Zebra basımında Akut ve Kronik Hiperglisemi Modelleri: Hipergliseminin Nörogenez Üzerindeki Etkisini ve Radyoaktif Etiketli Moleküllerin Biyo Dağılımını Değerlendiren Bir Yöntem

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, hiperglisemik koşullarda beynin yeniden şekillenmesini değerlendirmek ve zebra balıklarında radyo işaretli molekülleri takip etmektir. Hiperglisemi, aşırı kan şekeri konsantrasyonu ile karakterizedir. Kronik hiperglisemi diyabetik durumlara bağlı olabilir ve farklı vasküler disfonksiyonlara neden olabilir, bu da miyokard enfarktüsü, felç veya diyabetik ayak ülseri gibi klinik komplikasyonları tetikleyebilir.

Ayrıca, strese bağlı akut hiperglisemi iskemik inmede hemorajik komplikasyonlara neden olabilir. Zebra balığı, insan hastalıklarını ve bunların merkezi sinir sistemi üzerindeki etkilerini anlamak için ilginç bir modeldir. Yetişkin balıkların beyninin memelilere kıyasla yoğun bir nörojenik kapasite ve beyin onarım mekanizmaları için olağanüstü bir yetenek sergilediği göz önüne alındığında, zebra balığı akut ve hiperglisemik koşullar altında stresi takiben beynin yeniden şekillenmesini araştırmak için iyi bir model teşkil etmektedir.

Ayrıca, radyo işaretli moleküllerin ve potansiyel terapötik ajanların biyolojik dağılımının araştırılmasına da izin verir. Tüm deneyler, araştırmada hayvanların kullanımına ilişkin Fransız ve Avrupa topluluğu yönergelerine uygun olarak yürütüldü ve hayvan deneyleri için yerel etik kurul tarafından onaylandı. Bir balık ağı ile nazikçe bir balık yakalayın.

Balıkları, suda% 0.02'lik bir nihai konsantrasyonda seyreltilmiş küçük bir trikat anestezik içine koyun. Balık hareket etmeyi bırakana kadar bekleyin. Kesilmiş bir pipet kullanarak balığı çıkarın ve maksimum suyu çıkarmak için emici kağıt mendil üzerine nazikçe yerleştirin.

Vücut ağırlığının kilogramı başına 2,5 gramlık 50 mikrolitre enjeksiyon için bir d-glikoz şırıngası hazırlamak için balığı tartın. Örneğin, 0.6 gramlık bir balık, 50 mikrolitre% 3 d-glikoz PBS çözeltisi alacaktır. Balığı sırtına koyun ve tek elinizle bakımını yapın.

Öte yandan, şırınganın iğnesini intraperitoneal boşluğa yerleştirin ve d-glikoz PBS çözeltisini yavaşça enjekte edin. İğneyi çıkarın ve balığı tekrar balık suyuna koyun. Balık tamamen iyileşene kadar kontrol edin.

Kan şekeri seviyeleri genellikle 1 1/2 saat sonra ölçülür. Kronik hiperglisemiyi taklit etmek için, 111 milimolar final konsantrasyonunda iki litrelik bir d-glikoz tankı hazırlayın. Bunun için 40 gram d-glikozu tartın ve boş bir tanka koyun.

Depoyu iki litre balık suyu ile doldurun ve içine yedi adede kadar balık koyun. Bakteri veya diğer mikroorganizmaların büyümesini önlemek için glikoz çözeltisini her iki günde bir değiştirin. Kronik hiperglisemi, d-glikoz ile 14 günlük bir tedavi ile elde edilir.

Balık ağı ile bir balık yakalayın ve buzun üzerine koyun. Hızlı bir ötenazi için balıkları buzla örtün. Kan örneklerini seyreltebilecek su damlalarını çıkarmak için balığı alın ve silin.

Diseksiyon forseps ile bir gözü çıkarın ve göz boşluğu kanla dolana kadar bekleyin. Glükometreye bir test şeridi koyun ve şeridi göz boşluğuna yerleştirin. Kan şekeri konsantrasyonunun değerine dikkat edin.

Akut hiperglisemi için, intraperitoneal bir d-glikoz enjeksiyonu, enjeksiyondan 1 1/2 saat sonra gösterildiği gibi kan şekeri seviyelerinde önemli bir artışa neden olur. Kronik hiperglisemi için, balığın bir d-glikoz çözeltisine daldırılması, 14 günlük tedaviden sonra gösterildiği gibi kan şekeri seviyelerinde önemli bir artışa neden olur. İşlemin sonunda, vücudu diseksiyon makası ile kafadan ayırın ve kafayı immünohistokimya deneyleri için PBS'de seyreltilmiş paraformaldehitin% 4'üne koyun.

Gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Alternatif olarak, beyin doğrudan ekstrakte edilebilir ve mRNA ekstraksiyonu gibi diğer deneyler için dondurulabilir. Ertesi gün, sabit başlıklar PBS ile durulanır ve diseksiyon mikroskobu altında bir iğne ile tutulur.

Kalan göz çıkarılır ve kafatasının üst kısmı forseps ile nazikçe açılır. Beyin daha sonra dikkatlice çıkarılır ve 1x PBS'ye yerleştirilir. Sabit beyinler, bir dizi artan etanol konsantrasyonunda kademeli olarak kurutulur, ardından iki adet 30 dakikalık toluen banyosu yapılır.

Beyinler daha sonra bir gömme kasete yerleştirilir ve kapak dikkatlice kapatılır. Kaseti 58 ila 60 santigrat derecede erimiş parafine koyun. Beynin parafin gömülmesi sırasında, ısınma dahil etme forsepslerini açın.

Kaseti temiz bir parafin banyosuna koyun. Parafin banyolarının sonunda kaseti çıkarın. Bir kalıba biraz sıvı parafin dökün.

Kaseti açın ve beyni kalıba eritilmiş parafin içine yerleştirin. Beyni ısınma dahil etme forsepsleri ile yönlendirin. Kalıbı eritilmiş parafin ile doldurun ve gömme makinesinin soğutma kısmında sertleşmesine izin verin.

Teknik nedenlerden dolayı beyin ön-arka eksene göre konumlandırılmalıdır. Parafin bloğunu kalıptan çıkardıktan sonra, kırpın ve enine kesitlere izin vermek için doğru yönde erimiş parafinli bir kasete sabitleyin. Parafin bloğunu bir mikrotomun koluna yerleştirin ve beyin örneği seviyesine ulaşana kadar 50 mikrometrelik bölümler kesin.

Ardından, bir trapez elde etmek için parafin bloğunu kesin ve kesit kalınlığını yedi mikrometreye ayarlayın. Parafin kurdelelerini ince bir boya fırçasıyla toplayın ve siyah bir kağıda koyun. Parafin şeritlerini her üç ila dört bölümde bir kesin.

Bir ısıtma plakasına bir slayt koyun ve damıtılmış suyla kaplayın. Slayttaki su üzerindeki bölümleri nazikçe yerleştirin ve 40 santigrat dereceye kadar ısıtın. Parafin şeritleri yeterince yayıldığında, suyu emici doku ile çıkarın.

Son damlalar gösterildiği gibi mekanik olarak çıkarılır. Protokolde tarif edilen immünohistokimya prosedürünü gerçekleştirmeden önce slaytın en az iki saat kurumasını bekleyin. İmmünohistokimyadan sonra, slaytlar, hipergliseminin beyin hücresi proliferasyonu üzerindeki etkisini incelemek için bir epifloresan veya konfokal mikroskop altında analiz edilir.

Beyin hücresi ölçümü, en az üç ardışık bölümde veya bir ilgi bölgesinde yapılır. Burada, PCNA pozitif hücrelere karşılık gelen proliferatif hücreler yeşil renkte görünür. Gördüğünüz gibi, kronik hiperglisemi, lateral ve posterior girinti çevresinde ventral telensefalon, dorsal telensefalon ve kaudal hipotalamusta PCNA antikoru ile yeşil renkle etiketlenmiş proliferatif hücrelerin sayısında bir azalmaya neden olur.

Alternatif olarak, hipergliseminin yaralanmaya bağlı nörojenez üzerindeki etkilerini incelemek için, kronik hiperglisemik tedavi sırasında telensefalonun bıçak yarası yaralanması gerçekleştirilebilir. Bunun için, yedi günlük tedavi edilmiş bir balığı uyuşturun ve diseksiyon mikroskobu altına koyun. 30 gauge bir şırıngayı kafatasından dikey olarak sağ telensefalik hemisferin merkezine itin.

Bu işlemden sonra, balık gereken süre boyunca tankına geri gönderilmelidir. Burada, balığın kurban edilmeden önce d-glikozlu suda yedi gün hayatta kalmasına izin verildi. Telensefalonun bıçak yarası yaralanması, lezyondan yedi gün sonra yaralı hemisferdeki proliferasyonu güçlü bir şekilde düzenler.

Verilerimiz, kronik hipergliseminin, telensefalonun bıçak yarası yaralanmasından sonra hücre proliferasyonunu azaltarak beyin iyileşme süreçlerinde önemli bir azalmaya neden olduğunu göstermektedir. Zebra balığı, radyo etiketli moleküllerin biyolojik dağılımını incelemek için de kullanılabilir. Burada, zebra balığı organizmasında glikoz metabolizmasını incelemeye karar verdik.

Balık önce uyuşturulmalı ve anesteziklerle ıslatılmış bir doku üzerine yerleştirilmelidir. Balık daha sonra bir radyo koruma penceresinin arkasına yerleştirilir. 50 mikrolitre florodeoksiglukoz içeren şırınga hazırlanır.

Balık sırt üstü yatırılır ve 20 megabekerel olarak 50 mikrolitre FDG ile intraperitoneal olarak enjekte edilir. Balık daha sonra anesteziklerle ıslatılmış başka bir dokuya yerleştirilir. Nazikçe sarılır ve bir PET tarama görüntüleyicisinin koluna yerleştirilir.

Kol PET taramasına yerleştirilir ve görüntüleme işlemi gerçekleştirilir. Burada, FDG'nin sadece enjeksiyon bölgesinde değil, aynı zamanda balığın kafasında, özellikle beyinde ve omuriliğin tamamında tespit edildiğini not edebilirsiniz. Bu çalışmada, zebra balıklarında akut ve kronik hiperglisemi oluşturmak için iki farklı yöntem sunuyoruz ve hipergliseminin normal ve yaralanmaya bağlı koşullar altında beyin hücresi proliferasyonunu bozduğunu gösteriyoruz.

Sonuç olarak, zebra balığı, hipergliseminin merkezi sinir sistemindeki zararlı etkilerini araştırmak için ilgili bir model olarak kullanılabilir. Ayrıca, radyo etiketli moleküllerin biyolojik dağılımının PET taraması ile değerlendirilmesine de izin verir.