Sıçan gözlerinin içine insan retina Pigment epitel hücrelerinin Trans-scleral Subretinal nakli için rafine bir protokol geliştirilmesi

Bu videonun genel amacı, insan retina pigment epitelini veya RPE hücrelerini kemirgenlerin gözlerinin subretinal boşluğuna minimum retina hasarı riskiyle iletmek için tekrarlanabilir bir transskleral subretinal enjeksiyon tekniğini tanıtmaktır. Bu, altta yatan sklerayı ortaya çıkarmak için önce temporal konjonktiva posteriorunda limbusa arkasında küçük bir kesi yapılarak gerçekleştirilir. Daha sonra, bir pilot delik oluşturmak için iğneyi 500 mikron veya ucun yaklaşık yarısı yukarı bakacak şekilde dokuya sokarak sklera çekirdek kompleksine nüfuz etmek için eğimli 31 gauge bir insülin iğnesi kullanılır.

Daha sonra, bir şırıngaya bağlı eğimli 33 gauge enjeksiyon iğnesi pilot deliğe yönlendirilir ve belirli bir açı ve derinlikte yerleştirilir, iğne geri çekildikten sonra enjeksiyon deliği kendi kendine kapanır ve dikiş veya doku yapıştırıcısı gerekmez. Dejeneratif retinopatiler, farklı retina hücre tiplerini içeren geniş bir hastalık spektrumundan oluşur. Dünya çapında en yaygın hastalık olan yaşa bağlı makula dejenerasyonu veya AMD, yaşlılar arasında görülür ve kalıcı körlüğe yol açar.

AMD'de meydana gelen patolojik değişiklikler, retina pigmentli epitel hücrelerinin veya RPE'nin ilk dejenerasyonunu içerir. RPE kaybı retinal flororeseptör disfonksiyonuna veya ölüme yol açar. Erken evre YBMD için mevcut farmakolojik tedaviler, ilerlemeyi yavaşlatmak veya semptomları hafifletmekle sınırlıdır.

Bu, retinanın sınırlı bir rejeneratif potansiyeli ile birleştiğinde, görmeyi geri kazanmak için etkili bir tedavi olmadığı anlamına gelir. Nöral Kök Hücre Enstitüsü yakın zamanda RPE hücre popülasyonunda bir yetişkin kök hücre popülasyonu tanımladı. Bu hücreler kök hücre replasman tedavisi için bir kaynak olarak kullanılabilir.

Şu anda enstitümüz, bir RPE dejeneratif sıçan hayvan modelinde RPE kök hücre nakli tedavisinin etkinliğini ve güvenliğini araştırmak için klinik öncesi çalışmalar yürütmektedir. Bu çalışmada, RPE kök hücrelerini sıçan gözlerine, retina ve RPE tabakaları arasına vermek için transskleral, subretinal bir enjeksiyon tekniği kullanıyoruz. Yöntemimiz, hücrelerin subretinal boşluğa başarılı bir şekilde iletilmesi için kolay ve güvenilir bir araçtır.

Aşağıdaki reaktiflere ve ekipmana ihtiyacınız olacak. %10'luk fenilefrinden yeni yapılmış% 1 tropikamid ve% 2.5 fenilefrin, ameliyat günü steril% 0.9 salin içinde seyreltilerek, göz bebeğini genişletmek için kullanılır. Göz yıkama, gözü durulamak ve ameliyat edilmeyen gözü nemli tutmak için kullanılır.

Ameliyat sırasında ameliyat edilmeyen sağ gözü nemli tutmak için bir göz kayganlaştırıcı kullanılır. Lokal anestezik olarak% 0.5 proparakain kullanılır. OCT taraması sırasında ameliyat edilen sol göze bir göz kayganlaştırıcı kullanılır.

Bu teknik için minimum miktarda malzeme ve ekipmana ihtiyaç vardır. Bu teknikte kullanılan ekipman ve reaktiflerin ayrıntılı bilgileri protokolde özetlenmiştir. Hücreleri enjekte etmek için 10 mikrolitrelik bir şırınga kullanılır.

Enjeksiyondan önce enjektörü monte edip etanol ile sterilize ediyoruz. Şırıngaya steril, 33 gauge eğimli bir iğne sokun ve enjektörü monte etmek için sıkıca vidalayın. Enjektörü %100 etanol, ardından %70 etanol ve ardından deiyonize damıtılmış su ile sırayla beş ila altı kez yıkayın.

Enjektör iğnesini, iğnenin ucundan 600 mikron uzakta bir konumda steril siyah bir işaretleyici kalemle işaretleyin. Enjeksiyon kullanımı için enjektörü bir mikro manipülatöre koyun. İnsan RPE hücreleri ameliyat günü hazırlanır ve buzlu su karışımında bekletilir.

Hücre süspansiyonunu nazikçe ezin ve enjektörü 1,2 mikrolitre ile yükleyin, ekstra 0,2 mikrolitre, bir mikrolitrelik enjeksiyon hacmini garanti etmek için enjeksiyon geri akışını telafi etmek için kullanılır. Mikromanipülatördeki hücre süspansiyonu ile doldurulmuş enjektörü değiştirin veya RPE hücreleri çözeltilerde kolayca batma eğiliminde olduğundan, bir asistanın dikey olarak tutmasını sağlayın. Diseksiyon mikroskobu tablasının altına ısıtma yastığı bulunan steril bir cerrahi ped yerleştirerek steril cerrahi alanı hazırlayın.

Hayvan deneklerle ilgili tüm prosedürler, Albany'deki New York Eyalet Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Hayvanı tartın ve burada gösterildiği gibi izofluran buhar dağıtım sistemini kullanarak uyuşturun. Anestezi uygulandıktan sonra fareyi cerrahi alana aktarın ve anesteziyi sürdürmek için izofluran sistemine bağlı bir burun konisine yerleştirin.

Farenin vücudunu gazlı bezle örtün ve tam anesteziyi doğrulamak için farenin ayak parmağını sıkın. Sıçanın sağ gözüne bir damla göz kayganlaştırıcı sürün, sıçanı sağ tarafına, sol gözü enjeksiyon için tavana bakacak şekilde, başı cerrahın sağ eline doğru ve cerraha doğru geri dönecek şekilde konumlandırın. Gözü kaplayan bıyıkları kesin.

Sol gözün şakak tarafı için az miktarda göz yıkama suyu damlatın ve gözü durulamak için pamuklu bir aplikatör ile burun tarafındaki fazlalığı toplayın. Enjeksiyon sonrası optik koherens tomografi veya OCT muayenesi için öğrenciyi %1 tropikamid, %2.5 fenilefrin ile her birine bir damla uygulayarak genişletin. Gözü nemli tutmak için bir damla göz yıkama uygulayın.

Göze bir damla Proparacain uygulayın ve fazlalığı bir pamuk aplikatörü ile alın. Göz kapağını açmak için gözü çevreleyen cilde dört ila altı kez nazikçe masaj yapın, böylece enjektör iğnesine kolay erişim sağlamak için göz geçici olarak ve hafifçe yuvasından dışarı çıkar. Limbusun arkasındaki konjonktivayı kavramak için kuvvetler kullanın ve oküler kaslara zarar vermeden ameliyat için daha iyi bir yer bulmak için gözü döndürün.

Bir çadır yapmak için konjonktivayı yavaşça kaldırın ve gözü nazal olarak döndürün. Daha sonra konjonktivada küçük bir açıklık açmak ve sklerayı ortaya çıkarmak için çadırın üstünü kesmek için makas kullanın. Daha sonra, limbusun yanındaki konjonktiva açıklığının kenarını kavramak için forseps kullanın ve gözü nazal olarak döndürün, böylece pupiller eksen yere göre yaklaşık 30 derecelik bir açıda olur.

Steril eğimli 31 gauge insülin iğnesi, enjeksiyon için bir pilot delik oluşturmak için bir eğim yukarı bakan ve ucun yarısı veya dokuya yaklaşık 500 mikron sokularak sklera çekirdek kompleksine nüfuz etmek için kullanılır. İnsülin iğnesini dikkatlice geri çekin ve küçük bir kan efüzyonu görülebilir. Deliği temizlemek ve gerekirse kanamayı durdurmak için bir göz mızrağı uygulanabilir.

500 mikron uzunluğundaki iğneyi tamamen doku içine sokarak ve iğne üzerindeki siyah işaretleyicinin noktası arasında 100 mikro mesafe bırakarak subretinal boşluğa ulaşmak için RPE hücre yüklü enjektör iğnesini skleranın yerel yüzeyine göre yaklaşık 10 ila 15 derecelik bir açıyla pilot deliğe yönlendirin. Asistana, uygun hacimde hücre enjekte etmek için şırınganın pistonuna basmasını söyleyin. Enjeksiyondan sonra enjektörü 25 ila 30 saniye yerinde tutun, ardından enjektörü yavaşça geri çekin.

Enjeksiyon deliği otomatik olarak kapanır ve yaygın olarak yaklaşık 0,2 mikrolitre geri akış gibi küçük bir miktar gözlenir. Enjeksiyon bölgesini steril göz yıkama ile üç kez durulayın ve fazlalığı pamuklu bir aplikatör ile toplayın. Ameliyat edilen göze bir damla kayganlaştırıcı uygulayın ve nakledilen hücrelerin yerini ve subretinal blebin boyutunu incelemek için fareyi OCT istasyonuna aktarın.

OCT yapıldıktan sonra vücut ısısını korumak için fareyi bir ısı lambası altında kurtarma kafesine geri koyun. Anesteziden çıktığından emin olmak için fareyi gözlemleyin ve herhangi bir sıkıntı belirtisi için günlük olarak izleyin. Endişeleriniz varsa derhal veterinere bildirin.

Tekniğimizi kullanarak, insan RPE hücrelerini subretinal boşluğa tutarlı ve başarılı bir şekilde ilettik. Transplantasyondan hemen sonra, enjeksiyon bölgesini ve nakledilen hücreler tarafından oluşturulan subretinal blebi gözlemlemek için OCT muayenesi yaptık. Bu, enjeksiyonların kalitesini ve retina hasarının veya kanamanın derecesini değerlendirmek için iyi bir tarama aracı olarak hizmet eder.

OCT taraması altında, enjeksiyon bölgesi etrafındaki parlak ışık yansıması ve hücre süspansiyonu ile dolu bir subretinal bleb görülebilir. Başarılı bir enjeksiyonda enjeksiyon bölgesinde veya intravitreal boşlukta kanama, göz içi sıvı kaçağı veya retina dekolmanı görülmez, bu da enjeksiyonun neden olduğu minimal travmayı gösterir. Ameliyat edilen sıçan gözleri, transplantasyondan yedi gün sonra immünohistolojik analiz için çekirdeklendirildi, sabitlendi ve kesitlere alındı.

İnsan nükleer markörü Hunu ve RPE hücre markörü OTX2, nakledilen hücreleri tespit etmek için kullanıldı. Her iki belirteçin de pozitif olması, nakledilen insan RPE hücrelerinin sıçan gözlerinin subretinal boşluğunda bulunduğunu gösterdi. Bu transskleral subretinal enjeksiyon tekniği basit ve öğrenmesi kolaydır.

Daha az ameliyat travmasına neden olur ve nöral retinayı kırmadan, enjeksiyon iğnesini göz duvarının dış katmanlarından geçirerek retinayı sağlam bırakır. Pilot iğne ve enjeksiyon iğnesinin dokuya girmesi için niceliksel damlalar ve enjeksiyon sırasında kullanılan açı, hücrelerin çok daha yüksek doğruluk ve başarı oranı ile subretinal boşluğa güvenilir bir şekilde iletilmesini sağlar. Bu enjeksiyon yöntemiyle, insan RPE kök hücresinden türetilmiş RPE hücrelerini RCS sıçanlarının subretinal boşluğuna tutarlı ve başarılı bir şekilde teslim ettik.

Bu prosedür, videoyu izleyen herkes tarafından kolayca tekrarlanabilir.