Yerel Alan Floresan Mikroskopi: Bozulmamış Kalpler Hücresel Sinyalleri Görüntüleme
8 Mart 2017
kalbinde, moleküler olaylar organın elektrik ve kasılma fonksiyonunu koordine ederler. Burada sunulan yerel alan floresan mikroskopi teknikleri bir dizi sağlam kalplerinde hücresel değişkenlerin kaydedilmesini sağlar. kalp fonksiyonlarını tanımlayan mekanizmaları belirleme kalp patolojik durumlar altında nasıl çalıştığını anlamada önemlidir.
Bu lokal alan floresan mikroskobu görüntüleme tekniğinin genel amacı, hücre içi kalsiyum seviyelerini veya tüm kalp seviyesinde erişilmesi zor olan kalp bölgelerinden zar potansiyellerini ölçmek için moleküler problar kullanmaktır. Bu yöntem, kardiyak arrest ve iskemi ile ilgili temel kardiyovasküler soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kardiyak özelliklerin, hücrelerin elektriksel, mekanik ve metabolik olarak bağlanmaya devam ettiği sağlam organdaki hücresel olaylardan ölçülmesidir.
İlk olarak, yatay Langendorff aparatını hazırlayın. Taze hazırlanmış Tyrode solüsyonunu 60 mililitrelik şırıngalara yükleyin ve kurulumun tüm ilgili borularını ekleyin. Doldurulduktan sonra, tüm hava kabarcıklarını ortadan kaldırın.
Ardından, yüklü çözeltiyi batık bir plastik hava taşından verilen saf oksijen gazı ile dengeleyin. Ardından, bir iğnenin etrafına emilmeyen bir cerrahi dikiş yerleştirin. Bu, cihaza takıldığında kalbi retroperfüze etmek için bir kanül görevi görecektir.
Daha sonra, heparin enjekte ettikten ve hayvana ötenazi yaptıktan sonra kalbi toplayın. İlk önce göğsü etanol ile temizleyin. Gösteri bir fare ile yapılır, ancak aynı prosedür muhabbet kuşu kalbi hasadı için de işe yarar.
Daha sonra, diseksiyon makası kullanarak, alt karın bölgesinde bir kesi yapın ve ardından yanları boyuna doğru kesin. Ardından, kalpten kaçınarak diyaframı dikkatlice kesin. Şimdi, kesilen dokuyu geri çekin ve sabitleyin.
Ardından, kalbi açığa çıkarmak için akciğerleri ve çevresindeki dokuları çıkarın. Maruz kaldıktan sonra, kalbi sıkmadan çıkarmak için cımbız kullanın. Aortu keserek hayvandan ayırın ve mümkün olduğunca kalbe bağlı aort bırakın.
Ardından, kalbi bir mililitre Tyrode solüsyonu ile küçük bir tartı teknesine yükleyin. Diseksiyon mikroskobu altında, cımbız ve makas kullanarak kalbi çevreleyen kanı ve yağ dokusunu hızla çıkarın. Emilemeyen bir cerrahi sütür ve bir iğne kullanarak, aortu Langendorff aparatının yatay bağlantısına takın.
İki ince cımbız kullanarak düğümü sabitleyin. Ardından, Tyrode çözeltisini serbest bırakmak için valfi açarak retroperfüzyona başlayın. Kalp 10 dakika boyunca stabilize olurken yatay odayı temiz tutmak için çevredeki dokuyu temizleyin ve kalıntıları emdirin.
Boyayı taze yapın. Rhod-2 için, üreticinin 50 mikrogramlık boya paketine 20 mikrolitre %20 Pluronic ve DMSO ekleyin. Kabarcıklardan kaçınarak pipetleyerek karıştırın.
Daha sonra sıvılaştırılmış boyayı şeffaf bir cam şişeye aktarın ve bir mililitre Tyrode çözeltisi ekleyin. 15 ila 20 dakikalık sonikasyon kullanarak bu karışımdaki boyayı iyice çözün. Daha sonra, hazırlanan boyayı oda sıcaklığında peristaltik bir pompa kullanarak perfüze edin.
İlk olarak, boyayı boya haznesine yükleyin ve ardından manifolda bağlı tüm boru hatlarını sıkıştırın ve geri akışı önlemek için kelepçeleri manifoldun üzerinde tutun. Ardından, pompayı açın ve 60 mililitrelik şırınganın altındaki üç vanayı hemen kapatın. Boyayı perfüze edildikten sonra yeniden dolaştırmak için pompanın emme ucuna bağlı küçük tüpü kalbin yanına yerleştirin.
Küçük bir ölçü iğnesi alın ve basıncı azaltmak için apeksten sıkıştırın. Ardından, kalbin 30 dakika boyunca boya ile perfüzelenmesine izin verin. Bu süre zarfında, kabarcıkların dokuya girmemesi için boya seviyesini değerlendirmek çok önemlidir, bu da iskemi ve doku hasarına neden olur.
Boyayı perfüze ettikten sonra, kalbi Tyrode solüsyonu ile retroperfüze edin. Manifoldun üzerindeki kelepçeyi çıkarın. Kapağı açın ve ardından kalbin 10 dakika boyunca stabilize olmasına izin verin.
Retroperfüzyon sırasında, yatay odayı Tyrode çözeltisi ile doldurun ve banyo sıcaklığını 37 santigrat dereceye getirmek için Peltier ünitesini açın. Fiber optik ışığı deneye hazırlamak için önce fiber optiği iki mililitrelik bir pipetin içine yerleştirin. Ve sonra pipeti bir mikromanipülatöre takın.
Fiber optiği lateral ventrikülün yüzeyine hafifçe bastırmak için mikromanipülatörü kullanın. Ardından, bir milisaniye genişliğinde kare bir darbe sağlamak için bir dalga üreteci programlayın. Ve harici olarak senkronize edilecek ve dalga üretecine bağlanacak bir kalp stimülatörü ayarlayın.
İki stimülatör çıkışının her birine, ucunda lehimlenmiş bir akupunktur iğnesi olan bir tel takın. İki akupunktur iğnesini kalbin tepesine yaklaşık üç milimetre aralıklarla takın. Sadece iğneler yerleştirildikten sonra, stimülatörü başlatın, böylece kazara şoklardan kaçının.
Şimdi, epikardiyal sinyali kaydetmek için, yazılımdaki alım frekansını 10 kilohertz olarak ayarlayın. Endokardiyal sinyali toplamak için aynı prosedürü izleyin, ancak septumun yakınındaki lateral ventrikülde bir delik açmak için 23 gauge iğne kullanın. Ardından, bir mikromanipülatör kullanarak, ikinci fiber optiği endokardın içine yerleştirin.
Transmural fonksiyona erişmek için, endokard ve epikarddan kaydedilen aksiyon potansiyellerinin morfolojisi karşılaştırıldı. Kalbin CLFFM tekniği kullanılarak di-8-ANEPPS ile tedavi edilmesinden sonra floresan kayıtlar yapıldı. Aksiyon potansiyeli endokardda, özellikle birinci fazda daha yavaştı.
Aksiyon potansiyelinin süresi, aksiyon potansiyelinin belirli bir dereceye kadar yeniden polarize olması için geçen süre olarak tanımlandı. Süreler normalleştirildiğinde ve sıfır fazında üst üste gelecek şekilde kaydırıldığında, karşılaştırılabilirler. Birinci aşamada gerçekten önemli bir fark vardı.
Daha sonra, hücre içi kalsiyumu izlemek için Rhod-2 kullanıldı. Hücre içi kalsiyumdaki bölgesel farklılıkları karşılaştırmak için, kalsiyum geçişinin kinetiği değerlendirildi. Karşılaştırıldığında, geçiciliğin zirveye ulaşma süresi endokardda yaklaşık iki milisaniye daha uzundu.
Genel olarak, endokarddan gelen kalsiyum geçişi, epikardiumdan önemli ölçüde daha yavaş kinetiklere sahipti. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, kalpte erişilmesi zor bölgelerdeki hücre içi kalsiyum geçişini ve aksiyon potansiyellerini kaydetmek için kullanılabilir. Kurulumun Langendorff kısmı, farklı kimyasalları kalbe perfüze etmeyi ve kardiyak özellikler üzerindeki etkilerini değerlendirmeyi çok pratik hale getirir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, kalp içerisinde hücre içi kalsiyum seviyelerini ve membran potansiyellerini ölçmek için kullanılan bir lokal alan floresan mikroskopi tekniğini sunmaktadır. Bu yöntem, kalp durması ve iskemi gibi durumların anlaşılması için kritik öneme sahip olan, sağlam organlarda kardiyak fonksiyonların araştırılmasına olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kardiyovasküler fizyoloji
- Floresan mikroskopi
- Hücresel görüntüleme teknikleri
Arka Plan
- Kardiyak fonksiyonun anlaşılması, kalp hastalıklarının tedavisi için temel önem taşır.
- Geleneksel yöntemler, kalbin tüm bölgelerine etkili bir şekilde erişemeyebilir.
- Yerel alan floresans mikroskopisi, kardiyak hücrelerin incelenmesi için yeni bir yaklaşım sunar.
- Bu teknik, kalpteki hücresel bağlantı bütünlüğünü korur.
Çalışmanın Amacı
- Kalpte hücre içi kalsiyumu ve membran potansiyellerini ölçmek.
- Patolojik koşullar altında kalp fonksiyonlarının mekanizmalarını araştırmak.
- Kalp durması ve iskemi gibi kardiyovasküler olaylar hakkında bilgi sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Yatay Langendorff düzeneğinin hazırlanması.
- Tyrode solüsyonunun şırıngalara doldurulması.
- Sistemdeki hava kabarcıklarının giderilmesi.
- Ölçümler için moleküler probların kullanılması.
Ana Sonuçlar
- İntakt kalplerde hücresel değişkenlerin başarılı bir şekilde ölçülmesi.
- Tekniğin, erişilmesi zor bölgelere ulaşmadaki etkinliğinin gösterilmesi.
- Kardiyak hücrelerin elektriksel ve mekanik özelliklerine dair kazanılan bilgiler.
- Kalp patolojilerinin anlaşılmasında potansiyel uygulamalar.
Sonuçlar
- Yerel alan floresan mikroskopi tekniği, kardiyak araştırmalar için değerlidir.
- Bu yöntem, sağlıklı ve hastalıklı durumlarda kalp fonksiyonlarına dair anlayışımızı geliştirmektedir.
- Gelecekteki çalışmalar, kardiyovasküler sağlık hakkında daha derinlemesine bilgiler edinmek için bu teknikten yararlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Yerel alan floresans mikroskopisi, iskemi ve aritmileri anlamak için kritik olan hücresel kenetlenmeyi koruyarak, bütün kalp yapılarında hücre içi kalsiyum ve membran potansiyellerinin ölçülmesine olanak tanır. Bu yaklaşım, elektriksel ve mekanik olarak kenetlenmiş dokudan fizyolojik olarak ilgili veriler sağlayarak hedef doğrulamayı destekler ve preklinik modellerdeki öngörü güvenilirliğini artırır. Bu teknik, kardiyovasküler hastalık araştırmalarında moleküler sinyalleri tüm organ fonksiyonuyla ilişkilendirerek mekanistik risk azaltmayı kolaylaştırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Fizyolojik eşleşme altındaki bütünsel miyokardda kalsiyum geçişlerini ve aksiyon potansiyellerini ölçerek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: İzole hücre modellerinin doku düzeyindeki dinamikleri yakalamada yetersiz kaldığı hastalıklara özgü sistemlerde fonksiyonel hedef doğrulamasına olanak tanır.
- Öngörücü Değer: Endokardiyal ve epikardiyal bölgelerde hücre içi kalsiyum kinetiğini normalize eden bileşikleri tanımlayarak portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Analize Hazırlık: Perfüze edilen kalplerde bazal floresans sinyalleri oluşturarak, aşağı akışlı taramalar için valide edilmiş biyolojik sistemleri hazırlar.
- Kantitatif Çıktı: Bileşik etkisinin değerlendirilmesi için kalsiyum geçici kinetiği ve aksiyon potansiyeli süresine dair tekrarlanabilir ölçümler üretir.
- Platformun Yeniden Kullanımı: Langendorff perfüzyonu aracılığıyla kemirgen modeller arasında ölçeklenebilirliği destekleyerek, kardiyovasküler tarama kaskadlarında tutarlı sinyal kazanımı sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgililik: Sağlam kalplerde kalsiyum yönetimi ve repolarizasyondaki bölgesel farkları izleyerek iskemi ve aritmi mekanizmalarını modeller.
- Translasyonel Süreklilik: Farmakolojik müdahale sırasında elektrotonik ve metabolik eşleşmeyi koruyarak, keşif süreci ile preklinik doğrulama arasında köprü kurar.
- Riske Göre Ayarlanmış Kararlar: Hastalıklı ve tedavi edilmiş dokulardaki aksiyon potansiyeli morfolojisi ve kalsiyum geçişindeki ölçülebilir değişiklikler aracılığıyla ilerleme kriterlerini bilgilendirir.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken dönem hedef sorgulamadan preklinik doğrulamaya kadar olan kardiyovasküler keşif iş akışlarına entegre edilerek, fizyolojik olarak bağlamlandırılmış sinyalizasyon verileri sağlayarak öncü bileşik tanımlama sürecini destekler.
- Keşif Biyolojisi: Bozulmamış dokuda kompartman spesifik kalsiyumu (sitozolik vs. sarkoplazmik retikulum) ve membran potansiyelini ölçerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Bileşiklerin kardiyak elektrofizyoloji ve kalsiyum yönetimi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için stabil floresans okumalarına sahip, analize hazır preparatlar sunar.
- Analitikler: Gruplar arası karşılaştırma için pik kalsiyum geçiş süresi, aksiyon potansiyeli süresi ve faz spesifik repolarizasyon metrikleri dahil olmak üzere kantitatif bağımlı değişkenler sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Moleküler ölçümleri tüm organ fonksiyonuna bağlayarak, kardiyak disfonksiyonun preklinik modellerinde biyobelirteç uyumuna olanak tanır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Standartlaştırılmış Langendorff tabanlı floresans tespiti aracılığıyla, çeşitli terapötik alanlarda kardiyovasküler risklerin değerlendirilmesi için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kardiyovasküler hastalık modellerinde subcellular sinyalleri bozulmamış organ fizyolojisi ile ilişkilendirerek mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Langendorff sisteminde standartlaştırılmış boya yüklemesi, perfüzyon ve fiber optik konumlandırma aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Maliyetli geç evre başarısızlıklarından önce, erken elektrofizyolojik ve kalsiyum yönetimi risklerini belirleyerek devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Hastalıklı ve kurtarılmış kalplerdeki normalize edilmiş aksiyon potansiyeli ve kalsiyum geçiş kinetiklerine dayanarak bileşiklerin risk ayarlı önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Kardiyak dissection, Langendorff perfüzyonu ve floresan boya hazırlama (örneğin Rhod-2 AM, di-8-ANEPPS) konularında uzmanlık gerektirir.
- Fiber-optik mikroskopi kurulumuna, stimülasyon için dalga üreteçlerine ve yüksek frekanslı veri toplama sistemlerine (10 kHz) bağımlıdır.
- Sinyal tutarlılığı için fizyoloji, görüntüleme ve farmakoloji ekipleri arasında fonksiyonlar arası standardizasyon gerektirir.
- Transmural gradyanlar ölçülürken farklı türler (fare, sultan papağanı) ve ventriküler bölgeler (epikardiyum, endokardiyum) için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Boy yükleme verimliliği ve perfüzyon sırasındaki hareket artefaktları ile sınırlıdır; iskemiyi veya sinyal bozulmasını önlemek için bunlar kontrol edilmelidir.
