Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

Bu floresan bazlı lenfosit testinin genel amacı, yeni küçük moleküllü immünomodülatörleri tanımlamaktır. Bu yöntem, immünoloji alanındaki lenfosit aktivasyonu ve inhibisyonu mekanizması ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu fenotipik fonksiyonun ve tahlilin temel avantajı, ilaç keşfi için uyarlanabilmesidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Ahmed Fouda olacak. Steril bir çalışma başlığı altında, altı ila sekiz haftalık dişi bir Nurr77 GFP faresinin kürkünü %70 etanol ile dezenfekte edin ve hayvanı sağ tarafına yerleştirin. Daha sonra, sol üst karın kadranının derisinde ve kaslarında bir kesi yapın ve dalağı bulun ve çıkarın, dokuyu buz üzerindeki splenosit ortamına yerleştirin.

Tüm dalaklar toplandığında, dokuları beş mililitre önceden ısıtılmış splenosit ortamı içeren 10 santimetre karelik bir hücre kültürü kabına aktarın ve çözelti bulanıklaşana kadar dokuları ezmek için steril bir şırınga pistonu kullanın. Splenosit ortamında kapsamlı ezme işleminden sonra, hücre süspansiyonunu 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirerek kalıntıları gidermek için 50 mililitrelik bir tüpe süzün ve elde edilen tek hücreli süspansiyonu santrifüjleyin. Peletleri iki ila üç mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edin, reaksiyonu 20 ila 30 saniye sonra beş mililitre RPMI veya başka bir uygun tampon ile emdirin.

Daha sonra hücreleri başka bir santrifüjleme ile toplayın ve hücre sayımı için peleti twp mililitre splenosit ortamında yeniden süspanse edin. T hücrelerini izole etmek için, hücreleri tekrar santrifüjleyin ve peleti serum serbest RPMI ortamında mililitre konsantrasyonunda bir kez 10 ila yedi hücre arasında yeniden süspanse edin. Hücreleri beş mililitrelik bir polistiren tüpe aktarın ve daha sonra saflık değerlendirmesi için kullanılmak üzere 100 mikrolitrelik bir splenosit alikotunu bir kenara koyun.

Daha sonra, hücrelere mililitre normal sıçan serumu başına 50 mikrolitre ekleyin, ardından hafifçe karıştırılarak mililitre T hücresi izolasyon antikor kokteyli başına 50 mikrolitre ilave edin. 10 dakika sonra, hücreleri streptavidin konjuge manyetik boncuklarla iki buçuk dakika inkübe edin. Daha sonra, iki buçuk mililitrelik bir son hacim için hücrelere serum içermeyen ortam ekleyin ve tüpü üç dakika boyunca bir hücre izolasyon mıknatısına yerleştirin.

İnkübasyonun sonunda, tüpü mıknatısta tutarak, süpernatanı tek hamlede yeni bir polistiren tüpe dökün. T hücreleri daha sonra sayılabilir. T hücrelerini, oyuk başına 200 mikrolitre taze splenosit ortamı içeren, oyuk başına 2.5 kez 10 ila beşinci hücre konsantrasyonunda yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakaya tohumlayın.

Uygun kuyucuklara rekombinant interlökin 7 ve CD3 / CD28 manyetik boncukları ekleyin ve plakayı bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. 12 saat sonra, herhangi bir boncuk hücresi agregasını parçalamak için her bir oyuktaki hücre süspansiyonunu hafifçe ezin. Daha sonra hücre süspansiyonlarını her bir kuyucuktan ayrı ayrı beş mililitrelik polistiren tüplere aktarın.

Tüm hücreler toplandığında, her bir hücre tüpünü bir seferde beş dakika boyunca ayırma mıknatısına yerleştirin ve tüp hala mıknatısın içindeyken, her inkübasyonun sonunda yeni polistiren tüplere süpernatanları boşaltın. Daha sonra hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri taze splenosit ortamında mililitre konsantrasyonlarında iki kez 10 ila altıncı hücrede yeniden süspanse edin. Küçük moleküllü yüksek verimli tarama için, 384 oyuklu bir plakada oyuk başına 40 mikrolitre hücre plakalayın ve hücre kültürü inkübatöründe istenen tedavi süresi için tercih edilen ilaç veya araçla uygun kuyuları tedavi edin.

GFP analizinden 30 dakika önce, hücreleri uygun konsantrasyonda Hoechst solüsyonu ile boyayın ve lekeyi nazik pipetleme ile iyice dağıtın. Tüm kuyucuklar boyandığında, kuyucukların dibindeki hücreleri toplamak için plakaları santrifüjleyin ve hücrelerin oda sıcaklığında 15 dakika dinlenmesine izin verin. Plakayı üreticinin talimatlarına göre yükleyin.

Ardından, hedefi 40X veya daha yüksek bir değere ayarlayın. UV lambası için dört numaralı kamerayı ayarlayın ve ardından lazer 488 için bir numaralı kamerayı ayarlayın. Plakayı yüksek içerikli tarama sistemine yükleyin.

Ardından, otomatik konfokal yüksek içerikli tarama sistemini, 488 nanometre ve UV ışığında alan başına iki sıralı okuma ile kuyu başına altı ila 10 alanı okuyacak şekilde ayarlayın. CD3 pozitif T hücreleri, belirli bir fare dalağının yaklaşık% 30'unu temsil eder ve% 10'luk bir bazal GFP ekspresyonu gösterir. CD3 / CD28 T hücre reseptörü boncuk stimülasyonunu takiben, GFP ekspresyonunun yüzdesinde beş ila altı kat artış gözlenir.

Benzer şekilde, CD19 pozitif B hücreleri, aktive edilmemiş T hücrelerininkine benzer bazal GFP ekspresyonu ile toplam splenositlerin% 50 ila 55'ini temsil eder. İlginç bir şekilde, anti-fare IgG, IgM ve rekombinant CD40L kullanan B hücresi reseptör stimülasyonu, GFP ekspresyonunda sadece önemsiz bir artışı tetikler. Az önce gösterildiği gibi manyetik boncuk izolasyonundan sonra, izole edilen CD3 pozitif T hücreleri hala %10'luk bir bazal GFP ekspresyonu gösterir.

Bununla birlikte, CD3 / CD28 boncuk stimülasyonu, GFP yanıtında önemli bir yukarı regülasyona neden olur. Benzer şekilde, B hücresi manyetik boncuk izolasyonundan sonra, saflaştırılmış aktive edilmiş B hücreleri, splenositlerdeki aktive edilmiş B hücrelerine kıyasla daha yüksek bir GFP ekspresyonu sergiler. Bu temsili deneyde, 4398 bileşiğin birincil yüksek verimli taraması, T hücresi aktivasyonunun birkaç aktivatörünü ve inhibitörünü ortaya çıkardı.

Ancak uyarılmış T hücrelerinin gözlenen GFP ekspresyonu, uyarılmamış T hücreleri için ölçülenden 20 kat daha yüksektir. GFP inhibitör bileşiklerinin kolayca tespit edilebileceği bir eylem bölgesi penceresinin oluşturulmasına izin vermek. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa 36 ila 48 saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü denerken, her adımdan sonra hücreleri saymayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, diğer ek soruları yanıtlamak için ELISA veya western blotting gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, kemirgenlerde ilaç keşfi immünomodülasyonunun önünü açacaktır.

Bu videoyu izledikten sonra, Nurr77 GFP fare plakalarından türetilen T veya B hücrelerinin nasıl izole edileceğini ve aktive edileceğini iyi anlamış olmalısınız.