Name: Acufection ve Cilt Araştırmaları onun Uygulaması tarafından bir Ekonomik DNA Yerleştirme Sisteminin Geliştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Öğrenin fare derisinde plazmid DNA ifadesi için maliyet etkin akupunktur tabanlı gen iletimi yöntemini. Bu teknik immünoloji ve cilt hastalıkları araştırmalarında yeni terapilerin geliştirilmesine yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı&#39;ndan hibe ile desteklenen (EN 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). Biz Dr teşekkür ederim. el yazması okumak için Betty Wu-Hsieh ve Hawaii Üniversitesi&#39;nde Stanford Üniversitesi ve Dr Peter Hoffmann NTU&#39;da Chien-Kuo Lee Leigh Zerboni, Tarım Biyoteknoloji teknik yardım için NTU&#39;da Yun Chien ve Dr Wen-Chi Wei teknik tavsiye için Sinica Akademisi Araştırma Merkezi.

8&#39;de Dişi fareler - 12 haftalıkken bu çalışma için kullanıldı. C57 / BL6 sokak türü (WT) ve eksik IL-15 (IL-15&#39;te - / -) fareler sırasıyla Ulusal Laboratuvarı Hayvan Merkezi (NLAC), Tayvan ve Taconic Farm, satın alınmıştır. IL15 +/- heterozigot çaprazlamasından ikinci kuşak: 3 oranında IL eksikliği-15-(IL15 - / -) ve IL-15-baskın (IL15 +/- ve IL15 + / +), 1 gösterdi. IL15 genotipi - / - fareleri, PCR analizi ile teyit edilmiştir. Fareler Laboratuar Hayvanları Merkezi (LAK), Ulusal Tayvan Üniversitesi Tıp (NTU) Üniversite de Spesifik Patojen (SPF) tesis içinde tutulmuştur. anestetik madde ve yöntemlerin dahil olmak üzere tüm hayvan prosedürleri Halk Sağlığı Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) (Hayvan Protokolü 20130225 Onaylanmasının Yeminli) Ulusal Tayvan Üniversitesi Tıp Koleji ve Koleji tarafından onaylanan hayvan protokolüne uygun olarak gerçekleştirildi. &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 1. Akupunktur iğneleri hazırlanması Not: akupunktur iğneleri bir sap ve bir iğne ucu (Şekil 1A) oluşan tıbbi cihazlardır. akupunktur iğne çapları 0.35 mm (28 g) 0.2 mm (36 g) arasında değişmektedir. Biz deriyi delmeden sırasında olası aşırı hücre hasarı önlemek için iğnenin en ince noktası seçin. 13 mm (0.5 inç), 25 mm (1.0), 40 mm (1.5 inç) ve uzunluğu 50 mm (2.0) dahil olmak üzere 0.2-mm iğne 4 farklı uzunlukları vardır. 13 mm uzunluğunda 10 iğne bir demet, C57BL / 6 fare deri üzerinde iğne salınım sırasında en iyi rahat bir kavrama sağladı. yöntem daha büyük hayvan derisine uygulanır ya da daha büyük bir eliyle araştırmacılar tarafından gerçekleştirilirse parametreler değiştirilebilir. <ol><li> Steril olmayan pirojenik paketinden akupunktur iğneleri çıkarın. steril bir örtü üzerine iğne yerleştirin. </li><li> i 10 iğneler birbirine bağlamak için yapıştırıcı etiketleme bandı kullanınna demeti (Şekil 1B). Not: 10 iğneler geometrik bir silindir şekli oluşturmak üzere düzenlenmiştir. kolaylık sağlamak için, yapışkan bant uygulamadan önce düzenleme stabilize etmek için, parafin bir film parçası kullanılır. Bütün iğne noktaları aynı düzlemde olduğundan emin olun. yerine, tek bir iğne, bir paket kullanılarak iğne ve deri arasındaki temas alanını arttırarak maksimum DNA infüzyon kolaylaştırır. </li></ol> 2. Büyük miktarda hazırlanması ve endotoksin içermeyen plazmid DNA <ol><li> plazmid DNA&#39;sı ile kimyasal olarak kompetan bakteriyel hücreleri dönüştürmek. </li><li> Seçip LB ortamı antibiyotik içeren 3 mL tek bir bakteriyel koloni inoküle ve gece boyunca bir çalkalayıcı içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> C antibiyotikler ile LB ortamında 100 250 mL ve 37 ° C&#39;de gece boyunca çalkalama: 1 ile bakteri kültürü seyreltilerek kültürünü Scale </li><li> yüksek qualit kullanılarak DNA&#39;nın büyük miktarda hazırlanmasıy, imalatçının talimatlarına uygun endotoksin serbest plazmid hazırlama kiti. Not: Acufection protokol, yüksek saflık ve plazmid DNA&#39;nın büyük bir miktarda kullanmak gerekir. yüksek kalitede kullanımı olup, endotoksin serbest ve kolon saflaştırılmış plazmid DNA önerilir. </li><li> Steril su içinde DNA elute. acufection için hazır olana kadar -20 ° C&#39;de küçük parçalar halinde saklayın DNA arasında değişir. NOT: Tutarlı plazmid DNA ifadesini sağlamak için DNA&#39;nın tekrarlanan donma-ve-çözülme kaçının. </li><li> acufection için steril PBS içinde 1 mg / mL ila plazmid DNA seyreltin. </li></ol> Acufection 3. Prosedürü Not: DNA optimal miktarı ve hedef deri yüzeyi alanı farklı genler için farklı ve daha fazla optimize edilmesi gerekebilir. iğneleyici gücü ve sayısı deri kalınlığına bağlı olarak değişebilir da derinin boynuzsu tabaka gevşetmek için. Bu şartlar dikkatli bir şekilde acufected gene transcri ekspresyon seviyesini değerlendirmek sonra tespit edilmelidirQRT-PCR ile pn. <ol><li> fareler tartılır ve peritoneal enjeksiyonu ile tribromoetanol (g vücut ağırlığı başına 400 ug) yönetmek. NOT: 2,2,2-tribromoetanol yaygın farelerde kullanılan bir enjekte edilebilir anestezik maddedir. Çözelti 2-metil-2-butanol% 2.5 ihtiva eden damıtılmış su (200 mL) içinde bir farmasötik olmayan kalite 2,2,2-tribromoetanol (2.5 g) çözülmesiyle yapılmaktadır. </li><li> anestezi altında kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner oftalmolojik merhem kullanın. Not: - 2 dakika anestetik etki 1 indüklenebilir olacaktır. Ameliyattan önce anestezi yeterli derinliğinin sağlanması için ayak tutam refleksini kontrol edin. </li><li> dorsal yan deriyi Tıraş ve saç gövdesine keratin proteinleri çözmek için tüy dökücü krem ​​uygulayın. NOT: saç kaldırmak için tüy dökücü krem ​​kullanımı deriye DNA&#39;nın infüzyon kolaylaştıracaktır. </li><li> tüy dökücü krem ​​temizlemek için su ile ıslatılmış pamuk topları kullanın. NOT: tüy dökücü krem ​​suda çözünür. krem wil tamamen çıkarılmasıL, bir yağlı yüzey önlenmesi ve daha iyi bir sonuç elde iğneleyici. </li><li> Deri yüzeyi dezenfekte etmek için% 70 etanol ile ıslatılmış steril bir pamuk bez kullanın. </li><li> Mark önceden ölçülmüş şablon ile tüy dökücü krem ​​uygulanmış deri üzerinde hedef alanı (1 cm x 1 cm) olabilir. NOT: Hedef sitesini İşaretleme yukarı ve aşağı tanımlanmış alanı içinde iğne demetini uygulamak için yardımcı olacaktır. Bu deneme için-deney varyasyonu en aza indirmek için belirli bir yüzey alanına DNA aynı miktarda verilmesini sağlamak için önemlidir. </li><li> belirgin deri üzerine plazmid DNA (10 ug) &#39;in bir 10 uL damla yerleştirin. Not: acufection için DNA miktarı farklı genler ve sentezleme vektörünün tipine göre değişir. kullanılan DNA miktarı dikkatlice ilgi deneyini yürütmekte önce titre edilmelidir. 10 uL, küçük bir sıvı madde damlası olup, batıcı ise yuvarlanma olmayan traş ve tüy dökücü krem ​​uygulanmış Cilt üzerinde oturur. Fareler ile karşılaştırmak için 10 uL boş vektör DNA ile tedavi edilen farelerin, bir kontrol grubu olarak dahilÇalışma genle cufected. </li><li> Akupunktur iğne demeti (Şekil 1B) tutun ve 100 kat ya da deri ortadan PBS DNA nem kadar bir yukarı-ve-aşağı hareketle işaretlenmiş yüzey delin. NOT: Cilt yüzeyinin bazı kızarıklık oluşabilir. kanamaya derin kesikler yapmaktan kaçının. PBS içinde DNA nem (10 uL) deri üzerinde kaybolur, deri yüzeyinde hareketleri iğneleyici yukarı ve aşağı sayısı işlevsel belirlenir. o acufection-teslim genlerden en tutarlı sonuçlar vermiştir, çünkü Biz 30 s 100 kez verdi. Mevcut ise, iğneler kadar 6 hedef deri dürtmelerin (1 cm x 1 cm) ile yeniden kullanılabilir. acufection arasında,% 70 etanol ve PBS içinde iğneler durulayın. bunlar, mat ya da çapraz kontaminasyonu engellemek için farklı plazmid DNA olduğunda yeni iğne ile değiştirin. </li><li> Uyanıncaya kadar vücut ısısını korumak için bir ısıtma pedi üzerine acufected fareler yerleştirin. </li><li> onlar varken onların kafesine fareler dönünçıktı yeterli bilinç. Not: un acufected farelerin kafes ayrı kafes içinde acufected fareler tutulur (kafes başına en az 5 hayvan). </li><li> yerine su şişesi koyun ve IVC (tek tek havalandırılan bir kafes) rafına kafesi döndürür. </li></ol> 4. Ameliyat sonrası bakım <ol><li> İşlem sonrası ilk 48 saat için, yakın bir davranış değişiklikleri (huzursuzluk, ajitasyon ya da yeme bozukluğu) ya da anormal görünüş (kaba saç ceket veya kambur duruş) dahil olmak üzere herhangi bir rahatsızlık için fareler izler. </li></ol> IL-15ΔE7-acufected Cilt 5. İmikimod (IMQ) Tedavi Not: acufected geninin transkripsiyonel ifadesi ve protein üretimi ilgilenilen plazmid Transfeksiyondan 3 gün sonra uyarıcıların farklı tipleri ile tedavi edilebilir olan acufected 3. gün farelere saptanabilir. Biz IMQ krema ile IL-15ΔE7-acufected fare cildi tedavi ederek burada gösterilmektedir. IMQ bir imidazokinolin amin onaylanmış fya da dış genital ve perinatal siğiller 13 muamele edilmesi. Topikal IMQ tedavisi pul pul deri epidermal proliferasyonu ve dermal nötrofil infiltrasyon 12, 14, 15 tezahürü ile farelerde insan sedef gibi cilt bozukluklarının neden olduğu gösterilmiştir. Not: Plazmit vektörü C-ucuna (pEF-IL-de, bir IL-2 sinyal peptidi ve bir FLAG etiketi ile çevrili uzama faktör-1 alfa düzenlenmesinde (PEF) altında, tam uzunlukta fare IL-15 cDNA, içerdiği Bamford ve arkadaşlarının tarif edildiği gibi inşa edilmiştir 15, 5859 baz çifti). 16. Plazmid kalıntılarında ilk 16 amino asidini silmek için bir IL-15, şablon olarak 33 kullanılır - KİT IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5,811 baz çifti), IL-15 geninin ekson 7 48 (sentezi üstüste binme uzantısı) PCR yöntemi 17 ile. Başarıyla vardı Bakteri kolonileriIL-15ΔE7 ile transforme sınır enzimi sindirimi ile doğrulanmıştır ve DNA dizilimi 12, 18 ile takip edildi. protokolün adım 2&#39;de tarif edildiği gibi, endotoksin içermeyen plazmid DNA&#39;nın büyük bir miktar elde edilmiştir. <ol><li> tribromoetanol (g vücut ağırlığı başına 400 ug) karın içinden enjeksiyonu ile acufected fareler anestezi ve anestezi altında kuruluk önlemek için göze veteriner oftalmolojik merhem uygulanır. operatif prosedürler başlamadan önce anestezi yeterli derinlikte temin etmek ayak tutam refleksini kontrol edin. Not: 2 cm x 2 cm deri IMQ tedavi olacağından, pIL-15ΔE7 plazmid DNA (doz başına 10 uL PBS içinde 10 ug) 2 doz 2, hedef merkezler üzerinde acufected (1 cm x 1 cm) ekstrakte edildi. </li><li> Mark deri (x 2 cm, 2 cm) acufected alanı kapsayan çevrelemektedir. </li><li> topikal işaretli yüzey alanı üzerinde IMQ kremi uygulamak için Q-uçlu aplikatör kullanın. Not: adım 5.1 yalnızca ilk dozu (60 mg / doz) için gerçekleştirilir.Bir sonraki ardışık doz olmayan anestezi edilmiş farelerin uygulanır. </li><li> yüksek çözünürlüklü kamera ile günlük IMQ ile tedavi edilen dorsal cilt değişiklikleri belgelemek. Not: Bir kişi başka kaydedilirken fare tutar. Hareketsiz resimler vurularak daha sonra düzenlenir. </li><li> IMQ tedavi gün sonra 4 ya da 7. günde servikal dislokasyon tribromoetanol aşırı dozda (g vücut ağırlığı başına 800 ug) enjekte fareler öldürülür. Cilt kesilmiş ve işlenir (- 4.5 4.1 Adımları). </li></ol> Fare Skin 6. Homojenat <ol><li> Kuyruğun tabanından yatay kesim yapmak için cerrahi bir makas kullanın. arka bacağın tabanının iki taraflı devam ve ön ayakları tabanına yan boyunca dikey olarak kesim devam etmektedir. </li><li> Dikkatle ön posterior yatan dokusundan derisini yüzeceğim. dorsal derisini kesmek için makas kullanın. Steril bir Petri tabağına cilt yerleştirin. </li><li> Hedefi kesilmesi için bir neşter kullanınderi ve hemen sıvı nitrojen içinde dondurulur. Not: Deney-için-deney varyasyonu en aza indirmek için, her bir fare için sabit olan aynı olmayan acufected cilt boyutu (1 cm x 1 cm) veya IMQ tedaviden (2 cm x 2 cm). </li><li> kolları ve havan eli ile önceden soğutulmuş bir 2 bölmeli harç merkezinde donmuş deri dokusu yerleştirin. doku toz haline getirmek için harç üzerinde bir kurşun çekiç kullanın. </li><li> Hızla RNA ekstraksiyonu için ya da protein lizatı elde etmek için 50 ul PBS ve 1x proteaz inhibitörü kokteyli içeren bir tüp hücre liziz reaktifi 500 uL içeren yeni bir tüpe toz doku yerleştirin. </li></ol> Cilt, Bölüm 7. H &amp; E ve immünohistokimyasal boyanması <ol><li> bir kaset içinde cilt dokusu ve gece boyunca% 4 paraformaldehid içinde bırakın. </li><li> bizim durumumuzda LAC, NTU&#39;da Patoloji Laboratuvarı tarafından gerçekleştirildi yerleştir ve bölüm doku. Not: Bölüm 5 um kalınlığında kesilir. Talep doku sectipozitif yüklü slaytlar üzerine ons. </li><li> 15 dakika boyunca 65 ° C&#39;de slaytlar ısıtın. </li><li> Bir boyama rafa slaytları yerleştirin. iki kez 100,% 95,% 80,% 75,% 60 ve% rehidrasyon için% 50 etanol (her biri 5 dakika) ardışık daldırma izledi 5 dakika için ksilen yerine içeren tank karşılık gelen raf bırakın. boyama öncesi 3 dakika musluk suyunda slaytlar bırakın. </li><li> hematoksilen eozin boyama gerçekleştirin. Not: &#39;H &amp; E boyama LAC, NTU&#39;da Patoloji Laboratuarına talep üzerine uygulandı. </li><li> immünohistokimyasal boyama için, spesifik olmayan arka plan boyaması azaltmak için 5 dakika boyunca oda sıcaklığında blok çözeltisi ile bölüm bloke eder. Not: blok çözeltisi, ticari olarak immüno-lekeleme teknikleri ile geliştirilmiştir. Hiç bir hayvan serumu bu üründe yer almaktadır. </li><li> blok çözeltisi çalkalamak için PBS içinde slayt batırın. </li><li> 1:10 PBS içinde blok çözeltisi ile seyreltilir ve% 2 fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) (seyreltici çözeltisi) ekleyin. </li><li&gt; Pipet uygun şekilde seyreltilmiş birincil antikor bölümü üzerine ve oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edilir. Not: Antikorların seyreltici çözeltisi içinde seyreltilir. Bu boyama için antikor konsantrasyonları 1 en iyi duruma getirilmiştir: 800 ve 1: 200 Ki67 (klon SolA15) ve Ly6G (klon 1A8) için, sırası ile. Bu konsantrasyonlar, arka plan boyaması olmadan farklı leke gösterdikleri bulunmuştur. <ol><li> Aynı çözelti ikincil antikor, spesifik olmayan bağlanmanın kontrol edilmesi için ilk antikoru ihmal ile aynı vadede bir seri bölüm leke. </li></ol></li><li> Yıkama 5 dakika her biri için TBS içinde üç kez artı% 0.1 Tween-20 (TBST çözelti) kayar. yıkar arasında değiştirme çözüm. </li><li> her bölüme etiketli polimerlerin bir damla pipet ve 40 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Not: etiketli polimer, ticari olarak bir Fab&#39; fragmanı indirgenir peroksidaz ve sekonder antikor amino asit polimerleri birleştirilerek hazırlanır. Reaktif için kullanıma hazırdırFare doku kesitlerinin immünohistokimyasal boyanması. </li><li> Yıkama 5 dakika her biri için TBST üç kez kayar. yıkar arasında değiştirme çözüm. </li><li> Pipet 3,3&#39;-diaminobenzindine doku bölümü üzerine tetrahidroklorür (DAB) çözeltisi ve kahverengi bir çökelti, parlak alan mikroskopisiyle görülene kadar oda sıcaklığında beklemeye bırakılır. Not: DAB peroksidaz varlığında çökelmesi için süre yaklaşık 30 dakikadır. </li><li> peroksidaz aktivitesini durdurmak için suda bırakın slaytlar. nükleer boyanma için metil yeşil çözeltide Dip slaytlar. Yıkama 5 dakika her biri için PBS içinde üç kez kayar. </li><li> Kalıcı montaj ortamına (bölüm başına 8 uL) ile kaplanır lekeli bölümü üzerine bir lamel yerleştirin. </li></ol> 8. Fotoğraf ve Analiz Lekeli doku kesitinin <ol><li> parlak saha, mikroskop altında, H &amp; E ile boyanmış ve IHC doku bölümleri görselleştirmek. mikroskop bağlı şarj birleştiğinde cihaz (CCD) kamera ile resimler çekin. quantitative analiz, görüntüleme yazılımı kullanılabilir <ol><li> Bir 20X amacı ile bir scanscope kullanarak bütün lekeli bölümleri tara. </li><li> Epidermisin bir 1-mm kesimi içinde epidermal kalınlığı ölçülür ve segment içinde Kİ67-immüno-reaktif hücrelerin sayısı. NOT: Kantitatif analiz mikroskopi otomasyonu ve görüntü analiz yazılımı kullanılarak yapılır. Epidermal kalınlığı taban tabakası ve epidermisin en dış tabakası arasındaki mesafe ile tanımlanır. </li><li> Hemen topikal IMQ ile tedavi edilen derinin altında deri alanına (230 x 270 um 2 dikdörtgen) içinde Ly6G-immüno-reaktif hücrelerin sayısı. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cytokines+in+murine+cutaneous+irritant+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+toxicology+%3A+JAT%22%5BJournal%5D)">Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses.</a> Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).</li>
<li>Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+immune+sentinels+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">Skin immune sentinels in health and disease.</a> Nature reviews. 9, 679-691 (2009).</li>
<li>Liu, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+application+of+HIV+DNA+vaccine+with+cytokine-expression+plasmids+induces+strong+antigen-specific+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses.</a> Vaccine. 20, 42-48 (2001).</li>
<li>Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+application+of+viral+vectors+for+epidermal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer.</a> J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).</li>
<li>Partidos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+vaccines+into+the+skin+without+needles+and+syringes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Delivering vaccines into the skin without needles and syringes.</a> Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).</li>
<li>Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+DNA+through+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Immunization with DNA through the skin.</a> Methods. 31, 232-242 (2003).</li>
<li>Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+gene+transfer+to+mammalian+somatic+cells+by+particle+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).</li>
<li>Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+immunization+is+a+simple+method+for+eliciting+an+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response.</a> Nature. 356, 152-154 (1992).</li>
<li>Haynes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-mediated+DNA+vaccine+delivery+to+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin.</a> Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).</li>
<li>Tuomela, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+and+general+safety+of+a+naked+DNA+plasmid%2C+GTU-MultiHIV%2C+in+a+rat%2C+using+a+quantitative+PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method.</a> Vaccine. 23, 890-896 (2005).</li>
<li>Eriksson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+to+skin+and+wound+by+microseeding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding.</a> J Surg Res. 78, 85-91 (1998).</li>
<li>Lee, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternatively+spliced+IL-15+isoform+modulates+abrasion-induced+keratinocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation.</a> J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).</li>
<li>Rudy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imiquimod+%28Aldara%29%3A+modifying+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatol+Nurs%22%5BJournal%5D)">Imiquimod (Aldara): modifying the immune response.</a> Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).</li>
<li>van der Fits, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imiquimod-induced+psoriasis-like+skin+inflammation+in+mice+is+mediated+via+the+IL-23%2FIL-17+axis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis.</a> J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).</li>
<li>Sumida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+CXCR2+and+BLT1+facilitates+neutrophil+infiltration+and+resultant+keratinocyte+activation+in+a+murine+model+of+imiquimod-induced+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis.</a> J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).</li>
<li>Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%27+untranslated+region%2C+signal+peptide%2C+and+the+coding+sequence+of+the+carboxyl+terminus+of+IL-15+participate+in+its+multifaceted+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The 5' untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control.</a> J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).</li>
<li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes%3A+gene+splicing+by+overlap+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77, 61-68 (1989).</li>
<li>Tan, X., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+IL-15+isoforms+generated+by+alternative+splicing+are+expressed+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Immun%22%5BJournal%5D)">Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium.</a> Genes Immun. 7, 407-416 (2006).</li>
<li>Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+trafficking+of+DNA+in+keratinocytes%3A+evidence+for+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins.</a> Gene Ther. 11, 765-774 (2004).</li>
<li>Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+via+hair+follicles+by+topical+application+of+naked+DNA+to+normal+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin.</a> Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).</li>
<li>Kennedy-Crispin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes%27+response+to+injury+upregulates+CCL20+and+other+genes+linking+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity.</a> J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek mali çıkarlarını hiçbir var.

acufected plazmid DNA &#39;nın ekspresyonunu sağlamak için en önemli nokta, eşit salınım ve derinin boynuzsu tabaka gevşetilmesidir. Cildi kesilmeden hafifçe iğneler iterken, kuvvet yüzeyini bastırmak için yeterince sert olmalıdır. 1 cm x 1 cm yüzey alanı 10 uL çözelti içinde DNA emilmesini kolaylaştırmak için, iğneler 30 s, yaklaşık 100 kez yukarı ve aşağı salınım hareketi. Bir cilt prick gerekiyor kuvveti belirlemek ve acufected genin en iyi ifadesi seviyesini elde etmek için gerekli olan sayıyı işaret ederek yapabili...

Cilt konak savunmasının ilk basamak olduğunu. Keratinositler (KCs), insanlarda ve farelerin derisinde başlıca hücre tipidir. Çevresel uyarılara (örneğin, güneş ışığı, oksijen, kimyasal ve patojenik invazyonu) yanıt olarak, KCs aktif ve IL-8, IL-6, IL-1a, IL-1 p, TNF-a gibi iltihap öncesi sitokinler ve kemokinlerin geniş bir yelpazeye üretirler α ve GM-CSF 1. Birlikte cilde bağışıklık hücrelerinin alınmasını tetikleyebilir. Ağır deri iltihabı sıklıkla akut ektopik kontakt dermatit, kronik bir T hücresi aracılı enflamasyonun (örneğin, alerjik kontak dermatit ve psoriasis) 2 dahil olmak üzere çok sayıda insan hastalıkları ile bağlantılıdır. KC aktivasyonunu inhibe ederek derideki inflamatuar öncesi yanıtları modüle deri iltihabı tedavi etmek için makul bir yaklaşımdır. Bu protokol geçici bağışıklık res incelemek amacıyla epidermiste bir sitokin gen ifade için yeni bir yaklaşım anlatılmaktadırderide böyle bir muameleye sonuçta ponse. epidermis cildin en yüzeysel tabakası oluşturur. Bu tür cildin daha derin katmanları girmesini nükleik asitler ve patojenler olarak dış maddeleri tutmak fiziksel bir engel olarak görev yapar. Çeşitli iğnesiz teknikler epidermal DNA transferi, 3, 4 için kurulmuştur. Solüsyon içindeki DNA veya katyonik lipozomlar veya adenovirüs vektörleri ile bağlantılı doğrudan bu stratum corneum&#39;un çıkarılması ya da reaktif tüylerini giderildikten ile muamele gibi teknikleri ile modifiye epidermise tatbik edilmiştir. Kornifiye epitel çıkarılması, DNA bağışıklık tepkilerini 5 indükleme keratinositler, Langerhans hücreleri ile epidermal bariyer ve etkileşim geçen kolaylaştırır. Bir geniş yüzey alanı, DNA transferi için mevcuttur ve bu yaklaşım iğneler dahil etmese de, ihtiyacı da dahil olmak dezavantajları vardırsıyrılmasıyla - (100 ug 10), cilt üzerinde sert tedavi ve DNA verme güçlendirici 6 olmayan bağışıklık kazandırılmış hayvanlarda bağışıklık tepkisini indüklemede tutarsız sonuçlar DNA&#39;nın büyük miktarlarda. Deriye Çıplak DNA mikropartikül aracılı hücre için bağışıklık tepkisi 7, 8 indüklemek için yüksek verimli ve tekrarlanabilir olduğu gösterilmiştir. Elde tutulan bir gen tabancası basınçlı helyum hava akışı 9 yardımıyla büyüklüğü 2 um çaplı plazmid DNA ile kaplanmış altın partikülleri ile cildin hedef sitesi bombardıman için kullanılmıştır. Plazmit DNA, muhtemelen deri KCsand dendritik hücreler (DC) tarafından alınır ve protein yerel olarak ifade edilir veya DC&#39;ler 10 ile lenf düğümleri taşınır. Gen tabancası sistemi basit ve sınırlı teknik deneyim, &quot;DNA bul, hazırlanması ve teslim için maliyet gerektirse deizin &quot;(yani altın tozlar, helyum gazı) ve gen tabancası için kendisi genel uygulamasını sınırlamıştır. deneyler farklı yerlerde yapılmaktadır Buna ek olarak, bir helyum gaz iletim sistemi için ihtiyaç gen tabancası taşıma kolaylığı sınırlar. mikro- tek bir enjeksiyon ve partikül bombardımanı 11&#39;den daha gen transferinin bir yüksek verim elde etmek için ortaya konmuştur. mikro-parçacık boncuk kullanılmadan deriye DNA verilmesi için bir dövme silah kullanan 11. Salınımlı Bu yaklaşımı kullanarak, tüm cilt üzerine mikroiğneler muhtemeldir şirketinden aynı anda birden fazla hücrelere DNA transferi, böylece, hücre zarını, kazıma ve. Bununla birlikte, 0.254 mm çapında iğne ile enjeksiyon çok sayıda ilişkili ağrı bir dezavantajdır. Burada in vivo DNA aktarımından için alternatif bir yaklaşım sunmaktadır. &quot;Acufection&quot; </strOng&gt; Burada açıklanan protokol Fare deride plazmid DNA teslim etmek için ekonomik ve etkili bir yol sağlar. Kısaca, on akupunktur iğneleri (uzunluk x 13 mm, çap olarak 0.2 mm) yapışkan bant ile bir paket içinde bağlanmıştır. ilgi konusu transgeni ihtiva eden plasmid DNA, 10 ug PBS 10 uL bir hacmi tıraş, tüy dökücü krem ​​ile muamele edilmiş yan deri üzerine yerleştirilmiştir. cilt yüzeyine (1 cm x 1 cm) salınmasına akupunktur iğne demeti kullanılarak, dik katmanında keratin gevşetilmiş ve yüzeye uygulanır plazmid DNA epidermise absorbe edildi. Cilt hasarı izlenir ve minimal olduğu bulunmuştur. acufected deride transfekte olmuş bir genin ekspresyonu, hem nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ve ELISA ile doğrulandı. Deri iltihabı ile acufection teslim, IL-15ΔE7 immün modülatör etkileri IMQ ile muamele edilmiş fare modeli 12 ile gösterilmiştir. acufection kanıtlıyor olsa kolay ve daha az dema olmakin vivo olarak DNA nakli için bir yöntem nding, farklı genler ve cilt dikmek için kez, en uygun DNA miktarı da yeniden üretilebilir sonuçlar elde etmek için optimize edilmelidir.

<table><tbody><tr><td>Accu Handy İğne</td><td>Accu</td><td>36Gx0.5</td><td>Tıbbi cihaz</td></tr><tr><td>NairTM Losyon</td><td>Kilise & Dwight</td><td>N/A Saçları</td><td>çıkarmak için kullanın</td></tr><tr><td>Shandon Xyline ikamesi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6764506</td><td>Deparafinizasyon</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-Tribrometanol)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T4,840-2</td><td>Anestezi</td></tr><tr><td>2-metil-2-bütanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td>Avertin</td></tr><tr><td>DifcoTM LB et suyu, Miller</td><td>BD çözünmesi için çözücü</td><td>244620</td><td>Moleküler biyoloji için E. coli'nin yayılması ve bakımı</td></tr><tr><td>Fare IL-15/IL-15R Kompleksi ELISA Ready-SET-Go kiti</td><td>eBioscience</td><td>88-7215</td><td>Ölçü IL-15 proteini</td></tr><tr><td>Anti-fare Ly6G</td><td>BioLegend</td><td>127601</td><td>İmmünohistokimyasal leke için kullanılan</td></tr><tr><td>anti-fare Ki-67</td><td>eBioscience</td><td>14-5698-80</td><td>Antikor için kullanılır immünohistokimyasal leke</td></tr><tr><td>Basit Leke Fare MAXPO (Sıçan)</td><td>Nichirei Biosciences</td><td>414341F</td><td>Fare üzerinde fare lekesinde arka plan sinyalini engellemek için reaktif</td></tr><tr><td>DAB Peroksidaz (HRP) Yüzey Kiti</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>SK-4100</td><td>İmmünohistokimyasal boyama için perokside substrat</td></tr><tr><td>Ultra V bloğu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-060-UB</td><td>Spesifik olmayan arka plan lekelenmesini azaltın</td></tr><tr><td>Metil yeşili</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8884</td><td>Nükleer boyama</td></tr><tr><td>Vecta MountTM</td><td>Vector Laboratories</td><td>M-5000</td><td>Histokimyasal lekelerin kalıcı olarak korunması</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyl tabletleri</td><td>Roche</td><td>04-693-116-001</td><td>Hücre lizatında proteaz aktivitesini inhibe</td></tr><tr><td>edin Aldara kremi</td><td>3M Parmaceuticals</td><td>N/A</td><td>%5 imiquimod krem</td></tr><tr><td>Bessman Doku Pulverizatörü</td><td>Spectrum Labs</td><td>189475</td><td>Cilt dokusunu toz haline getirmek için kullanın</td></tr><tr><td>ABI7900HT döngüleyici</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>kantitatif gerçek zamanlı PCR testi</td></tr><tr><td>Video Kamera</td><td>Panasonic</td><td>HDC-SD60</td><td>Görüntü belgeleri</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td>Parlak alan mikroskobu</td></tr></tbody></table>

&quot;acufection&quot; ve cilt araştırmaları onun uygulaması tarafından bir ekonomik dna yerleştirme sisteminin geliştirilmesi

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Deride bağışıklık yanıtının düzensizliği sayısız insan derisi bozuklukları ile ilişkilidir. deri dokusu, bağışıklık ile ilişkili genlerin doğrudan transferi insan hastalıklarının fare modellerinde deri inflamasyon, immün modülasyonunu araştırmak için ilginç bir yaklaşımdır. Burada fare deri çıplak DNA teslim ve transgen ifadesine yol açan düşük maliyetli bir protokol mevcut. Yöntem, aku delinmez aracılı DNA trans Fection belirten, &quot;acufection&quot; terimini almaktadır. acufection gerçekleştirmek için, fare deri önce fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde DNA ile aşılanmış ve daha sonra hücrelere DNA emme ve transfeksiyon kolaylaştırmak için akupunktur iğneleri bir paket ile hafifçe dürtülmüş. plazmid DNA muhtemelen keratinositler ve deride dentritik hücreler (DC&#39;ler) ile alınır ve protein içine eksprese edilir. Iğneler bizatihi Mekanik prick zarar veya keratinosit aktivasyonunu uyarmadı. İfadetransfekte olmuş genlerin 2 gün acufection aşağıdaki transkripsiyonel ve translasyonel her iki düzeyde de deride tespit edildi ve 7 güne kadar sürmüştür. Bu acufection yöntemin geliştirilmesi için birincil amacı, IL-15, daha önce tanımlanmamış izoformu araştırmaktır. inflamasyonunu indüklemek amacıyla, deride eksprese edilir ve daha sonra bir Toll benzeri reseptör 7 (TLR7) agonisti, imikimod (IMQ) ile muamele, bu yöntem, kısmen silinmiş ekson 7 (IL-15ΔE7) bir alternatif olarak eklenmiş, IL-15 izoformunun edildi kullanılması. Acufection teslim deri IL-15ΔE7 IMQ bağlı deri iltihabı, keratinositlerin çoğalmasını, epidermal kalınlığı ve nötrofil bastırılır. Kutanöz enflamasyon düzenleyici mekanizmaların tanımlanması artan ilgi ile, protokol burada tarif edilen in vivo olarak DNA nakli için gen tabancası sistemi ya da mikro-için uygun maliyetli bir ve çok yönlü bir alternatif sağlar. Bu potansiyel olarak bir yeni fonksiyonunun keşif izin verebilirderide veya kutanöz hastalıklar için yeni tedavi araştırmak için gen.

Bazı kızarıklık akupunktur iğne ile delmeden sonra ilk saat içinde belirgin iken, cilt 2 gün temizlenir ve 7 gün kadar olumsuz deri reaksiyonu (Şekil 2A) batıcı sonra gözlenmiştir. İğne iğneleyici görmemiş deri (Şekil 2B) ile karşılaştırıldığında, H &amp; E analizi ile epidermal orthokeratosis ve en az deri infiltrasyonu çok düşük seviyede indüklenmiş. Epidermal kalınlık (Şekil 2C) ve Ki 67 +</...

Bu protokol Fare deride çıplak plazmid DNA eksprese etmek için uygun maliyetli bir alternatifidir. protokol genel amacı deri iltihabı, belirli bir genin işlevsel rolünü betimlemişlerdir cilt dokusuna immün ilişkili genleri sunmaktır.

&quot;Acufection&quot; ve Cilt Araştırmaları onun Uygulaması tarafından bir Ekonomik DNA Yerleştirme Sisteminin Geliştirilmesi

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

Bu prosedürün genel amacı, deri iltihabında spesifik bir genin fonksiyonel rolünü belirlemek için bağışıklıkla ilgili genleri deri dokusuna aktarmaktır. Bu yöntem, deride yeni bir genin işlevinin keşfedilmesine yardımcı olabilir. Ayrıca sedef hastalığı gibi deri hastalıkları için yeni tedavilerin geliştirilmesine katkı sağlayabilir.Bu tekniğin temel avantajı, plazmid DNA'nın fare derisinde eksprese edilmesi için maliyet etkin bir yöntem sunmasıdır. Plazmid DNA'yı hazırlamak için, önceden transforme edilmiş ve seçilmiş bakteriyel koloniyi üç mililitre antibiyotikli LB besiyerine ekleyin. Kültürü bir çalkalayıcıda 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.Gece boyu inkübasyonun ardından, kültürü ölçeklendirmek için antibiyotiklerle desteklenmiş 250 mililitre LB medyumunda seyreltin. Kültürü 37 degrees Celsius sıcaklıkta, çalkalamalı olarak gece boyu inkübe edin. Büyük miktarda DNA hazırlamak için yüksek kaliteli, endotoksin içermeyen bir plazmit hazırlama kiti kullanın.Elde edilen plazmit DNA'yı, final konsantrasyonu bir miligram/mililitre olacak şekilde steril PBS içinde dilüe edin. Fareyi anesteziye aldıktan sonra, kurumayı önlemek için gözlerine veteriner oftalmik pomad uygulayın. Ardından hayvanın sırtındaki tüyleri tıraş edin.Kalan kıl şaftlarındaki keratin proteinlerini çözmek için depilatuar bir krem uygulayın. Epilasyonun ardından kremi suyla ıslatılmış pamukla silerek temizleyin. %70 etanol ile ıslatılmış steril bir pamuklu çubuk kullanarak cilt yüzeyini dezenfekte edin ve hedef cilt bölgesini önceden hazırlanmış şablonla işaretleyin. 10 µg plazmid DNA içeren 10 µL DNA solüsyonunu istenen cilt bölgesine uygulayın.Fareye akupunktur uygulamak için, akupunktur aparatını cilde dik tutun ve belirlenen yüzeyi tekrarlayan şekilde punkte edin. Bu işlem, 30 saniye boyunca 100 kez veya cilde uygulanan solüsyon emilene kadar gerçekleştirilmelidir. Cilt dokusunda başarılı plazmid DNA ekspresyonu sağlamak için, cildi derinlemesine kesmekten kaçınmak ve DNA solüsyonunun iyice emildiğinden emin olmak önemlidir.Prosedür tamamlandıktan sonra, anestezi etkisinden çıkana kadar vücut ısısını koruması için etkilenen fareyi bir ısıtma pedine yerleştirin. Fare yeterli düzeyde bilinç kazandığında, onu kafesine geri götürün ve su ile yem sağlayın. Prosedürden sonraki ilk 48 saat boyunca fareyi; davranışsal değişiklikler ve anormal görünüm dahil olmak üzere herhangi bir rahatsızlık belirtisine karşı yakından izleyin.Daha önce IL-15deltaE7 ile etkilenmiş olan iki santimetreye iki santimetrelik flank deri alanını işaretleyin. Ardından, bir pamuklu aplikatör kullanarak belirtilen yüzey alanına topikal olarak Imiquimod kremi uygulayın. Imiquimod ile tedavi edilen dorsal derideki günlük değişimleri izlemek için, bir araştırmacı kayıt alırken ikinci araştırmacı fareyi güvenli bir şekilde tutmalı ve tedavi edilen alanı yüksek çözünürlüklü video kameranın görüş alanına getirmelidir.İşlem görmüş cilt üzerinde gümüş rengi pullanma, plak veya eritem gibi değişikliklerin olup olmadığını gözlemleyin. Fareyi belirtilen şekilde sakrifiye ettikten sonra, serolojik makas kullanarak kuyruk tabanından yatay bir insizyon yapın ve kesiyi her iki arka ekstremitenin tabanına doğru bilateral olarak genişletin. Ardından, yanlarla hizalanan ve dört ekstremitenin her birinin tabanına ulaşan dikey kesilerle devam edin.Hayvanın kuyruğundan başlayarak baş kısmına doğru, deriyi alttaki dokudan dikkatlice soyun. Makas kullanarak dorsal deriyi kesin ve elde edilen örneği steril bir Petri kabına aktarın. Bir skalpel yardımıyla, hedef deriden uygun bir örnek kesin.Ardından örneği hemen sıvı nitrojen içinde dondurun. Deri dokusunu toz haline getirmek için, dondurulmuş örneği daha önce soğutulmuş, tutamaklar ve havan eli ile donatılmış iki bölmeli bir doku pulverizatörünün merkezine yerleştirin ve havan üzerinde kurşun bir çekiç kullanın. Toz haline getirilen dokuyu, sonraki analizler için uygun reaktifleri içeren yeni tüplere hemen aktarın.Metin protokolünde detaylandırıldığı şekilde hazırlanan formalinde fikse edilmiş parafin gömülü deri kesitlerinin bulunduğu lamları, 65 °C'de 15 dakika boyunca ısıtarak boyama işlemine başlayın. Lamları beş dakika boyunca iki kez ksilenle yıkayın. Ardından, lamları bir etanol gradyanı üzerinden yeniden hidrate edin.Son olarak, boyama işleminden önce lamları üç dakika boyunca musluk suyu ile yıkayın. İmmünohistokimyasal boyama için, önce dokunun etrafını su geçirmez bir kalemle daire içine alın ve ardından spesifik olmayan arka plan boyamasını önlemek için kesiti bloklama çözeltisi ile inkübe edin. Bloklamadan sonra, lamı PBS ile yıkayın.Ardından, seyreltilmiş primer antikoru kesit üzerine pipetle aktarın ve oda sıcaklığında 60 dakika boyunca inkübe edin. Slaytları TBST içerisinde beşer dakikalık üç yıkama işlemine tabi tutun. Daha sonra, kesitin üzerine bir damla işaretli polimer ekleyin ve slaytı oda sıcaklığında 40 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, slaytı TBST içinde beş dakika boyunca, her yıkama arasında solüsyonu yenileyerek üç kez yıkayın. Daha sonra doku kesitlerinin üzerine 100 µL DAB solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında reaksiyona bırakın. Mikroskop altında kahverengi bir ürün gözlemlenene kadar bekleyin.Ardından, peroksidaz aktivitesini durdurmak için lamları suyla yıkayın. Kesitleri, DNA'ya spesifik olarak bağlanan Metil Yeşil çözeltisi ile beş saniye boyunca karşı boyayın. Lamları, her biri beş dakika sürecek şekilde üç kez PBS ile yıkayın.Boyanan kesitin üzerine sekiz µL kalıcı montaj medyumu ekleyin ve bir lamelle kapatın. Son olarak, slaytları metin protokolünde açıklandığı şekilde görüntüleyin. Burada, bir kontrol fare ve fotoğraf çekilmeden bir saat, iki gün, beş gün veya yedi gün önce acufekt edilmiş bir fare gösterilmektedir.Burada gösterildiği gibi, akuveksiyon prosedürü belirgin bir cilt hasarına yol açmamıştır. Ayrıca, akuveksiyon ne cilt kalınlığını ne de Ki67 pozitif hücre sayısını etkilemiştir. Bu durum, prosedürün doku bozulmasına veya epidermal hücre proliferasyonuna neden olmadığını daha fazla doğrulamaktadır.qRT-PCR kullanılarak ölçülen CXCL-1 ve IL-6 ekspresyonu, acufection altında gözlemlenen minimal keratinosit aktivasyonunu doğrulamaktadır. Öte yandan, qRT-PCR ve ELISA, IL-15 geni ile acufection uygulanan farelerin derisinde belirgin IL-15 ekspresyonu olduğunu ortaya koymuştur.Nihayetinde, IL-15deltaE7 geninin acufection aracılığıyla deri dokusuna iletilmesi, Imiquimod ile tedavi edilen farelerde pullu deri gelişimini ve nötrofil infiltrasyonunu önler. Bu prosedürde uzmanlaşıldığında, uygun şekilde yürütülürse işlem 12 dakikada tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, her acufection işlemi için yeni bir iğne demeti ve bir grup yüksek kaliteli plazmid DNA hazırlanması gerektiğini hatırlamak önemlidir.Bu prosedürün ardından, yeni bir genin antiviral bağışıklık yanıtını modüle etmedeki işlevi gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla virüs enfeksiyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu yöntem, immünoloji alanındaki araştırmacıların ciltteki bağışıklık yanıtını keşfetmelerine zemin hazırlayacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, fare cildinde plazmit DNA ekspresyonunun maliyet etkin bir şekilde nasıl indükleneceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

development-an-economical-dna-delivery-system-acufection-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video protokolü, epidermal keratinositler ve cansızlaştırılmış insan dermisi kullanarak insan organotipik cildi oluşturmak için kaset tabanlı bir in vitro kültür tekniğini açıklar. İn vivo doku muadillerinin işlevini ve fizyolojisini taklit ederler.

Organotipik 3D Cilt Kültürü: Aselüler Dermiste İnsan Epidermisini Yeniden Oluşturmak İçin Kaset Tabanlı İn Vitro Kültür Tekniği

Video, interlökin-15 kodlayan plazmit DNA'sının, mikroiğneler kullanılarak akupunktur yoluyla interlökin-15 eksikliği olan bir fare modelinin cilt dokusuna doğrudan aktarılması için bir yöntemi göstermektedir. Bu mikroiğneler, cildin en dış tabakasında mikroponksiyonlar oluşturarak, plazmit DNA'nın cilt dokusu içindeki keratinositler de dahil olmak üzere epidermal hücrelere emilimini ve transfeksiyonunu kolaylaştırır.

Bağışıklık ile İlgili Genlerin Fare Cilt Dokularına Akupreksiyon Aracılı Verilmesi

Cilt dövme intradermal teslimat DNA aşısı için güçlü ve güvenli bir yoldur. Burada, bir DNA plazmid kodlama EGFP bir laboratuvar fare cilt dövme tarafından teslim edilir ve cilt hücrelerinde EGFP ifadesi ardından konfokal mikroskopi tarafından denetlenir.

Cilt DNA Aşı Teslim İçin Yeni Bir Yaklaşım olarak Dövme

Bu çalışma, somatik hücrelerin in vivo olarak teratom oluşumu olmadan pluripotentliğe doğru yeniden programlandığını göstermektedir. Yetişkin hepatositlerin artmış pluripotentliğe sahip hücrelere in vivo yeniden programlanmasını indüklemek için Yamanka faktörlerini kodlayan plazmid DNA'nın hidrodinamik kuyruk veni enjeksiyonunu kullandık.

İn vivo Yamanaka Faktörlerinin Aşırı İfadesi ile Yetişkin Somatik Hücrelerin Pluripotentliğe Yeniden Programlanması

Bu makalenin amacı, epidermal keratinositlerden ve devitalize insan dermisinden genetik olarak değiştirilmiş insan organotipik derisinin nasıl oluşturulacağına dair kapsamlı ve ayrıntılı bir protokol sağlamaktır.

Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi

Akdeniz meyve sineği (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) dünya çapında bir tarım zararlısıdır. Biyolojisinin daha derin bir şekilde anlaşılması, medfly popülasyonlarını kontrol etmenin ve böylece ekonomik etkiyi azaltmanın anahtarıdır. Embriyo mikroenjeksiyonu, bu türde hem germ hattı transformasyonuna hem de ters genetik çalışmalara olanak sağlayan temel bir araçtır.

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Bu makalede, biz emici microbiopsy tekniği nasıl yapılır ve nasıl örnek için RNA çıkarma basit ve aynı zamanda yapılan örnekleme için-deri ve kan minimal invaziv bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedir.

Emici Microbiopsy örnekleme ve RNA çıkarma minimal invaziv, eşzamanlı kan ve cilt analizi için

Burada DNA programlı yapıştırma kullanarak mikropattern hücrelere tek hücreli çözünürlükte bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, cam bir slaytta DNA oligonükleotid desenleri oluşturmak için bir tezgah üstü fotolithografi platformu kullanır ve daha sonra hücre zarlarını ticari olarak mevcut tamamlayıcı oligonükleotidlerle etiketler. Oligoların hibridizasyonu programlanmış hücre yapıştırılması ilesonuçlanır.

DNA Kullanarak Hücrelerin Basit, Uygun Fiyatlı ve Modüler Deseni

Burada, doku etkileşimlerini, 4D görüntüleme timelapse filmini (3D artı zaman), moleküler fonksiyonun küresel veya yerel bozulmasını ve sistem biyolojisi karakterizasyonunu incelemek için kullanılabilecek üç tip kuş embriyonik deri eksplant kültürü için protokolleri açıklıyoruz.

Doku Desenini ve Organogenezi İncelemek için Kuş Derisi Eksplantlarının Kullanılması

Burada, dikey olarak hizalanmış karbon nanofiberlerin (VACNF'ler) mikrofabrikasyon edilmesi, VACNF'lerin esnek substratlara aktarılması ve VACNF'lerin biyomolekül ve boya dağıtımı için bitkilere hem sert hem de esnek substratlar üzerinde uygulanması için yöntemleri açıklıyoruz.

Biyomoleküllerin ve boyaların bitkilere verilmesi için sert veya esnek substratlar üzerinde dikey olarak hizalanmış karbon nanofiber dizilerinin kullanılması

Öğrenin fare derisinde plazmid DNA ifadesi için maliyet etkin akupunktur tabanlı gen iletimi yöntemini. Bu teknik immünoloji ve cilt hastalıkları araştırmalarında yeni terapilerin geliştirilmesine yardımcı olur.

"Acufection" ve Cilt Araştırmaları onun Uygulaması tarafından bir Ekonomik DNA Yerleştirme Sisteminin Geliştirilmesi

Daha fazla video keşfet