Kıkırdak Yenileme için 3D Manyetik Kök Hücre Toplama ve Biyoreaktör Olgunlaşma

Bu manyetik hücre agregasyonu ve dinamik olgunlaşma yönteminin genel amacı, mezenkimal stromal hücrelerin veya MSC'lerin in vitro kondrogenezini iyileştirmektir. Hücre yoğunlaşması olarak kondrogenez yerine kök hücrelerin manyetik agregasyonu, kıkırdak rejenerasyon sürecinin erken bir anahtar adımıdır. Kök hücreler iskelelere hapsedildikten sonra, iskeleler, hücrelerin dinamik olgunlaşmasını değerlendirmek için hücresel biyoreaktöre taşınabilir.

Kas, kardiyak veya vasküler onarım gibi diğer biyo-sistemlere önemli dinamik yöntem uygulanabilir. Ancak göreceğiniz gibi, kıkırdağın yenilenmesi için çok uygundur. Manyetik hücre tohumlamanın ve gerçek biyoreaktör kullanılarak dinamik hücre olgunlaşmasının görsel gösterimi kritik öneme sahiptir, çünkü bu iki tekniğin yalnızca metin talimatından öğrenilmesi zordur.

Agrega oluşumu için mikromıknatıs cihazını oluşturmak için, önce altı milimetre kalınlığında bir alüminyum plakadaki her üç santimetrelik deliğe 750 mikrometre çapında bir manyetik uç yerleştirin ve plakayı kalıcı bir neodimyum mıknatısın üzerine yerleştirin. İskele tohumlama için bir cihaz yapmak için, önce sert polistireni 2,4 santimetre kareler halinde kesin ve 1,6 santimetre karelik bir yüzeye eşit mesafede üç milimetre çapında, altı milimetre uzunluğunda mıknatıslar yerleştirin. Ardından cihazı kalıcı bir neodimyum mıknatısın üzerine yerleştirin.

İnsan MSC'lerini etiketlemek için, önce kök hücreleri% 90 birleşene kadar% 5 karbondioksitte% 37 santigrat derecede tam MSC büyüme ortamında kültürleyin. Hücreleri aspire edin ve daha sonra glutamin içermeyen Serum üç RPMI ortamı ile durulayın ve hücre kültürü inkübatöründe 30 dakikalık bir inkübasyon için 150 santimetre kare kültür şişesi başına 10 mililitre demir oksit nano parçacık çözeltisi ekleyin. İnkübasyonun sonunda, plazma zarına hala bağlı olan nanopartikülleri içselleştirmek için hücreleri glutamin içermeyen Serum üç RPMI ortamı ile beş dakika durulayın.

Daha sonra her bir şişedeki RPMI'yi 25 mililitre tam MSC büyüme ortamı ile değiştirin ve hücreleri gece boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Ertesi sabah, manyetik hücreleri şişe başına sekiz mililitre% 05 Tripsin-EDTA ile ayırın. Ve ayrışmış hücreleri santrifüjleme ile toplayın.

Peletleri saymak için askıya alıyoruz ve her manyetik cihazın üzerine cam tabanlı 35 milimetre hücre kültürü Petri kabı yerleştiriyoruz. Agregaları manyetik olarak oluşturmak için, her bir Petri kabına üç mililitre kondrojenik ortam ekleyin ve agrega başına 5. etiketli hücrelere 2,5 çarpı 10 ila sekiz mikrolitreden fazla olmamak üzere nazikçe biriktirin. Hücrelerin ne çok yavaş ne de çok hızlı birikmesi çok önemlidir.

Ve manyetizmaya ne çok yakın ne de çok uzak. Tüm agregalar yerleştirildiğinde, sferoidlerin 20-30 dakika boyunca rahatsız edilmeden oluşmasına izin verin. Daha sonra agregaları hücre kültürü inkübatörüne aktarın.

Aynı gün, 1.5 mililitre kondrojenik besiyeri ile 15 mililitrelik konik tüplerde 10'a 5. etiketli kök hücreleri 2,5 kez santrifüjleyerek agregalar oluşturun. İskeleleri manyetik olarak tohumlamak için, Petri kabı başına bir kurutulmuş pullulan / dekstran polisakkarit gözenekli iskele yerleştirin ve TGFbeta3 içermeyen 350 mikrolitre kondrojenik ortamda 2 kez 10 ila 6. etiketli hücreleri seyreltin. Hücreleri dikkatlice iskelelere pipetleyin ve tam hücre penetrasyonuna izin vermek için yapıları 37 santigrat derecede inkübe edin.

Beş dakika sonra, Petri kabına nazikçe üç mililitre kondrojenik ortam ekleyin ve hücrelerin iskele gözeneklerinden geçmesine izin vermek için iskeleleri dört gün boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Aynı gün, gösterildiği gibi 2 kez 10 ila 6. etiketli kök hücrelerle başka bir iskele setini tohumlayın ve pozitif kontroller olarak düzgün tohumlanmış iskeleler elde etmek için hücreleri mıknatıs olmadan inkübe edin. Beşinci günde iskelelere kondrogenez için, manyetik cihazı tüm iskelelerden çıkarın ve statik iskeleleri 25. güne kadar hücre kültürü inkübatörüne geri koyun ve ortamı haftada iki kez değiştirin.

Dinamik hücre kültürü için ayrıca beşinci günde, üreticinin talimatlarına göre silikon boruları uygun uzunlukta kesin ve boruyu, 500 mililitrelik kültür odasını, iki yönlü döndürücüleri ve kafesleri steril bir mikrobiyolojik güvenlik istasyonuna ayarlayın. Üreticinin talimatlarına uyarak, boruyu kültür odasındaki iki yönlü döndürücülere bağlayın. Ardından, iki hücreli iskeleyi her bir kafese dikkatlice aktarmak için steril bir spatula kullanın.

Tüm iskeleler transfer edildiğinde, dönme sırasında hareket etmelerini önlemek için kafesleri kapaktaki iğnelerden geçirin. Ve kültür odasını kondrojenik ortamla doldurun. Herhangi bir aletin veya iskelenin kirlenmesini önlemek için odaları hazırlarken steril antiseptik teknik kullanın.

Daha sonra kafesleri hazneye yerleştirin ve ardından hazneyi kapatın ve boruyu kondrojenik ortamla doldurmak ve hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak için peristaltik pompayı açın. Dolu hazneyi biyoreaktörün motoruna yerleştirin ve sabitleyin ve kolun ve haznenin dönüşlerini kontrol eden bilgisayarı açın. Daha sonra hem kola hem de hazneye dakikada beş dönüşlük bir dönüş hızı uygulayın ve hücreli iskelelerin sürekli beslenmesi için peristaltik pompayı dakikada 10 dönüşlük bir akış hızına ayarlayın.

İskelesiz bir 3D agrega yapısı oluşturmak için, sekizinci günde, kondrojenik ortamda temas halinde iki agregayı sekiz dublet'e yerleştirerek füzyonu başlatın. Daha sonra 11. günde iki duklağı birleştirerek dört dörtlü oluşturun ve 15. günde dört dörtlüyü kaynaştırarak son yapıyı oluşturun. Manyetik füzyon ile oluşan dokular, santrifüjleme ile elde edilen peletlere kıyasla kollajen II ekspresyonunda önemli bir artış gösterir.

Artan bir toplayıcı ifade eğilimi ile. Hücreselleştirilmiş statik iskeleler için, manyetik kuvvetler olmadan tohumlanan iskeleye kıyasla, manyetik tohumlama kullanıldığında agregant ve kollajen II ekspresyonlarında artış gözlenir. İlginç bir şekilde, manyetik tohumlama dinamik farklılaşma ile birleştirildiğinde kollajen II'nin ekspresyonu çok daha yüksektir.

Toluidin mavisi kullanılarak yapılan histolojik analiz, 16 agregatın sıralı manyetik füzyonunun, bol miktarda glukozamin glikanları birikimi sergilediğini ortaya koymaktadır. Ayrıca, manyetik olarak tohumlanmış iskelelerde, iskeleler bir biyoreaktörde farklılaştırıldığında, glukozamin glikan içeriği, statik olarak kültürlendiklerinden daha yüksektir. Bir kez ustalaştıktan sonra, manyetik hücre agregasyonu, uygun şekilde gerçekleştirilirse iki saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü denerken, agrega oluşumunu kolaylaştırmak için etiketli hücreleri mümkün olduğunca küçük bir hacimde yeniden süspanse etmeyi unutmamak önemlidir. İskelelerin manyetik tohumlanmasını takiben, yeni sentezlenmiş kondrositlerin ekspresyonunu iyileştirmek için gerçek biyoreaktör kullanılarak dinamik olgunlaşma gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden bu yana, bu teknik, rejeneratif tıp alanındaki araştırmacıların insanlarda eklem kıkırdağının yenilenmesini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, manyetik cihazların nasıl inşa edileceğini, kök hücrelerin nasıl etiketleneceğini, kök hücre agregalarını nasıl oluşturacağını, iskeleleri manyetik olarak tohumlayacağını ve gerçek bir biyoreaktörün nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. İnsan hücreleri ve dokularıyla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük giymek gibi her zaman önlem alınması gerektiğini unutmayın.