Co-immunoprecipitation tarafından Nükleer ve Sitoplazmik Kesirler Protein-protein Etkileşim görselleştirme ve In Situ Proximity ligasyon Testi

Bu deneyin genel amacı, farklı hücresel bölmelerdeki protein protein etkileşimlerini görselleştirmede ko-immünopresipitasyon veya co-ip ve yakınlık ligasyon testinin veya pla'nın avantajlarını ve dezavantajlarını karşılaştırmaktır. Burada sunulan iki farklı yöntemin karşılaştırılması, bilim adamlarının, bir hücrenin çekirdeğindeki ve sitoplazmasındaki protein protein etkileşimlerinin dağılım modellerini araştırırken hangisinin kendi özel amaçları için daha uygun olduğuna karar vermelerine yardımcı olabilir. Co-ip'in temel avantajı, otantik protein protein etkileşimlerini tespit etmektir.

Buna karşılık, pla'nın yararı, enstitü protein protein etkileşimlerini tek hücre düzeyinde hızlı bir şekilde analiz etmektir. Metin protokolüne göre hex293 hücreleri büyüttükten ve hasat ettikten sonra, 3 kez 10'a 6. hücrelere kadar 300 mikrolitre soğuk sitoplazmik ekstraksiyon çözeltisi ekleyin ve hücreleri 15 saniye boyunca en yüksek hızda girdaplayın. Ekstraktı buz üzerinde 30 dakika inkübe edin ve inkübasyon sırasında her 10 dakikada bir, numuneyi beş saniye boyunca girdaplayın.

Daha sonra 16.5 mikrolitre soğuk sitoplazmik ekstraksiyon çözeltisi ekleyin, beş saniye girdap yapın ve numuneyi beş dakika buz üzerinde inkübe edin. Ekstraktı beş saniye boyunca vorteksleyin ve numuneyi beş dakika boyunca 16.000 x g ve 4 santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı önceden soğutulmuş yeni bir tüpe aktarın ve kullanana kadar buz üzerinde tutun, ardından çözünmeyen peletleri üç kez yıkamak için bir mililitre soğuk PBS kullanın, her yıkamadan sonra PBS'yi yukarı ve aşağı pipetleyerek ve çıkarın.

Daha sonra, 150 mikrolitre soğuk nükleer ekstraksiyon çözeltisi ekleyin, 15 saniye girdap yapın ve bir saat buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyon sırasında her 10 dakikada bir, numuneyi 15 saniye boyunca vorteksleyin ve solüsyonu 10 kez pipetlemek için 200 mikrolitrelik bir uç kullanın. Tüpü 15 saniye boyunca vorteksleyin ve numuneyi 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede 16.000 x g'da santrifüjleyin, ardından nükleer ekstraktı içeren süpernatanı yeni bir önceden soğutulmuş tüpe aktarın ve kullanılana kadar buz üzerinde tutun.

Girdi olarak nükleer ve sitoplazmik ekstraktların hacminin her birinin %10'unu çıkarın, ardından kalan ekstraktlara bir mililitrelik son hacme kadar soğuk PBS ekleyin. Kullanana kadar buz üzerinde tutun. Gerekirse protein g konjuge manyetik boncukları önceden temizledikten sonra, 40 mikrolitre protein g konjuge manyetik boncukları dört mikrogram hızlı poliklonal anti-RBM3 antikoru veya 200 mikrolitre PBST'de negatif kontrol olarak hızlı IGG ile birleştirin.

Bir döndürücü üzerinde 40 dakika oda sıcaklığına kadar inkübe edin. Tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin, ardından süpernatenti çıkarın ve atın. Daha sonra 200 mikrolitre PBST ile boncukları bir kez yıkayın.

Boncuklara bir mililitre seyreltilmiş lisat ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede bir döndürücü üzerinde inkübe edin. Ertesi gün, tüpleri manyetik rafa yerleştirin ve süpernatenti aspire edin. Boncuklara 0,5 mililitre PBST ekleyin ve bunları 10 dakika boyunca 20 rpm'lik sabit bir hızla dört santigrat derecede bir döndürücü üzerinde üç kez yıkayın.

40 mikrolitre numune tamponu ekleyerek proteini boncuklardan çıkarın, ardından numuneyi 70 santigrat derecede 10 dakika ısıtın. Boncukları döndürdükten sonra, sıvıyı 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. İmmünositik kimyayı gerçekleştirmek için, HEK293 hücrelerini, sekiz odacıklı polidelizin kaplı bir slaytta oda başına 1.5 kez 10 ila dört hücreye tohumlayın.

% 10 FPS ve mililitre penstetrep başına 100 birim ile desteklenen 0.4 mililitre DMEM'de. Hücreleri 48 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin, daha sonra ortamı aspire edin ve hücreleri bir laminer akış başlığında 10 dakika oda sıcaklığında sabitlemek için% 4 PFA kullanın. Daha sonra PFA'yı aspire edin ve hücreleri üç kez yıkamak için oda başına 0,5 mililitre PBS kullanın.

Hücreleri geçirgen hale getirmek ve bloke etmek için %5 NGS ve PBS ile %0,5 tritonX100 ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra, anti NF90 monoklonal ve anti RBM3 poliklonal birincil antikorları bir ila 100 seyrelttikten sonra, oyuklara birincil antikorlar ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Ertesi gün, hazneleri her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkamak için 0,5 mililitre PBS kullanın.

İmmünositik kimyayı gerçekleştirmek için, hücrelere bir ila 500 seyreltme yeşil floresan boya bağlı antifare ve kırmızı floresan boya bağlı antitavşan antikorları ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Çekirdekleri lekelemek için bir ila 5.000 seyreltme DAPHE NBPS ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin, ardından numuneleri daha önce olduğu gibi PBS ile yıkayın. Hazneleri cam sürgüden çıkarın ve kurutun, Kullanmadan önce slayt başına 250 mikrolitre montaj ortamı monte etmek için.

Tüp yakınlık ligasyon tahlil problarını hazırlamak için, hücreleri ve birincil antikorları inkübe ettikten ve az önce gösterildiği gibi yıkadıktan sonra, önceden hazırlanmış probları %0.1 tritonx100 ve %5 NGS ve PBS'de bir ila 5 oranında seyreltin, sekiz odacıklı bir slayt için toplam 320 mikorlitre hacimde. Çözeltiyi oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Hazneleri cam taraftan çıkarın ve seyreltilmiş probları ekleyin, ardından hazneleri bir saat boyunca 37 santigrat derecede bir nem inkübatörde inkübe edin.

Sekiz mikrolitre ligaz, 64 mikrolitre 5x ligasyon stoğu ve 248 mikrolitre suyu karıştırarak bir ligasyon solüsyonu hazırlayın. Slayttaki sıvıyı hafifçe vurun ve numuneleri her biri beş dakika boyunca iki kez yıkamak için onex yıkama tamponu A'yı kullanın. Ligasyon çözeltisini numunelere ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir nem inkübatörde inkübe edin.

Dört mikrolitre polimeraz, 64 mikrolitre 5x amplifikasyon stoğu ve 252 mikrolitre suyu karıştırarak amplifikasyon solüsyonunu hazırlayın ve tüpü ışıktan korumak için folyoya sarın. Ardından, slayttaki sıvıyı hafifçe vurun ve numuneleri her biri iki dakika boyunca iki kez yıkamak için bir x yıkama tamponu A kullanın. Amplifikasyon çözeltisini numunelere ekleyin ve 37 santigrat derecede koyu nemli bir inkübatörde 100 dakika inkübe edin.

Daha sonra sıvıyı daha önce olduğu gibi hafifçe vurduktan sonra, numuneleri 0.1 x yıkama tamponu B'de bir kez yıkamadan önce her biri 10 dakika boyunca iki kez yıkayın B yıkama tamponu.Son olarak, slaytı kurutun ve numuneleri DAPHE ile 250 mikrolitre ticari montaj ortamı ile monte edin, floresanı mikroskop altında inceleyin ve CCD kamera ile görüntüler elde edin. Yem proteini olarak RBM3 ile yapılan ko-immünopresipitasyon deneyleri, NF90-RBM3 etkileşimlerinin ağırlıklı olarak çekirdekte bulunduğunu ve bir azınlığın sitoplazmada bulunduğunu ortaya koydu. Bu immünofloresan deneyinde, NF90 ve RBM3'ün her ikisi de çekirdekte görülür.

Her iki protein de C2'deki sitoplazmada bulunur ve her iki protein de her bölmede mükemmel kolokalizasyon gösterir. Bu görüntülerde görüldüğü gibi, yakınlık ligasyon testi, hücrelerin çoğunda çekirdekteki çoğu etkileşime giren konvansiyonel immünositik kimyaya çok benzeyen NF90-RBM3 etkileşimlerinin modelini ortaya çıkardı. Hücrelerin sadece küçük bir kısmı, NF90-RBM3 etkileşimlerinin ağırlıklı olarak sitoplazmik dağılımını gösterdi.

Bu prosedürü denerken, daha uygun olmasına rağmen, PLA'nın protein protein etkileşimlerini doğrudan yansıtmadığını hatırlamak önemlidir. Bunun yerine, co-ip yönlendirilmiş etkileşimi algılar. Ek olarak, birincil antikorun özgüllüğü sonucun kalitesini belirler.

Bu videoyu izledikten sonra, kendi deneysel amacınıza göre farklı hücresel bölmelerdeki protein protein etkileşimlerini incelemek için uygun bir yöntemin nasıl seçileceğini iyi anlamış olmalısınız.