Murin Aort Kırma Yaralanması: Verimli Düz Kas Hücresi çoğalması ve Endotel Fonksiyon Modeli

Bu prosedürün genel amacı, vasküler düz kas hücresi proliferasyonunun ve reendotelizasyonun eşzamanlı olarak değerlendirilmesine izin veren bir hayvan modeli oluşturmaktır. Bu yöntem, vasküler biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin vasküler girişimlerden sonra restenoz mekanizması nedir? Bu teknik, vasküler düz kas hücresi proliferasyonunun ve reendotelizasyonunun eş zamanlı in vivo değerlendirmesine izin verir.

Vasküler girişimlerden sonra restenozu güçlendiren veya zayıflatan her iki önemli olay. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan doktora sonrası bir araştırmacı olan Dr.Dan Yu olacak. Ayak parmağı sıkışmasına yanıt verilmediğini doğruladıktan sonra, anestezi uygulanmış, 10 ila 12 haftalık bir erkek, C57BL / 6 farenin ventral karnındaki kılları sternumdan kasık bölgesine çıkarın.

Daha sonra omuz bölgesini %70 etanol ile dezenfekte edin ve uygun bir analjezi uygulamak için 25 gauge veya daha küçük bir iğne kullanın. Daha sonra hayvanı sırtüstü pozisyonda izotermal ped ile ısıtılan cerrahi bir tepsiye yerleştirin. Cerrahi görüşü betadin veya klorheksidin ile ovalayın ve alkolle durulayın.

Her iki adımı da iki kez daha tekrarlayın. Hayvanın gözlerine merhem sürün. Median abdominal laparotomi kesisi yaptıktan sonra ince bağırsak ve duodenumu lateral olarak sağa doğru yansıtın.

Yeni bir pamuk uçlu aplikatör kullanarak, retroperitoneumu ve abdominal aortu sol renal venden aort bifurkasyonuna maruz bırakın. Ardından, aorta 30 ardışık beş saniyelik ezilme sağlamak için başka bir steril pamuk uçlu aplikatör kullanın. Son ezilme yaralanması uygulandıktan sonra, pamuk rulosunu çıkarın ve iç organların doğal konumlarına dönmesine izin verin.

Daha sonra fasyayı kapatmak için örgülü, emilebilir bir sütür kullanın ve ardından cildi 6-0 çalışan, emilmeyen, monofilament sütürle kapatın ve hayvanı tam yaslanana kadar izlemeli temiz yataklı bir kurtarma kafesine yerleştirin. Yaralı kalp dokusunun endotel bütünlüğünü analiz etmek için, uygun deneysel zaman noktasında, kangunize edilmiş kalbin sol ventrikülüne 21 gauge bir iğne yerleştirin. Sağ atriyumdan gelen atık su berraklaşana kadar PBS'yi enjekte edin, ardından hayvanı beş dakika boyunca fizyolojik basınçta beş mililitre% 0.3 Evans mavi boyası ile perfüze edin, ardından beş mililitre taze PBS ekleyin.

PBS infüzyonunun sonunda, karın bölgesini orta hat insizyonu ile açın ve infrarenal aortu ortaya çıkarmak için ince bağırsağı, az önce gösterildiği gibi karnın sağ tarafına hareket ettirin. Aortu bitişik dokulardan keskin bir şekilde inceleyin ve damarı% 4 paraformaldehitte depolamak için sol renal venden aort bifurkasyonuna çıkarın. Fiksasyonun sonunda, aortu uzunlamasına açın ve dokuyu, endotel bütünlüğünün Evans mavi boya derecesi ile kalitatif değerlendirmesi için luminal yüzeyin tamamını açığa çıkaran bir balmumu tabakasına sabitleyin.

Ezilme yaralanması, yaralanmadan üç gün sonra gözlenen en büyük duvar kalınlığı ile sahte bir prosedürle tedavi edilen hayvanların aortlarına kıyasla aort duvarı kalınlaşmasına neden olur. Yaralanma ayrıca, lümenal yüzeyin karşılık gelen düzensiz bir konturu ile hücrelerde yuvarlak bir görünüme neden olur. EdU dahil edilmesi, yaralı aortun artmış duvar kalınlaşmasının, en azından kısmen, medial vasküler düz kas hücrelerinin artan proliferasyonunun aracılık ettiğini göstermektedir.

Fosfo-Erk1/2 ekspresyonu, yaralanmadan üç gün sonra başlangıç ekspresyonundan %200'ün üzerinde daha fazla gözlenir ve erken zaman noktalarında ölçülen p27Kip1'in azalmış ekspresyonu ile gözlenir. Hem fosfo-Erk1/2 hem de p27Kip1 ekspresyonu, yaralanmadan bir ay sonra başlangıç seviyelerine geri döner, bu da aort duvarında gözlenen kalınlaşmanın kısmen artmış medial proliferasyona bağlı olduğunu düşündürür. Taramalı elektron mikroskobu ile değerlendirildiği gibi, aortun lümen yüzeyinin ezilme yaralanması, endotel hücrelerinin bozulmasına ve endotelin kısmi denudasyonuna neden olur.

Ayrıca, endotelin bariyer fonksiyonunun hasar görmesi, bazal membranın Evans mavisi boyası ile boyanmasına izin verirken, tek başına laparotomi ile tedavi edilen farelerin endotelyumu bariyer fonksiyonunu ve beyaz görünümünü korur. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa 20 dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, aort bölgesine uygulanan kuvvet miktarıyla tutarlı olmayı hatırlamak ve önyargıyı önlemek için çalışan bilim adamını farenin deneysel durumuna kör etmek önemlidir.

Evans mavi boyası ve paraformaldehit ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu malzemeleri kullanırken her zaman eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.