Kullanılması Anne Gen Ürünlerinin Fonksiyonel Manipülasyonu İn Vitro Oosit Olgunlaştırma

Bu protokolün genel amacı, zebra balığı oositlerinin in vitro olgunlaşmasını gerçekleştirmek ve istenirse, döllenmeden önce maternal gen ürünlerini işlevsel olarak manipüle etmektir. Bu yöntem, gelişimsel biyoloji alanında, annenin embriyoya katkısının önemi ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, oositlerin in vitro olarak kültürlenmesi, ardından döllenme ve canlı embriyoların üretilmesidir.

Ve istenirse, döllenmeden hemen sonra erken embriyoda etkili olan maternal gen ürünlerinin fonksiyonel manipülasyonuna izin verir. Başlamak için, in vitro kültür manipülasyonundan sekiz ila 10 gün önce, istenen suştaki tek bir erkek ve tek bir dişi balığın birden fazla setini bir çiftleşme tankına aktarmak için bir balık ağı kullanın. Onları gece boyunca çiftleşme tankında bırakın.

Balığın ertesi öğleden sonra çiftleşmesine izin verdikten sonra, çiftleşme sırasında yumurta veren dişileri ayırmak için bir balık ağı kullanın ve onları ayrı bir tanka koyun. Bu dişileri günde iki kez, yaklaşık eşit miktarda salamura, karides ve balık yemi gevreği içeren bir gıda karışımı ile besleyin. Steril koşullar altında, 50 mililitrelik konik bir tüpe 20 mililitre Leibovitz'in l-glutamin, PH 7.0 içeren L-15 Medium'unu ekleyin.

Ardından, PH 9.0'a getirmek için 10 Normal sodyum hidroksit kullanın. İki ayrı 50 mililitrelik konik tüpe 9 mililitre L-15 Medium ekleyin. Ardından, bir tüp DHP'yi ve diğer DHP'yi etiketleyin.

DHP tüpüne 10 mikrolitre DHP, 490 mikrolitre DH2O ve 500 mikrolitre %10 BSA ekleyin. DHP tüpüne mililitre gentamisin, 400 mikrolitre DH2O ve 500 mikrolitre% 10 BSA başına 10 mikrolitre 10 miligram ekleyin. Oositlerin diseksiyonunu yapmak için, bir molar tris PH 9.0 ile PH 7.0'a tamponlanmış, DH2O'da% 0.2'lik bir tricaine stok çözeltisi hazırlayarak başlayın.

Bu çözeltiyi 4 santigrat derecede tutun. Tesisteki günlük ışık döngüsünün bitiminden sıfır ila dört saat önce, 250 mililitrelik bir behere 20 mililitre% 0.2 tricaine stok çözeltisi, PH 7.0, 80 mililitre balık suyu ekleyin ve karıştırın. Prosedürün, balığın alışkın olduğu gün ışığı döngüsünün bitiminden sonraki dört saat içinde başlatılması çok önemlidir.

Aksi takdirde, yumurtalar düzgün bir şekilde olgunlaşmaz. Bir kaşık kullanarak, ötenazi yapılmış balıkları tricaine solüsyonundan toplayın ve kısa bir süre balık suyunda durulayın. Ardından, fazla suyu emmesi için balığı bir kağıt havlu üzerine koyun.

Ötenazi yapılmış balığın göğüs yüzgeci seviyesinde kafasını kesmek için temiz bir tıraş bıçağı kullanın. Daha sonra, diseksiyon makasıyla, balığın ventral tarafında, ön uçtan anal bölgeye uzanan uzunlamasına bir kesi yapın. Balıkları, gelen ışıkla diseksiyon mikroskobu altında bir Petri kabına yerleştirin.

Daha sonra, bir çift diseksiyon forseps kullanarak, yumurtalık kısımlarını izole edin ve dokuyu dört mililitre Leibovitz'in L-15 Meidum, DHP'sini içeren 35 x 10 milimetrelik bir kültür kabına aktarın. Şimdi, diseksiyon forsepsleri ile oositleri foliküler kütleden nazikçe ayırın. Maksimum boyuta yakın olan ve koyu opak bir sitoplazma ve oosit içinde asimetrik olarak bulunan kolayca görülebilen bir germinal vezikül veya GV ile karakterize edilen erken evre dört oositi sıralayın.

Oositleri daha erken aşamalarda atın ve yarı saydam olgun aşama 5 yumurtaları. Erken evre dört oositi, dört mililitre Leibovitz'in L-15 Medium'u ve ayrıca DHP içeren ikinci bir 35 x 10 milimetre plastik kültür kabına aktarmak için bir cam mera pipeti kullanın. Artı DHP çözeltisini içeren tabağa minimum miktarda eksi DHP ortamı aktarın.

mRNA enjekte ediliyorsa, enjeksiyondan hemen önce, MRNA'yı 0.1 molar potasyum klorürden oluşan nihai bir çözeltiye seyreltmek için RNA dereceli ters ozmoz suyu ve 0.2 molar potasyum klorür kullanın. Enjeksiyondan hemen önce Morpholinos veya MO'lar enjekte ediliyorsa, 0.1 molar potasyum klorür nihai konsantrasyonunu elde etmek için MO'ları RNA dereceli ters ozmoz suyu ve 0.2 molar potasyum klorür kullanarak istenen konsantrasyona seyreltin. Daha sonra, enjeksiyonu gerçekleştirmek için, oositleri ince forsepslerle manuel olarak tutun ve çekilmiş bir cam kılcal pipetle yapılan bir iğne kullanarak, vahşi tip dördüncü aşama oositlere yaklaşık bir nanolitre enjekte edin.

Olgunlaşmamış ve enjekte edilen oositleri DHP ortamında 26.5 santigrat derecede inkübe etmeye devam edin. Oositlerin sağlam kaldığından ve giderek yarı saydam hale gelerek uygun olgunlaşma geçirdiğinden emin olmak için yaklaşık her 30 dakikada bir kontrol edin. Parçalanan oositleri çıkarmak için bir mera pipeti kullanın.

Ve ortamın kalitesini korumak için bunları bir laboratuvar atık kabına atın. Taze DHP ortamı hacminin yaklaşık yarısı ile, oosit lizis miktarına bağlı olarak berrak bir çözelti sağlamak için kültür ortamını değiştirin. Oositlerin çoğunluğu yarı saydam hale geldiğinde ve artık belirgin olmayan bir GV'ye sahip olduğunda, oosit ile zar arasında artan boşluk olan bir bölgede foliküler zarda bir yırtık yapmak için ekstra ince forseps kullanın.

Zarın bir kısmını soyun ve soyulmuş kısmı basılı tutarken oositi zardan yuvarlayın. Bir diğer kritik adım, foliküler zarın çıkarılmasıdır. Bu tabaka tam olarak çıkarılmazsa, döllenme ve koryon genişlemesi engellenecektir.

Defolliküle edilmiş oositleri minimum hacimde bir ortamda, birkaç damla kültür DHP ortamı içeren bir Petri kabına aktarın ve döllenmeye devam edin. Oosit olgunlaşma aşamasının sonuna yakın ve defollikasyondan önce, 500 mikrolitre Hank Solüsyonunda beş erkekten alınan testisleri kullanarak bir sperm solüsyonu hazırlayın. DHP kültür ortamındaki defolliküle oositlere 10 ila 50 mikrolitre sperm çözeltisi ekleyin.

Ardından 10 saniye bekleyin. Bir pipet kullanarak, oositlere birkaç damla E3 ortamı ekleyin. Bir dakika bekleyin ve ardından plakayı doldurmak için E3 ortamını kullanın.

Döllenmiş embriyoların gelişmesine izin verdikten sonra, daha önce döllenme ve evreleme için tarif edildiği gibi başarılı bir döllenmeyi sağlamak için bölünme aşamalarındaki ilerlemeyi gözlemlemek için iletilen ışık optikli bir diseksiyon mikroskobu kullanın. GFP'nin ekspresyonu ile görüldüğü gibi, in vitro kültürden elde edilen oositler, oosit gelişimi boyunca iki saat gibi kısa bir sürede eksojen mRNA'dan protein üretebilir. Bununla birlikte, yalnızca oogenezin dördüncü aşamasında kültür koşullarını başlatan oositler, olgun beşinci evre oositlere dönüşebilir.

Bu deneyde, enjekte edilen vahşi tip aurora B mRNA, karşılık gelen geni olan hücresel adadaki bir mutasyonun fenotipik etkilerini kurtarır. Bir kontrol grubundan alınan embriyoların da karşılık gelen mutant fenotipi göstermek için gelişmesine izin verilir. Translasyonu bloke eden bir Morfolino'nun enjeksiyonu, lrmp-MO'nun oositlere enjeksiyonu ile gösterildiği gibi, bilinen mutant fenotipini başarılı bir şekilde fenoskopileyebilir, bu da karşılık gelen mutasyon futil döngüsünün mutant fenotipini taklit eder.

mRNA kodlaması, erken embriyo içindeki karşılık gelen ürünleri görselleştirmek için vahşi tip veya mutant oositlere de enjekte edilebilir. Örneğin, burada görüldüğü gibi, Sass6-mCherry proteini, sentrozom markörü Gamma tubulin tarafından etiketlenen odaklara lokalize olur. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa yaklaşık 5 ila 6 saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, prosedürü aceleye getirmemeyi ve defollikasyon ve döllenmeden önce oositlerin uygun şekilde olgunlaşmasına izin vermeyi unutmamak önemlidir. Bu işlemi takiben, ek soruları cevaplamak için embriyoların sabitlenmesi gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. İlgilendiğiniz genin kurtarılması veya RNA veya proteinin lokalizasyonu gibi.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, erken embriyo oluşumu alanındaki araştırmacıların, zebra balıklarında maternal gen ürünlerinin katkısını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığı oositlerinin in vitro olgunlaşması yoluyla maternal gen ürünlerinin işlevsel olarak nasıl manipüle edileceğini iyi anlamış olmalısınız.