire edin ve her oyuğa bir mililitre stok ortamı ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, hücreleri plakadan kazıyın. Ardından, her kuyucuğa bir mililitre yıkama tamponu ekleyin.

İki mililitrelik serolojik bir pipetle, büyük kümeleri parçalamak için hücreleri üç ila beş kez ezin. Ve hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. HPSC'leri beş dakika boyunca 330 x G'de santrifüjleyin.

Döndürmeden sonra, HPSC ortamını ekleyin ve hücreleri yeniden askıya alın. Daha sonra, MAT kodlu plastik eşyaların her bir kuyucuğuna iki mililitre yeniden askıya alınmış HPSC ekleyin ve hücreleri gece boyunca inkübe edin. 24 saat sonra, ortamı aspire edin ve bir dakika boyunca 37 santigrat derece% 0.05 Tripsin EDTA ile değiştirin.

Tripsin EDTA'yı aspire edin. Bir mililitre stok ortamı ekleyin ve hücreleri bir hücre kazıyıcı ile kuvvetlice kazıyın. Ardından bir mililitre yıkama ortamı ekleyin.

İki mililitrelik serolojik bir pipetle, hücreleri üç kez ezin ve 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri beş dakika boyunca 220 x G'de santrifüjleyin. Daha sonra ortamı aspire edin, 20 mililitre yıkama ortamı ekleyin ve hücreleri nazikçe yeniden süspanse etmek için beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanın.

Santrifüjleme ve aspirasyondan sonra, Embriyoid Cisimleri veya EB'leri Sıfırıncı Gün ortamında dikkatlice yeniden askıya alın. On mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak altı oyuklu düşük yapışmalı bir hücre kültürü kabının her bir oyuğuna EB'ler içeren iki mililitre farklılaşma ortamı dağıtın. EB'leri 37 santigrat derece yüzde beş CO2, yüzde beş O2 çoklu gaz inkübatörüne yerleştirin.

Yirmi dört saat sonra, iki mililitre Birinci Gün ortamı ekleyin. Hücreleri gece boyunca çok gazlı bir inkübatörde inkübe edin. 18 saat sonra, EB'leri beş mililitrelik serolojik bir pipetle nazikçe hasat edin ve beş dakika boyunca 100 x G'de döndürün.

Tüm kültürü yıkayın ve on mililitre Iscove'un Modifiye Dulbecco Medium veya IMDM ile birleştirin. Kalıntıları temizlemek için kültürü beş dakika boyunca 100 X G'de tekrar döndürdükten sonra, ortamı aspire edin. EB'leri bir P1000 pipeti kullanarak İkinci Gün Ortamı ile nazikçe yeniden askıya alın.

Daha sonra, kuyucuk başına iki mililitre EB'yi altı oyuklu düşük yapışmalı hücre kültürü plakalarına dağıtın. Sırasıyla kesin veya ilkel hematopoetik progenitörleri belirtmek için üç mikromolar CHIR99021 veya IWP2 ekleyin. Plakayı 37 derece santigrat derece çoklu gaz inkübatörde 30 saat inkübe edin.

30 saat sonra, EB'leri iki mililitrelik bir serolojik pipetle 50 mililitrelik bir konik tüpe aktararak ve beş dakika boyunca 330 x G'de santrifüjleyerek izole edin. EB'leri nazikçe yeniden askıya alın ve 10 mililitre IMDM ile yıkayın. EB'leri Üçüncü Gün Ortamında yeniden askıya alın ve düşük yapışmalı altı oyuklu plakaların her bir oyuğuna iki mililitre dağıtın.

Hücreleri 37 derecelik bir çoklu gaz inkübatörde 72 saat boyunca inkübe edin. 72 saatlik inkübasyondan sonra, her oyuğa iki mililitre Altıncı Gün Ortamı ekleyin. Daha sonra EB'leri 37 santigrat derecelik bir çoklu gaz inkübatörde 48 saat daha inkübe edin.

Farklılaşmanın sekizinci gününde CHIR99021 ile tedavi edilen EB'leri izole edin ve bir sonraki bölüme geçin. EB'leri beş dakika boyunca 330 x G'de santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin.

Daha sonra EB'lere iki mililitre% 0.25 Tripsin EDTA ekleyin. EB'leri beş saniye boyunca vorteksleyin ve Ebs'yi 37 santigrat derecelik bir su banyosunda sekiz dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra beş mililitre durdurma çözeltisi ekleyin ve EB'leri santrifüjleyin.

Sonra süpernatanı aspire edin. EB'leri beş mililitre Kollajenaz II'de tekrar süspanse edin. Tüpü beş saniye boyunca vorteksleyin ve ardından EB'leri 37 derecelik bir su banyosunda inkübe edin. 60 dakika sonra, EB'leri beş saniye boyunca vorteksleyin ve beş mililitre durdurma çözeltisi ekleyin.

Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı aspire edin ve hücreleri bir mililitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Ayrışmamış hücre kümelerini çıkarmak için hücreleri 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. CD34 pozitif hemojenik endotelyal progenitörlerin antikor etiketlemesi ve FACS izolasyonu ile devam edin.

FACS izolasyonunu takiben, HE ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın. Hücreleri 50 mikrolitrelik alikotlar halinde 96 oyuklu düşük yapışmalı bir kültür plakasında dağıtın ve ardından hücreleri gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, hematopoietik progenitörler altı ila on hücreden oluşan kümeler halinde toplanmalıdır.

50 mirolitre hacimdeki yeniden birleştirilmiş hücreleri 24 oyuklu MAT kodlu bir plakanın merkezine nazikçe aktarın. Plakayı, hücreler bağlanana kadar dört ila altı saat boyunca çoklu gaz inkübatöre yavaşça yerleştirin. Dört ila altı saat sonra, hücrelerin yapışmasına izin vermek için, her bir oyuğa yavaşça bir mililitre taze hazırlanmış HE ortamı ekleyin.

Hematopoetik hücreler görünene kadar hücreleri çoklu gaz inkübatörde inkübe edin. Daha sonra, HE ortamını hücrelerden nazikçe çıkararak ve akışı toplamak için 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirerek kesin hematopoetik progenitörleri hasat edin. Kalan yapışkan hücreler için, hücrelere 0,5 mililitre% 0,25 Tripsin EDTA ekleyin ve bunları 37 derecelik bir inkübatörde beş dakika inkübe edin.

Tripsinizasyondan sonra, her kuyucuğa 0,5 mililitre durdurma çözeltisi ekleyin. Tüm yapışık ve yapışık olmayan hücreleri bir araya getirmek ve hücreleri döndürmek için hücreleri aynı 40 mikronluk hücre süzgecinden geçirin. OP9 ortamındaki OP9 DL4 hücrelerinin bir kuyucuğuna 2.000 ila 10.000 FACS izole edilmiş hücre ekleyin.

37 santigrat derece,% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin. Hücreleri her dört ila beş günde bir geçirmek için, hücreleri bir mililitrelik bir pipetle ezin. Topakları çıkarmak için 40 mikronluk bir filtreden geçirin.

Santrifüjlemeden sonra ortamı aspire edin. Hücreleri iki mililitre taze T hücresi ortamında yeniden süspanse edin ve bunları taze OP9 DL4 hücrelerine yerleştirin. En az 21 günlük soğuk kültürden sonra, hücreleri kuvvetlice ezin ve hücre kalıntılarını gidermek için 40 mikronluk bir filtreden geçirin.

Beş dakika boyunca 330 x G'de santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin ve ardından standart akış sitometrisi ile devam edin. Akış sitometrisi, IWP2 ile muamele edilen farklılaşma kültürlerinin belirgin bir CD34 pozitif, CD43 negatif ve CD34 düşük CD43 pozitif popülasyon verdiğini göstermektedir. CHIR ile tedavi edilen farklılaşma kültürleri, farklılaşmanın sekizinci gününde %1'den az CD43 pozitif hücreye sahiptir.

Dokuzuncu günde izole edilen IWP2 koşulları altında türetilen ilkel hematopoietik progenitörler, metilselüloz deneylerinde ağırlıklı olarak ilkel eritroid ve miyeloid progenitörlere yol açacaktır. CHIR99021 tedavisinden türetilen CD34 pozitif CD43 negatif popülasyon, endotelyal progenitörlerin yanı sıra CD34 pozitif, CD43 negatif, CD73 negatif, CD184 negatif nemojenik endotel içeren heterojen bir popülasyondur, bu da FACS ile izole edildiğinde başlangıçta endotel benzeri hücrelerin tek tabakası oluşturur ve daha sonra yuvarlak, refraktil ile sonuçlanan bir endotelyal hematopoietik geçişe uğrar. yapışık olmayan hematopoetik hücreler. Bu hematopoetik hücreler, CD34 ve CD45 ekspresyonu için akış sitometrisi ile değerlendirilebilir.

EHT testlerinden izole edilen hematopoietik progenitörler, metilselüloz testlerinde kullanılabilir ve büyük, patlama benzeri, eritroid koloni oluşturan birimlere, küçük eritroid koloni oluşturan birimlere ve miyeloid progenitörlere yol açabilir. CHIR99021 türevi CD34 pozitif, CD43 negatif, CD73 negatif, CD184 negatif hematopoietik progenitörler ve IWP2'den türetilmiş CD34 pozitif, CD43 negatif hematopoietik progenitörlerden elde edilen T-lenfosit tahlil potansiyelinin bu temsili akış sitometrik analizleri, giriş CD34 pozitif popülasyon içindeki hematopoietik potansiyeli gösteren CHIR'den türetilmiş progenitörlerde CD45 pozitif, CD56 negatif, CD4 pozitif, CD8 pozitif popülasyonun varlığını göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, insan pluripotent kök hücrelerini ilkel veya kesin miktarda hematopoietik progenitörlere doğru nasıl ayırt edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.