Name: Co-immunoprecipitation tarafından Nükleer ve Sitoplazmik Kesirler Protein-protein Etkileşim görselleştirme ve In Situ Proximity ligasyon Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Öğrenin, nükleer ve sitoplazmik kesirlerdeki protein-protein etkileşimlerini görselleştirmek için co-immunoprecipitation ve proximity ligation assay yöntemlerini nasıl karşılaştıracağınızı. Bu teknikler NF90-RBM3 etkileşimlerinin dağılımını incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNSF, 31003A_163305) tarafından desteklenmiştir.

1. ko-immünopresipitasyon <ol><li> Tohum bir 6-yuvalı plaka içindeki oyuk başına 2 x 10 5 hücre HEK293 hücreleri 2 mi,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ilave 100 U / ml penisilin-streptomisin (LTR yükseltici) durumunda . </li><li> % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de 48 saat boyunca hücrelerin büyütün. </li><li> soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile üç kez hücreleri yıkayın. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüj ile hasat hücreleri. </li><li> ticari nükleer ve sitoplazmik çıkarma reaktifler kullanılarak nükleer ve sitoplazmik kesirler hazırlayın. bazı değişikliklerle üreticinin talimatı uygulayın. <ol><li> Bir ko-immünopresipitasyon deneyi (bir 6-yuvalı plaka 3 kuyu ile yaklaşık olarak% 90 oranında konfluent) 3 x 10 6 hücre kullanın. en yüksek hızda 15 saniye için 300 ul soğuk sitoplazmik ekstraksiyon çözeltisi (CER I) ve vorteks ekleyin. </li><li> Buz üzerinde 30 dakika süreyle inkübe edin. İnkübasyon, vorte sırasında5 s her 10 dakika için, x. </li><li> 5 saniye boyunca 16,5 ul soğuk sitoplazmik ekstraksiyon çözeltisi II (CER II), girdap ekleyin ve buz üzerinde 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de 5 saniye ve santrifüj vorteksleyin. </li><li> Yeni bir ön-soğutulmuş tüp içine süpernatant (sitoplazmik ekstresi) aktarın ve kullanılıncaya kadar buz üzerinde tutmak. </li><li> Her zaman yukarı pipetleme ve beş kat aşağı 1 ml soğuk PBS ile çözülmez topakları (içeren çekirdekleri) üç kez yıkayın. yıkamadan sonra PBS kaldırmak. </li><li> 15 saniye süre ile 150 ul soğuk çekirdek ekstraksiyon çözeltisi (EŞ), girdap ekleyin ve buz üzerinde 1 saat inkübe edilir. İnkübasyon sırasında, 15 saniye ve pipet 200 ul ucu ile 10 kez, her 10 dakika boyunca vorteks. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de 15 saniye vorteksleyin ve santrifüjlenir. </li><li> Yeni bir ön-soğutulmuş tüp içine süpernatant (nukleer extract) transfer kullanana kadar buz üzerinde tutmak. </li></ol></li><li> Her girdi olarak nükleer ve sitoplazmik özler hacminin% 10 çıkar. </li><li> bir1 ml&#39;lik bir son hacme kadar geri kalan özler, soğuk PBS dd. Buz üzerinde kullanıma kadar muhafaza edin. Not: Protein G-konjuge manyetik boncuklar kullanıldığında Ön temizleme gerekli değildir. Arka plan yüksek, ancak, 40 ul protein G-konjuge manyetik boncuk (% 50 bulamaç) ve, bir döndürücü üzerinde 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de bu aşama lizat seyreltilmiş 1 ml inkübe edilerek ön temizleme yapar. Manyetik raf ile boncuklar ayrı süpernatant (önceden temizlenmiş lizat). boncuk atın. </li><li> Protein G-konjuge manyetik boncuklar ile çift primer antikor için, 4 ug tavşan poliklonal anti-RBM3 antikoru veya tavşan IgG (negatif kontrol), 200 ul PBS artı Tween 20 tamponu ile Protein G-konjuge manyetik boncuk (% 50 çamurlu) ul 40 inkübe (PBST,% 0.02 Tween 20) ile, bir döndürücü üzerinde 40 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT). </li><li> Ayrı bir manyetik raf ile boncuk ve süpernatant antikor birleştiğinde, ve supernatant atın. 200 ul PBST (% 0.02) ile bir kez boncuk yıkayın. </li><li> 1 eklemi tanelere lizatları (ya da gerektiğinde, önceden temizlenmiş lizatları halinde) ile seyreltildi ve gece boyunca 4 ° C &#39;de, bir döndürücü üzerinde inkübe edin. </li><li> Ertesi gün, bir manyetik raf boncuk ve süpernatant ayırın ve supernatant atın. 20 rpm sabit bir hızla, bir döndürücüde 4 ° C de, her bir tüp için 0.5 mi PBST (% 0.02) ile 3 x 10 dakika yıkanır. </li><li> 40 ul numune tamponu (1 x ticari numune tamponu ve 50 mM 1,4-ditiyotreitol (DTT)) eklenerek boncuk proteinleri Zehir. 10 dakika boyunca 70 ° C&#39;de ısıtın. Yeni 1.5 ml tüp aşağı Spin ve taşıyıcı sıvılar. </li><li> 10 dakika boyunca 70 ° C&#39;de ve ısı (1 x ticari numune tamponu ve 50 mM DTT nihai konsantrasyon) numune tampon maddesi girdi lizatları seyreltilir. Bir prekast% 4-12 bis-Tris jel son adımdaki yük giriş ve immunoprecipitated proteinler. Her çukurun yükleme hacmi 20 ul aşmamalıdır. 35 dakika boyunca buz üzerinde 1 x ticari çalışan tamponu içinde elektroforez gerçekleştirin. NOT: Yük nükleer ve sitoplazmik özühücrelerin aynı başlangıç ​​miktarını yansıtır 2 (v / v), 1 bir oranda s. </li><li> 4 ° C&#39;de 2 saat süre ile 30 V 1x ticari transfer tampon maddesi içinde PVDF membrana transfer proteinleri. </li><li> % 5 blok membran bir karıştırıcıda 40 dakika boyunca oda sıcaklığında PBST süt (% 0.1 Tween 20) yağsız. </li><li> gece boyunca 4 ° C&#39;de PBST (% 0.1): Primer antikor ile membran (1000 de 1 seyreltilmiş) inkübe edin. </li><li> bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında PBST (% 0.1) ile 3 x 10 dakika yıkanır. </li><li> 1 saat boyunca oda sıcaklığında PBST (% 0.1): (5.000 iki 1&#39;de seyreltilmiş) yaban turpu peroksidaz (HRP) ile membran inkübe anti-fare ya da anti-tavşan sekonder antikor ile konjüge edilmiş. </li><li> bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında PBST (% 0.1) ile 3 x 10 dakika yıkanır. </li><li> Cm2 zar başına 0.2 mi zenginleştirilmiş kimyasal aydınlatma (ECL) substrat karışımı kullanarak, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. kırmızı ışık hariç itibaren bu adımdan tüm ışık kaçının. </li><li> Sıvı atın ve bir film kaseti içinde bir X-ışını filmine maruz kalmaktadır. Bir otomatik film pr kullanarak filmi geliştirmekocessing makinesi. </li></ol> 2. İmmünositokimya ve Proximity ligasyon Testi <ol><li> Tohum 0.4 ml DMEM içinde bir 8 bölmeli poli-D-lizin kaplı slayt bölme başına 1,5 x 10 4 hücre HEK293 hücreleri,% 10 FBS ve 100 U / ml Pen-Strep ile takviye edilmiştir. </li><li> % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de 48 saat boyunca hücrelerin büyütün. </li><li> Aspire ortamı ve oda sıcaklığında 10 dakika süreyle% 4 paraformaldehid (PFA) ile hücrelerin tespit. </li><li> Aspire PFA ve odasının başına 0.5 ml PBS ile yıkama 3 x 10 dk. </li><li> Permeabilize ve 1 saat oda sıcaklığında PBS içinde% 0.5 Triton X-100 ve% 5 normal keçi serumu (NGS) blok hücreleri. </li><li> gece boyunca 4 ° C&#39;de bir çalkalayıcı üzerinde PBS içinde% 0.1 Triton X-100 ve% 5 NGS primer antikorlar ile inkübe edin. Fare monoklonal anti-NF90 antikoru ve tavşan poliklonal anti-RBM3 antikoru 1 seyreltin: PBS içinde 100 çift boyama. Negatif kontrol için, bağımsız bir şekilde, iki birincil antikor ya da ihmal ve üçüncü kontrol antikorları sayın. NOT: Ticari engelleme ve seyreltilmesi reaktifleri kullanmayın. </li><li> bölme başına 0.5 ml PBS ile 3 x 10 dakika yıkanır. </li><li> Immünsitokimya veya yakınlık ligasyon tahlil protokolleri tabi <ol><li> İmmünositokimya <ol><li> 1 ile inkübe: 500 seyreltilmiş, yeşil fluoresan boya-bağlı anti-fare ve kırmızı fluoresan boya-bağlı anti-tavşan sekonder antikor, oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı. itibaren bu aşamada ışık kaçının. </li><li> 10 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS içinde 5000: 4 &#39;, 6-diamidin-2-fenilindol (DAPI) ile karşıt çekirdekler 1 seyreltilmiştir. </li><li> bölme başına 0.5 ml PBS ile 3 x 10 dakika yıkanır. </li><li> cam slayt ve kuru gelen odaları çıkarın. slayt başına orta montaj, 250 mikronun ile monte edin. </li></ol></li><li> Yakınlık ligasyon tahlili <ol><li> yakınlık ligasyonu tahlil probları hazırlayın. Karıştır ve th lige farklı oligonükleotidler ile bağlı iki proksimite ligasyonu deney probları (anti-fare ve anti-tavşan sekonder antikor seyreltikBir 8 bölmeli slayt (cm2 başına yaklaşık 40 ul 320 ul toplam hacimde PBS içinde% 0.1 Triton X-100, 5 ile% 5 NGS): iki ligasyon çözeltisi içinde oligonükleotit), her iki 1 kaba ilaveli . 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> cam slayt odaları çıkarın ve sulandırılmış probları ekleyin. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de nemli bir inkübatörde inkübe edin. </li><li> ligasyon çözeltisi hazırlayın. 8 ligaz ul karıştırın 64 ul 5 x ligasyonu stok ve 248 ul H 2 O </li><li> slayt sıvıyı dokunun ve 1x Yıkama Tampon A 2 x 5 dakika yıkayın (takımla birlikte verilmektedir). </li><li> Ligasyon çözeltisi ilave edin ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de nemli bir inkübatörde inkübe. </li><li> amplifikasyon çözüm hazırlayın. Itibaren bu aşamada ışık kaçının 4 ul polimeraz, 64 ul 5x büyütme stok ve 252 ul H 2 O karıştırın. </li><li> slayt sıvıyı dokunun ve 1x Yıkama Tamponu A&#39;da 2 x 2 dk yıkama </li><li> amp eklelification çözeltisi ve 100 dakika için 37 ° C &#39;de karanlık bir nem inkübatöründe inkübe edin. </li><li> slayt sıvıyı dokunun ve 1x Yıkama Tamponu B 2 x 10 dakika yıkayın (takımla birlikte verilmektedir). 0.01x Yıkama Tamponu B&#39;de 1 dakika yıkayın </li><li> slayt kurutun ve slayt başına (DAPI ile) ticari bir montaj orta 250 ul monte edin. </li></ol></li></ol></li><li> 10X mercek lens ve 20X objektif lens kullanarak bir mikroskop altında floresan sinyalleri inceleyin. CCD kamera ile görüntüler elde. </li></ol>

<ol><li>Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF90+isoforms%2C+a+new+family+of+cellular+proteins+involved+in+viral+replication%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication?</a> Biochimie. 108, 20-24 (2015).</li>
<li>Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+export+of+NF90+is+required+for+interleukin-2+mRNA+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization.</a> Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).</li>
<li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NF90-NF45+complex+functions+as+a+negative+regulator+in+the+microRNA+processing+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway.</a> Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).</li>
<li>Dresios, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+stress-induced+protein+Rbm3+binds+60S+ribosomal+subunits%2C+alters+microRNA+levels%2C+and+enhances+global+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).</li>
<li>Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+expression+of+mouse+Rbm3%2C+a+cold-shock+protein%2C+in+Sertoli+cells+of+cryptorchid+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis.</a> Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).</li>
<li>Wellmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-regulated+expression+of+the+RNA-binding+proteins+RBM3+and+CIRP+by+a+HIF-1-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).</li>
<li>Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-inducible+RBM3+inhibits+PERK+phosphorylation+through+cooperation+with+NF90+to+protect+cells+from+endoplasmic+reticulum+stress%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress.</a> FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).</li>
<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-immunoprecipitation+of+the+Mouse+Mx1+Protein+with+the+Influenza+A+Virus+Nucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).</li>
<li>Jarvius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+phosphorylated+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta+using+a+generalized+proximity+ligation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method.</a> Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein-protein+interactions+in+cross-talk+pathways+reveals+CRKL+protein+as+a+novel+prognostic+marker+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Her iki yöntem için çeşitli faydalar yanı sıra eksiklikler vardır. nispeten yeni bir teknik olarak, yakınlık ligasyon tahlili açık bir avantajı, tek hücre düzeyinde yerine heterojen bir hücre yığın protein-protein etkileşimlerini aydınlatmak için fizibilite olup. Yüksek büyüklükte ve (konfokal mikroskop ile) çözünürlükte Görüntüler tek floresan noktalar sayarak ölçümü için olanak sağlamaktadır. Buna karşılık, Western Blot ile ko-immünopresipitasyon tekniğinin geleneksel kombinasyonu sadece uygun bir yükleme kon...

Nükleer faktör 90 (NF90) interlökin-2 sonrası transkripsiyonu ve miRNA biogenez 1-3 düzenlenmesi viral enfeksiyona yanıt, yönetmelik dahil olmak üzere sayısız fonksiyonları ile çok izoformu proteindir. RBM3 bir RNA bağlayıcı protein, çeviri ve miRNA biyogenezine katılan ve hipotermi ve hipoksi 4-6 dahil olmak üzere çeşitli stres tarafından uyarılan edilebilir. Son zamanlarda, bir protein kompleksi 7 NF90 ve RBM3 bulundu. NF90 ve RBM3 etkileşimi katlanmamış bir protein tepki 7 protein kinaz RNA gibi endoplazmik retikulum kinaz (PERK) aktivitesini modüle etmek için gereklidir. NF90 ve RBM3 Hem çekirdekte ama sitoplazma içine küçük bir NF90 oranı ve RBM3 mekik ağırlıklı olarak bulunduğu ve PERK aktiviteyi düzenleyen, özel fonksiyonlar için birbirlerine orada örneğin bağlama vardır. Nedenle, yeni gösterebilir, hücre içi bölmeye NF90-RBM3 etkileşimleri dağılımını görselleştirmek için önemlidirİlgili bölmeye onların çeşitli rolleri. Yıllar önce, maya iki hibrid (Y2H) iki protein 8 arasındaki etkileşimi saptamak için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, erimiş proteinleri yapay bir yapı için, yanlış pozitif sonuçlar, bu yöntemin uygulanmasını sınırlamıştır. Uzun bir süre, ko-immünopresipitasyon özellikle endojen koşullarda 9, protein-protein etkileşimleri analiz etmek ana tekniktir. Süper hassasiyet ve kesinlik arzu edildiğinde kütle spektrometresi kullanılır ise birlikte imüno-çökeltilmiştir protein kompleksi analiz etmek için, Batı benek, en uygun bir tekniktir. Son yıllarda, proksimite ligasyonu deney yerinde 10,11 hem hücre ve dokularda protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için yeni bir yöntem olarak geliştirilmiştir. Burada, NF9 yakalayan en popüler ko-immünopresipitasyon yöntemi ve nispeten yeni yakınlık ligasyonu tahlil yöntemi karşılaştırıldısub-hücresel fraksiyonlarında, 0 RBM3 etkileşimi. Biz de avantajları ve her iki tekniğin sınırlamaları tartışılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Kartalı' s Orta (DMEM)</td> <td>Sigma</td><td>D6429</td><td>Yüksek glikoz 4,500 mg / L</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (PenStrep)</td> <td>BioConcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>NE-PER Nükleer ve Sitoplazmik Ekstraksiyon Reaktifleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78833</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Carl Roth</td><td>6908.3</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>DRBP76 (NF90 / NF110) antikoru</td><td>BD Transdüksiyon Laboratuvarları</td><td>612154</td><td>WB için 1: 1.000 ve ICC / PLA için 1: 100</td></tr><tr><td>kullanır RBM3 antikoru</td><td>ProteinTech</td><td>14363-1-AP</td>, <td>WB için 1: 1.000 ve ICC / PLA için 1: 100 kullanır</td></tr><tr><td>Lamin A / C antikoru</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>#2032</td><td>WB için 1:1,000 kullanın&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-GAPDH antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab8245</td>, <td>WB için 1: 1.000 kullanır;</td></tr><tr><td>normal tavşan IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2027</td><td></td></tr><tr><td>anti-tavşan IgG, HRP'ye bağlı ikincil antikor</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td> <td># 7074</td><td>WB için 1: 5.000 kullanın;</td></tr><tr><td>anti-fare HRP ikincil antikoru</td><td>Carl Roth</td><td>4759.1</td><td>WB için 1: 5.000 kullanın.</td></tr><tr><td>Berraklık Western ECL Kurutma Yüzeyi</td><td>Bio-Rad</td><td>#1705060</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex %4-12 Bis-Tris Jel</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Numune Tamponu (4x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Çalıştırma Tamponu (20x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Aktarım Tamponu (20x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hypond P 0.2 PVDF membran</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lizin 8 Kuyu Kültür Slaytı</td><td>Corning BioCoat</td><td>354632</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td> <td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Normal keçi serumu (NGS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG (H + L Antikoru), Alexa Fluor 488 eşlenik</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan IgG (H + L Antikoru), Alexa Fluor 568 eşlenik</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>4 & prime ;, 6-Diamidin-2-fenilindol (DAPI)</td> <td>Sigma</td><td>D9542</td> Duolink PLA probu Anti-fare PLUS Sigma DUO92001 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duolink PLA&nbsp; prob Anti-tavşan EKSİ Sigma</td><td></td><td>DUO92005</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Algılama Reaktifleri Kırmızı</td><td>Sigma</td><td>DUO92008</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Yıkama Tamponları Floresan</td><td>Sigma</td><td>DUO82049</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Sigma ile Duolink Montaj Ortamı</td><td></td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>AX-70</td><td></td></tr><tr><td>CCD kamera</td><td>SPOT</td><td>Insight 2MP Firewire</td><td></td></tr><tr><td>X-ray filmi</td><td>Fujifilm</td><td>Super RX</td><td></td></tr><tr><td>Film işleme makinesi</td><td>Fujifilm</td><td>FPM-100A</td><td></td></tr></tbody></table>

co-immunoprecipitation tarafından nükleer ve sitoplazmik kesirler protein-protein etkileşim görselleştirme ve<em&gt; in situ</em&gt; proximity ligasyon testi

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Protein-protein etkileşimleri binlerce hücresel süreçte yer alır ve farklı mekansal bağlamda gerçekleşir. Geleneksel olarak, ko-immünopresipitasyon, protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için popüler bir tekniktir. Sonraki Western blot analizi, ko-immünopresipite proteinleri görselleştirmek için en yaygın yöntemdir. Son zamanlarda, yakınlık ligasyon testi, protein-protein etkileşimlerini yerinde görselleştirmek için güçlü bir araç haline gelmiştir ve bu yöntemle protein-protein etkileşimlerini ölçme imkanı sağlar. Konvansiyonel immünositokimyaya benzer şekilde, yakınlık ligasyonu test tekniği de antijenlere primer antikorların erişilebilirliğine dayanır, ancak bunun aksine, yakınlık ligasyon testi, yuvarlanan daire PCR'yi içeren benzersiz bir teknikle protein-protein etkileşimlerini tespit ederken, konvansiyonel immünositokimya sadece proteinlerin birlikte lokalizasyonunu gösterir.
Nükleer faktör 90 (NF90) ve RNA bağlayıcı motif protein 3 (RBM3) daha önce etkileşen ortaklar olarak gösterilmiştir. Ağırlıklı olarak çekirdekte lokalize olurlar, ancak aynı zamanda sitoplazmaya göç ederler ve sitoplazmik bölmedeki sinyal yollarını düzenlerler. Burada, hem çekirdekte hem de sitoplazmada NF90-RBM3 etkileşimini ko-immünopresipitasyon ve yakınlık ligasyon testi ile karşılaştırdık. Ek olarak, bu iki tekniğin protein-protein etkileşimlerinin mekansal dağılım ve protein-protein etkileşimlerinin özellikleri açısından görselleştirilmesindeki avantajlarını ve sınırlamalarını tartıştık.

Şekil 1, NF90 ve RBM3 hem çekirdek proteinleridir ve sadece küçük bir fraksiyonu sitoplazmada mevcut olduğunu ortaya koymaktadır. Özellikle, RBM3 için pozitif boyandı üç farklı bant vardır. sadece 20 kDa altında küçük RBM3 doğru boyutunu yansıtır (RBM3 tahmin molekül ağırlığı 17 kDa olan). iki bant kökeni araştırılması devam etmektedir. yem protein olarak RBM3 ile ko-immünopresipitasyon deneyleri NF90-RBM3 etkileşimleri çekirdek ve sitoplazmada bir azınlık ağırlıklı mevc...

Protein-protein etkileşimleri bir hücrenin hem çekirdeğinde hem de sitoplazmasında meydana gelebilir. Bu etkileşimleri araştırmak için geleneksel ko-immünopresipitasyon ve modern yakınlık ligasyon testi uygulanır. Bu çalışmada, NF90-RBM3 etkileşimlerinin çekirdek ve sitoplazmadaki dağılımını görselleştirmek için bu iki yöntemi karşılaştırıyoruz.

Co-immunoprecipitation tarafından Nükleer ve Sitoplazmik Kesirler Protein-protein Etkileşim görselleştirme ve<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Bu deneyin genel amacı, farklı hücresel kompartmanlardaki protein-protein etkileşimlerini görselleştirmede ko-immünopresipitasyon (co-ip) ve yakınlık ligasyon analizi (pla) yöntemlerinin avantaj ve dezavantajlarını karşılaştırmaktır. Burada sunulan iki farklı yöntemin karşılaştırması, bir hücrenin çekirdeğindeki ve sitoplazmasındaki protein-protein etkileşimlerinin dağılım modellerini araştıran bilim insanlarının, kendi özel amaçları için hangi yöntemin daha uygun olduğuna karar vermelerine yardımcı olabilir. Co-ip'in temel avantajı, otantik protein-protein etkileşimlerini tespit edebilmesidir.Buna karşılık, PLA'nın avantajı, protein-protein etkileşimlerini tek hücre düzeyinde hızlı bir şekilde analiz edebilmektir. Metin protokolüne uygun olarak Hex293 hücreleri büyütülüp hasat edildikten sonra, 3 × 10⁶ hücreye 300 µL soğuk sitoplazmik ekstraksiyon solüsyonu ekleyin ve hücreleri en yüksek hızda 15 saniye boyunca vorteksleyin. Ekstraktı buz üzerinde 30 dakika inkübe edin ve inkübasyon sırasında her 10 dakikada bir örneği beş saniye boyunca vorteksleyin.Ardından 16.5 µL soğuk sitoplazmik ekstraksiyon solüsyonu ekleyin, beş saniye boyunca vorteksleyin ve örneği buz üzerinde beş dakika inkübe edin. Ekstraktı beş saniye vorteksleyin ve örneği 16,000 × g'de ve 4 °C'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatantı önceden soğutulmuş yeni bir tüpe aktarın ve kullanıma kadar buz üzerinde tutun, ardından çözünmeyen pelletleri pipetleme yoluyla üç kez yıkamak için 1 mL soğuk PBS kullanın ve her yıkamadan sonra PBS'yi uzaklaştırın.Ardından, 150 µL soğuk nükleer ekstraksiyon çözeltisi ekleyin, 15 saniye boyunca vorteksleyin ve buz üzerinde bir saat inkübe edin. İnkübasyon sırasında her 10 dakikada bir örneği 15 saniye boyunca vorteksleyin ve çözeltiyi 10 kez pipetlemek için 200 µL'lik uç kullanın. Tüpü 15 saniye boyunca vorteksleyin ve örneği 4 °C'de 16,000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin, ardından nükleer ekstrakt içeren süpernatanı önceden soğutulmuş yeni bir tüpe aktarın ve kullanıma kadar buz üzerinde tutun.Girdi olarak nükleer ve sitoplazmik ekstraktların hacminin %10'unu alın, ardından kalan ekstraktlara son hacim bir mililitre olacak şekilde soğuk PBS ekleyin. Kullanıma kadar buz üzerinde tutun. Gerekiyorsa protein g konjuge manyetik boncukları ön temizleme işleminden geçirdikten sonra, 200 mikrolitre PBST içerisinde 40 mikrolitre protein g konjuge manyetik boncukları ile dört mikrogram hızlı poliklonal anti-RBM3 antikorunu veya negatif kontrol olarak hızlı IGG'yi birleştirin.Bir rotatör üzerinde oda sıcaklığına gelene kadar 40 dakika inkübe edin. Tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin, ardından süpernatanı uzaklaştırıp atın. Daha sonra boncukları 200 µL PBST ile bir kez yıkayın.Boncukların üzerine bir mililitre seyreltilmiş lizat ekleyin ve 4 °C'de bir rotatör üzerinde gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, tüpleri manyetik rafa yerleştirin ve süpernatantı aspire edin. Boncukların üzerine 0.5 mililitre PBST ekleyin ve 4 °C'de, 20 rpm sabit hızda 10 dakika boyunca bir rotatör üzerinde üç kez yıkayın.Boncuklara 40 µL örnek tamponu ekleyerek proteini elüe edin, ardından örneği 70 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın. Boncuklar santrifüj edildikten sonra sıvıyı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın. İmmünositokimyasal analiz gerçekleştirmek için, sekiz odacıklı polilizine kaplı bir lamdaki her bir odacığa 1,5 × 10⁴ HEK293 hücresi ekin.%10 FPS ve mililitre başına 100 ünite penstrep ile desteklenmiş 0,4 mililitre DMEM içerisinde. Hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksit altında 48 saat inkübe edin, ardından ortamı aspire edin ve hücreleri oda sıcaklığında, laminer akışlı kabinde 10 dakika boyunca %4 PFA kullanarak tespit edin. Sonra PFA'yı aspire edin ve hücreleri üç kez yıkamak için her bölme başına 0,5 mililitre PBS kullanın.Hücreleri permeabilize etmek ve bloklamak için %0,5 tritonX100 içeren %5 NGS ve PBS ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Ardından, anti NF90 monoklonal ve anti RBM3 poliklonal primer antikorları 1:100 oranında seyrelttikten sonra, primer antikorları kuyucuklara ekleyin ve çalkalayıcıda dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, odacıkları üç kez 10'ar dakika boyunca 0,5 mililitre PBS ile yıkayın.İmmünositokimyasal analiz gerçekleştirmek için, hücrelere 1/500 dilüsyonda yeşil floresan boyalı anti-mouse ve kırmızı floresan boyalı anti-rabbit antikorlar ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Çekirdekleri karşıt boyamak için 1/5.000 dilüsyonda DAPHE NBPS ekleyip oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin, ardından örnekleri daha önce olduğu gibi PBS ile yıkayın. Hazneleri cam lamdan çıkarıp kurutun ve ardından lam başına 250 µL kapatma medyumu kullanarak örnekleri kapatın.Tüp yakınlık ligasyon deneyi problarını hazırlamak için, hücrelerin ve primer antikorların inkübasyonunun ardından ve az önce gösterildiği gibi yıkama işlemi yapıldıktan sonra, önceden hazırlanmış probları 0,1% tritonx100, 5% NGS ve PBS içeren, tek bir sekiz odacıklı lam için toplam 320 µL hacmindeki çözeltide 1:5 oranında seyreltin. Çözeltiyi oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. Odacıkları cam yüzeyden ayırın ve seyreltilmiş probları ekleyin, ardından odacıkları 37 °C sıcaklıktaki nemlendirme inkübatöründe bir saat boyunca inkübe edin.Sekiz mikrolitre ligaz, 64 mikrolitre 5x ligasyon stoğu ve 248 mikrolitre su karıştırarak bir ligasyon çözeltisi hazırlayın. Lam üzerindeki sıvıyı boşaltın ve örnekleri iki kez beşer dakika boyunca onex yıkama tamponu A ile yıkayın. Ligasyon çözeltisini örneklere ekleyin ve örnekleri bir nemlendirme inkübatöründe 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.Dört µL polimeraz, 64 µL 5x amplifikasyon stoğu ve 252 µL suyu karıştırarak amplifikasyon solüsyonunu hazırlayın ve tüpü ışıktan korumak için alüminyum folyo ile sarın. Ardından, lam üzerindeki sıvıyı boşaltın ve örnekleri ikişer dakika süreyle iki kez yıkamak için 1x yıkama tamponu A kullanın. Amplifikasyon solüsyonunu örneklere ekleyin ve karanlık, nemli bir inkübatörde 37 °C'de 100 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, sıvıyı daha önce olduğu gibi boşalttıktan sonra, örnekleri önce yıkama tamponu B ile 10'ar dakikadan iki kez yıkayın ve ardından 0.1 x yıkama tamponu B ile bir kez yıkayın. Son olarak, lamı kurutun ve örnekleri DAPHE içeren 250 µL ticari montaj medyumu ile sabitleyin, floresans özelliğini mikroskop altında inceleyin ve CCD kamera ile görüntüler elde edin. Yem protein olarak RBM3 kullanılan ko-immünopresipitasyon deneyleri, NF90-RBM3 etkileşimlerinin ağırlıklı olarak çekirdekte bulunduğunu ve küçük bir kısmının sitoplazmada yer aldığını ortaya koymuştur. Bu immunofloresans deneyinde, hem NF90 hem de RBM3 çekirdekte görülmektedir.Her iki protein C2'de sitoplazmada da bulunur ve her iki protein her bir kompartimanda mükemmel kolokalizasyon gösterir. Bu görüntülerde görüldüğü üzere, yakınlık ligasyon analizi, hücrelerin çoğunda etkileşimlerin çoğunun çekirdekte olduğu ve konvansiyonel immünositokimyaya çok benzer olan NF90-RBM3 etkileşim paternini ortaya çıkarmıştır. Hücrelerin sadece küçük bir kısmı, NF90-RBM3 etkileşimlerinin ağırlıklı olarak sitoplazmik dağılımını göstermiştir.Bu prosedür uygulanırken, PLA'nın daha kolay olmasına rağmen protein-protein etkileşimlerini doğrudan yansıtmadığını hatırlamak önemlidir. Bunun yerine, co-ip yönlendirilmiş etkileşimi tespit eder. Ayrıca, primer antikorun özgüllüğü sonucun kalitesini belirler.Bu videoyu izledikten sonra, kendi deneysel amacınıza göre farklı hücresel kompartmanlardaki protein-protein etkileşimlerini incelemek için uygun yöntemi nasıl seçeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

visualization-protein-protein-interaction-nuclear-cytoplasmic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu protokol bir FRET tabanlı yakınlık tahlil kullanarak nasıl görüntü protein-protein etkileşimleri açıklar.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Bu video, nematod hücrelerinde in situ protein-protein etkileşimlerini incelemek için yakınlık ligasyon testini açıklar. İlgilenilen proteinlerin yakınlığı, ikincil bir antikora bağlı bir PLA probu yardımıyla dairesel DNA şablonunu oluşturur. Prob, hücrelerde protein-protein etkileşimlerinin lokalizasyonunu sağlayan uzun tek sarmallı bir DNA ve ardından dedektör probunun hibridizasyonunu üreten amplifikasyon çözeltisi kullanılarak daha da büyütülür.

Yerinde Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Yakınlık Ligasyon Testi

Biz, LC-MS / MS sistemi kullanılarak coregulatory etkileşimi proteinlerinin saflaştırılması için bir yöntem oluşturmuştur.

LC-MS / MS Analizi Nükleer kofaktör ile etkileşimde proteinlerin yüksek verimli belirlenmesi için bir protein Hazırlama Yöntemi

Burada, genotoksik strese maruz kalan süspansiyon hücre kültürlerinde ATM ve p53 arasındaki doğrudan protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve görselleştirmek için in situ Proximity Ligation Assay (PLA) 'nın nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

Burada, kütle spektrometresi için numunelerin hazırlanması için bir on-membran sindirim tekniği için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, protein-protein etkileşimlerinin uygun analizini kolaylaştırır.

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Kantitatif Multipleks İmmünopantü (QMI), iki örnek arasındaki hedeflenen protein-protein etkileşimlerinin bolluğundaki farklılıkların hassas tespiti için akış sitometrisini kullanır. QMI biyomalzeme küçük bir miktar kullanılarak yapılabilir, genetiği değiştirilmiş etiketleri gerektirmez, ve daha önce tanımlanmış herhangi bir protein etkileşim ağı için adapte edilebilir.

Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi

Cognate J-etki proteinleri hsp70 şaperon ile protein katlama bozulması arasında değişen biyolojik süreçler sayısız yardımcı olmak için işbirliği. Burada, bakteriyel, maya ve insan hücrelerinde geçici olarak oluşan bu şaperon makinelerinin izlenmesine olanak sağlayan bir in situ yakınlık ligasyon tetkikini tanımlıyoruz.

Bakteri, Maya ve İnsan Hücrelerinde Geçici Olarak Oluşan Moleküler Şaperon Meclislerinin Yerinde İzlenmesinde

Açıklanan ilgi ve etiket-free kütle spektrometresi belirli bir protein in immünafinite zenginleştirme kullanarak bir nükleer hücre altı fraksiyonu protein etkileşim ortakları tanımlamak için bir proteomik iş akışıdır. İş akışı hücre altı fraksiyonu, immünoprepitasyon, filtre destekli numune hazırlama, çevrimdışı temizleme, kütle spektrometresi ve aşağı akım biyoinformatik boru hattını içerir.

Büyük Ölçekli Nükleer Etkileşimom Profilleme için Etiketsiz İmmünoprekütle Spektrometresi İş Akışı

Bu protokol, C. elegans germline yerinde protein-protein etkileşimleri için prob yakınlık ligasyon test kullanımını göstermektedir.

Yakınlık Ligasyon Tayini kullanılarak C. elegans Germline Ribonükleoprotein Kompleksi Montaj Yerinde Algılama

Membran temas bölgelerini (MCS'ler) incelemek için yeni yaklaşımlara duyulan ihtiyaç, bu hücresel yapıları ve bileşenlerini incelemeye olan ilginin artması nedeniyle artmıştır. Burada, MCS'lerde bulunan organel içi ve organeller arası protein komplekslerini tanımlamak ve ölçmek için önceden mevcut olan mikroskopi teknolojilerini entegre eden bir protokol sunuyoruz.

ER-Mitokondri Temas Bölgelerinde Endojen Organel İçi Protein Etkileşimlerinin Yakınlık Ligasyon Testleri ile Görselleştirilmesi ve Miktarının Belirlenmesi

Protein-protein etkileşimleri, hedef proteinlerin işlevini aydınlatmak için önemlidir ve ko-immünopresipitasyon (co-IP), PPI'leri kolayca doğrulayabilir. Epitop etiketli bir proteini kodlayan bir plazmiti HEK-293 hücrelerine geçici olarak transfekte ettik ve iki hedef proteinin bağlanmasını kolayca doğrulamak için bir immünopresipitasyon yöntemi geliştirdik.

Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Anti-Epitop Etiket Afinite Jeli ile İmmünopresipitasyon

Öğrenin, nükleer ve sitoplazmik kesirlerdeki protein-protein etkileşimlerini görselleştirmek için co-immunoprecipitation ve proximity ligation assay yöntemlerini nasıl karşılaştıracağınızı. Bu teknikler NF90-RBM3 etkileşimlerinin dağılımını incelemek için kullanılır.

Co-immunoprecipitation tarafından Nükleer ve Sitoplazmik Kesirler Protein-protein Etkileşim görselleştirme ve In Situ Proximity ligasyon Testi (Video) | JoVE Journal

Co-immunoprecipitation tarafından Nükleer ve Sitoplazmik Kesirler Protein-protein Etkileşim görselleştirme ve

Daha fazla video keşfet