Name: Drosophila Bakım Davranışının Nicelleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Öğrenin, Drosophila bakım davranışını nicelendirmek için boya birikimini ölçen bu ölçeklenebilir yöntemi. Hızlı ve sağlam teknik, sinirbilim ve davranış genetiği araştırmalarında gen işlevlerini incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu metodoloji ve oda tasarımlarını test etme ve tesis etme konusunda erken çalışmalar yapmak için Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon ve Rose Hedreen&#39;e teşekkür etmek istiyoruz. Yazıyı okumak ve düzenlemek için Kelly Tellez ve Graham Buchan&#39;a teşekkür ediyoruz. Andrew Toeds ve Julie Simpson&#39;a öncü çalışmaları ve Brilliant Yellow Dye (Sigma) kullanımını önermek için verdikleri tavsiye ve destekleri nedeniyle teşekkür ediyoruz. Bu çalışma kısmen Mary E. Groff Cerrahi ve Tıbbi Araştırma ve Eğitim Yardım Kuruluşu Güvenliği, Bronfman Bilim Merkezi ve Hellman Fellows Programı tarafından desteklenmektedir.

1. Hazırlık <ol><li> Canlı Drosophila&#39;yı kültür şişesinden damat odasına taşımak için bir aspiratör hazırlayın. Aspiratörler, anestezinin sonraki davranışsal gözlemi etkilememesini sağlamak için bilinçli hayvanların davranış odasına transfer edilmesine izin verir. <ol><li> Makas kullanarak, 1 fitlik tek kullanımlık mikropipet ucunun ucundan en az 1 inç uzakta, 1.5 fit tigon borusu ID 1/8 kes. Kesme ucu üzerine 1 cm&#39;lik kare mesh (açıklık 0.196 inç) tutun. NOT: Çoğu 1mL ipucu, tipin paket kutusuna oturduğu, genellikle o satıra kesilen bir derecelendirme çizgisine sahiptir. </li><li> Örgü / kesme ucu üzerine taze 1 mL&#39;lik bir mikropipet ucu yerleştirin. Örgü şeklini iki ipucu arasında sıkı bir engel oluşturarak izleyin. Yeni ucun içi sinekler için bir tutma odası oluşturur. </li><li> Tek bir sineğin geçişini sağlayacak kadar genişliği açmak için yeni mikropipet ucunun ucunu kesin. KulübeYakıt deposunun deliğine yaklaşık olarak uyacaktır (yaklaşık 1.5-2 mm çapında). </li><li> İç içe geçmiş ipuçlarını tygon hortumunun ucuna tam olarak oturtun. Vakum basıncına izin vermek için sıkı bir şekilde oturmasını sağlamak için uçları borunun içine doğru itin. </li><li> Borunun diğer ucunda 200 μL&#39;lik bir mikropipet ucunun ucunu kesin ve borunun içine dar kesim ucunu yerleştirin. Bu aspiratörün &quot;ağız&quot; tarafıdır. </li></ol></li><li> Toz alikot tüpleri hazırlayın. Katranlı tartı kağıdına yaklaşık 5 mg Parlak Sarı boya tartın. Tozu 0.6 mL&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpüne boşaltın ve kapağı sıkıca kapatın. NOT: Bazı lateks eldivenleri boya geçirgen olduğu için, kısımların hazırlanması sırasında nitril eldiven kullanmanızı öneririz. </li><li> Denemedeki tüm numuneler için (her odadaki her sinek için bir tane) adım 1.2&#39;yi tekrarlayın. </li><li> Etanol (EtOH) tüpleri hazırlayın: 1 mL% 100 EtOH, 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine pipetleyin. Genotipler veya koşullar için etiket tüpleri. &lt;/ Li&gt; <li> Denemedeki tüm numuneler için (her odadaki her sinek için bir tane) adım 1.4&#39;ü tekrarlayın. Bakım testinin tamamlanması için EtOH tüplerini kapatın ve kaydedin. Negatif kontroller için sadece bir sinek olmadan sadece 1 mL EtOH olacak en az bir &quot;Boş&quot; numune de ekleyin. </li><li> Her damat haznesini, kayan üst plakayı (daha küçük deliklerle) vidalayın, ancak alt plakayı (daha büyük deliklerle birlikte) toz eklenmesi için çıkartarak bir araya getirin. </li><li> Her gerekli bakım odasını üst kısmı aşağı bakacak şekilde masanın üzerine koyun. Sinek giriş tarafı yüzü aşağı bakar. </li><li> Tüp, istenen kuyunun üstündeki haznenin yüzeyine dokunarak her bölmeye 5 mg Brilliant Yellow boya alikuotu yükleyin. Tüm tozların kafesden üst plakaya düşmesini sağlamak için odacığa masanın üzerine dokunun. </li><li> Alt plakayı, konik deliklerin daha geniş uçları dışarıya bakacak ve delikler oyukların üzerine oturmayacak şekilde her hazneye vidalayın. Botu güvende tutunPlakayı sıkıca kapatın, böylece kaymaz ve boya bırakmaz. </li><li> Odanın üstünü çevirin ve bir masaya birkaç kez vurarak toz alt plakaya dayanıncaya kadar düşer. </li><li> Küçük deliklerin, on beş kuyuya hizalanması için odanın üst plakasını &quot;açık pozisyon&quot; a kaydırın, böylelikle tek tek kuyulara sineklerin girmesine izin verin. </li></ol> 2. Uçucu tozlama ve bakım <ol><li> Bir saman kullanıyormuş gibi aspiratörün bir ucundan hafifçe emerek ağız aspiratörüne bir sinek yükleyin. Hafifçe üfleme ve ağzı hedefe yönlendirerek sinekleri yatırın. </li><li> Deney için kullanılan her oyuğa bir sinek havalandırın. Bir kuyu yüklendikten sonra üst plakayı kaydırın, böylece sinek oda içine sıkıştırabilir ve diğer kuyuları yüklerken sineğin kaçışını önlemek için odanın tamamı yüklenirken bandın üzerine iyi yerleştirilir. Birden fazla sinek bir şarkının içine asılırsaE, yalnızca bir sinek kalana kadar açıklığı bırakın. </li><li> Gerekli oyukların hepsi sineklerle doldurulduktan sonra, odanın alt plakasının yukarıya gelecek şekilde çevirin; böylece toz, sineklerin ağdan düşerek katını tutma potansiyeline sahiptir. </li><li> Vidaları sıkarak üst ve alt plakları sıkıca sabitleyin ve 4 saniye süreyle sinekleri süpürerek odayı vorteksleyin. </li><li> Boyayı diğer tarafa düştüğü şekilde odacığı (üst plaka aşağı bakacak şekilde) bir masaya iki kez vurun. Ardından, boyayı, üst bölmede tutulan sinekten uzaktaki alt bölmenin zeminde yerleştiğinden emin olmak için bölmeyi çevirin (üst plaka yukarı bakınız) ve bölmeyi iki kez vurun. </li><li> Sinirlenmeye izin verilmeyen kontrol sinekleri için, hemen protokolün 3. Adımına geçin. Testi tamamlayacak sinekler için Adım 2.7&#39;ye geçin. </li><li> Sineklerin damat olmasını sağlamak için odayı bir masa veya tezgah üzerinde, üst plaka ile yukarı doğru otuz dakika yukarıya doğru yatırın. Bölmeyi yerleştirinTüm tımar etme deneyleri (aydınlatma seviyeleri, nem ve sıcaklık) için ortamınızı sabit tutmak için bir gürültüye ve titreşimsiz yere yerleştirin. Oda sıcaklığında veya 25 ° C&#39;de nem kontrollü bir masa üstü kuluçka makinesi idealdir. </li></ol> 3. Numunelerin Hazırlanması ve Absorpsiyon Analizi <ol><li> Üst tabla ile hazne seviyesini yukarı tutarak, yavaşça taban plakasını sökün ve boyayı kaybetmemeye özenerek bölmeden çıkarın. </li><li> Odaları, sinekler anestezi edilinceye kadar düşük hava akımı ile bir Fly CO 2 pedine yerleştirin. </li><li> Bölmeden üst plakayı çıkarın. Bir bacak kapmak için dikkatli bir şekilde forseps kullanın ve her bir odadan bir toz püskürtün ve EtOH içeren 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Her biri bir sinek içeren 15 odacık için transfer süresi yaklaşık 3-5 dakikadır. Deneycilerin, deneylerin verimli bir şekilde hazırlanmasını sağlamak için, birden fazla odayla deneyleri şaşırttığında / aktarma sürelerini dikkate almaları gerekir. </li&gt; <li> Her mikro santrifüj tüpüne 1 sinek bulunduğunda kapağı kapatın ve tüpü çalkalamak için üç kez ters çevirin ve boya ve etanol çözeltisini karıştırın. </li><li> Çözünürlüktaki sinekten boyanın tamamen çıkarılmasını sağlamak için etanol ve sinekler içeren tüpleri oda sıcaklığında 5 saat inkübe edin. 5 saat sonra, sineklerden boyanın temizlenmesini sağlamak için her tüpü (2 saniye) vorteksleyin. </li><li> Plakada bulunan her numunenin yerini not edin, mümkünse, 96 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna 50 uL deneysel 1.5 mL tüp ekleyin. Numuneyi 5 kat seyreltmek için 200 μL EtOH ekleyin. Seyreltme, aşırı tozlanmış sineklerin tavan etkilerini veya büyük tımar kusurlarını önler. </li><li> Her numuneyi 397 nm&#39;de analiz etmek için bir plaka okuyucu kullanın. Alternatif olarak, plaka okuyucu yoksa, görünür spektrumdaki standart bir spektrofotometre üzerinde tek tek numuneler ve boşluklar için absorbansı ölçün. </li><li> Numuneyi plak okuyucu ile okuyun ve kaydedin ve elektronik tabloyu recorde ile kaydedinD numuneleri alıyor. </li></ol> 4. Sonuçların Nicelleştirilmesi <ol><li> Tüm örnekler için sonuçları derleyin ve her bir genotip veya durum için varyansı ölçün. NOT: 0 dakika ve 30 dakika sonra Boya birikimi, tek yönlü ANOVA ve Bonferroni düzeltme veya çoklu paralel karşılaştırmalar için diğer düzeltmeler ile istatistiksel analiz kullanılarak ayrı koşullar olarak kabul edilir. </li><li> Aşağıdaki denklemi kullanarak her genotipli / durum için tımar yüzdesi farkını hesaplayın: [(zaman 0&#39;daki boya birikim ortalama değeri - 30&#39;da boya birikim ortalama değeri] / boya biriktirme ortalama değeri 0] x 100. </li><li> Çubuk grafiklerdeki her bir genotip ve durum yüzdesini ifade edin ve genotipler ve koşulları karşılaştırın. </li></ol>

<ol><li>Szebenyi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003347269800060">Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster.</a> Animal. Behaviour. 17, (1969).</li>
<li>Corfas, G., Dudai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habituation+and+dishabituation+of+a+cleaning+reflex+in+normal+and+mutant+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila.</a> J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).</li>
<li>Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hygienic+grooming+is+induced+by+contact+chemicals+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).</li>
<li>Dawkins, R., Dawkins, M. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=GB19770205092">Hierarchical Organization and Postural Facilitation - Rules for Grooming in Flies.</a> Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).</li>
<li>Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951(2014).</li>
<li>King, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromin+Loss+of+Function+Drives+Excessive+Grooming+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22G3-Genes+Genomes+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila.</a> G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).</li>
<li>Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+Levels+of+the+Vesicular+Monoamine+Transporter+and+a+Novel+Repetitive+Behavior+in+the+Drosophila+Model+of+Fragile+X+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome.</a> Plos One. 6 (11), e27100(2011).</li>
<li>Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+bisphenol+A+on+Drosophila+melanogaster+behavior--a+new+model+for+the+studies+on+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior--a new model for the studies on neurodevelopmental disorders.</a> Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).</li>
<li>Chang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+Drosophila+vesicular+monoamine+transporter+increases+motor+activity+and+courtship+but+decreases+the+behavioral+response+to+cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine.</a> Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).</li>
<li>Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+sexually+dimorphic+behavioral+responses+to+biogenic+amines+in+decapitated+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).</li>
<li>Feng, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+functional+characterization+of+a+novel+dopamine+receptor+from+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster.</a> Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).</li>
<li>Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7953290">Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5).</a> Receptors. Receptors & Channels. 2 (2), 131-141 (1994).</li>
<li>Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAMB%2C+a+novel+dopamine+receptor+expressed+specifically+in+Drosophila+mushroom+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies.</a> Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).</li>
<li>Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Primordial+Dopamine+D1-Like+Adenylyl+Cyclase-Linked+Receptor+from+Drosophila-Melanogaster+Displaying+Poor+Affinity+for+Benzazepines%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+Letters%22%5BJournal%5D)">A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines.</a> Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).</li>
<li>Pitmon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+D1+family+dopamine+receptor%2C+DopR%2C+potentiates+hind+leg+grooming+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila.</a> Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).</li>
<li>Phillis, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mutations+affecting+neural+circuitry+required+for+grooming+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).</li>
<li>Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neural+command+circuit+for+grooming+movement+control%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A neural command circuit for grooming movement control.</a> Elife. 4, e08758(2015).</li>
<li>Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+analysis+of+single+neurons+to+correlate+synaptic+connectivity+with+grooming+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior.</a> Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Bakım testi nispeten basittir, ancak deneyanları aşağıdaki hususlara özel dikkat etmeye özen göstereceğiz. Sinekler ve boyayı taktıktan sonra üst ve alt plakalardaki vidaları sıkarak sıkı bir sızdırmazlık korumak tekrarlanabilir sonuçlar için gereklidir. Parlak Sarı boya çok ince ve gevşek derzler odanın kenarlarından boya kaybına izin verecek. Her kuyu için boya içeriğindeki düzensizlik, tımar halindeki olaylar için varyasyon ve sahte pozitif oranları artıracak düzensiz tozlama gibi bakım kantifikasyonunu kolaylıkla at...

Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) &#39;de tımarlama , birden fazla bağımsız motor programının koordinasyonunu içeren sağlam bir doğuştan gelen davranıştır 1 . Meyve, toz, mikrop ve diğer patojenler vücutlarını temizler; bu da, görme ve uçuş gibi normal fizyolojik fonksiyonları engelleyebilir veya önemli bağışıklık sorunlarına yol açabilir. Hem mekanik 2 hem de bağışıklık aktivasyonunu 3 algılar ve yanıt verirken, sinekler yeterli derecede temizleninceye ve vücudun bir başka bölümüne doğru ilerleyinceye kadar bacaklarını birlikte ya da hedeflenen bir vücut bölgesine tekrar ovarlar. Sinekler, kalıplaşmış desenler 1 , 4&#39;te büyük oranda ortaya çıkan belirgin vuruşlarda tımar etme hareketleri gerçekleştirirler. Davranışsal bir hiyerarşi, tımar sinyalleri önceliklendirildiğinde ortaya çıkar. Etkinlik devreleri ve kalıpları;hiyerarşinin en üstünde tımar programlar sonradan 5 bakımlı vücut bölgelerinden paralel sinyallerini ilk oluşur ve bastırmak fa modeli. Başa en yüksek öncelik verilir, daha sonra karın, kanatlar ve nihayetinde toraks 5 verilir . D. melanogaster&#39;ın tımar programı, sinirsel devreleri, modüle edici moleküler sinyaller ve nörotransmitterleri incelemek için ideal bir sistemdir. Örneğin, nörofibromin fonksiyonunun 6 uzlaşılması, Drosophila kırılgan X zihinsel gerilik proteininin ( dfmrl ) 7 kaybı ve bisfenol A (BPA) 8&#39;e maruz kalma, aşırı nevrofibromatozis , kırılgan X semptomlarına benzeyen aşırı bakımı ve diğer davranışlara neden olur Sendromu ve otistik spektrum bozukluklarının ve Dikkat Eksikliği Hiperaktivite Bozukluğunun (DEHB) yönlerini içerir. Bakım davranışı aynı zamanda habitua da olabilirBu motor programını davranışsal plastisite çalışmaları için ödünç alan mutant suşlar 2 boyunca farklı şekilde ölçülmüştür. Drosophila tarafından modellenebilen nörolojik olayların genişliği, sineklerin kendilerini damatlama yeteneğini ölçmek için yeni bir karşılaştırmalı yaklaşım gerektirir. Vesiküler monoamin taşıyıcılarının ve vücudun içindeki diğer dopamin ve diğer biyojenik aminlerin bol miktarda biraraya getirilmesinin, meyve sineği tımar etme davranışına aracılık ettiği gösterildi 9 , 10 . Tiramin, oktopamin bir öncüsü, aynı zamanda daha az bir oranda 7 bakım tetikler oktopamin ve dopamin, başları sinekler karşılaştırılabilir Arka bacak bakım aktivitesini uyarır. D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14&#39;te dört dopamin reseptörü tanımlanmıştır </sup&gt;. Bu protokol açıklanan tımar tahlil yöntemi kullanarak, davranış 15 tımar Tip I ailesi Dopamin Reseptör DopR (dilsiz DopR, dDA1) Arka bacak içinde bir rol belirlendi. Bakım dolaylı olarak, bir hayvanın tüm vücudu bir işaretleyici boya veya flüoresan tozu 5 , 16 ile tozladıktan sonra tamamen damat olabileceği temizlik derecesine bakarak nicelleştirilebilir. Vücutta kalan tozun geri kalanı genel davranış için göreceli bir işaretleyici olarak kullanılabilir. Damlamaya yetecek vakit verildikten sonra tozlu sinekler tımar davranışında belirgin bir eksikliği gösterebilirler. Tımar araştırmalar daha geniş olmak gibi, protokoller boyun bağ sinirler 10 üzerine farmakolojik tedaviler ekleme kafaları kesilmek gibi uygulamalar dahil olması, bakım yanıtı 2 ortaya çıkarmak için, kılların dokunsal uyarılmasıVe davranış video kaydı 15 . Tımar doğrudan gözlenmesi, kolaylıkla görsel gözlem ile ve elle belirli bakım etkinlikleri 4 süresini ve sıklığını kaydedilmesiyle incelenebilir. Bir 3B yazıcı veya lazer kesici ile yapılabilecek on beş kuyu bakım odasını tasarladık ve üretim planı tasarımları üreme için hazırdır 15 . Tasarım, sırasıyla sinek ve / veya boya yüklü, örgü ve iki ek kayar üst ve alt plaka ile birbirine uyan açıklıklar olan iki birleştirilmiş merkezi plakalar kullanıyor. Toz haline getirilmiş sinekler damat kılmaya izin verdikten sonra, onları boya çözündürmek ve bu solüsyonun emiciliğini boyanın dalga boyunda ölçmek için etanolde bırakırız. Birden fazla paralel numune için bir plaka okuyucu kullanılabilir veya tekli numuneler için tekli okunur bir spektrofotometre kullanılabilir. Bu yöntem kullanım ve harekete geçirme hatalarını en aza indirir.Daha düşük, daha düşük maliyetli bir ölçekte yapılacak tımar testleri için düşükler. Bu yöntem, elde edilen ve sıcaklığa duyarlı devre manipülasyonlar için 5 ısıtma elemanları ile daha büyük bir bakım odaları kullanımı Julie Simpson ve Andrew tohumları, öncülük metotlardan modifiye edilmiştir. Aşağıdaki protokol, vücudun her bölümünde boya birikiminin nicelleştirilmesi için alternatif yöntemlerin yanı sıra, tüm vücut bakımlarının sayısallaştırılmasını gösterir. Ayrıca, WT ve DopR mutantları arasında örnek karşılaştırma verisinin yanı sıra bakım davranışı için basit bir performans indeksinin hesaplanması için yöntemler sunuyoruz .

<table><tbody><tr><td>Yüksek Esnekliğe Sahip Tygon PVC Şeffaf Boru</td><td>McMaster-Carr</td><td>5229K54</td><td>ID 1/8", OD 1/4", ağız aspiratörleri oluşturmak için mikropipet uçları ve ağ ile birlikte kullanılır</td></tr><tr><td>Mikropipet uçları (1 mL ve 200 &# 956; L)</td> <td>Genesee Scientific</td><td>24-165, 24-150R</td><td></td></tr><tr><td>Naylon Hasır Ekran, 2 x 2.6 "</td><td>McMaster-Carr</td><td>9318T44</td><td>Bakım odası ve ağız aspiratörleri yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Dumont # 5 Forseps</td><td>Roboz Cerrahi Alet</td><td>RS-5050</td><td></td></tr><tr><td>Parlak Sarı Boya</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201375-25G</td><td>Bu ürünü</td></tr> <tr><td>kullanırken nitril eldiven kullanmanızı öneririzVortexer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td>"dokunmaya" ayarlandı</td></tr> <tr><td>Etanol</td><td>Carolina Biyolojik Tedarik</td><td>86-1282</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td>VWR International</td><td>10025-726</td><td></td></tr><tr><td>0.65 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td>VWR International</td><td>20170-293</td><td>tüpleri ardışık tahlillerle yeniden kullanılabilir</td></tr><tr><td>UV 96 kuyulu plaka</td><td>Corning</td><td></td><td></td>26014017</tr><tr><td>BioTek Synergy HTX Plaka Okuyucu</td><td>BioTek'in</td><td>ürün numarasına erişmek için kataloğu indirmeniz gerekiyor</td><td>http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview</td></tr><tr><td>Gen5 Mikroplaka Okuyucu ve Görüntüleyici Yazılımı</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI.. ql4M2LoZBEhcBljvIA)()</td></tr><tr><td>Drosophila İnkübatör</td><td>Tritech</td><td>DT2-CIRC-TK</td><td></td></tr><tr><td>1/4" akrilik plastik</td><td>McMaster-Carr</td><td>8473K341</td><td></td></tr><tr><td>8 - 32 somun</td><td>McMaster-Carr</td><td>90257A009</td><td></td></tr><tr><td>8 - 32 x 1" altıgen başlı vidalar</td><td>McMaster-Carr</td><td>92185A199</td><td>bu boyuttaki vida için alt plakanın diş açılması gerekir 8</td></tr><tr><td>- 32 x 1/2" altıgen başlı vidalar</td><td>McMaster-Carr</td><td>92185A194</td><td>üstten ikinci plakanın vidalanması gerekiyor</td></tr><tr><td>2 - 56 3/8" düz başlı yıldız makine vidaları</td><td>McMaster-Carr</td><td>91500A088</td><td>bunlar iki orta plakayı bir arada tutar</td></tr><tr><td>0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" alüminyum boru</td><td>McMaster-Carr</td><td>92510A044</td><td>Şirket içinde üretilmiştir; Listelenen ürün yaklaşık olarak aynı boyutlardadır ve 8 numara vidalar için çalışmalıdır. Bunlar, 1" vidalar için kılıf görevi görür ve altıgen kapağı üst plakanın yüzeyinden biraz yukarı doğru yerleştirir</td></tr></tbody></table>

drosophila bakım davranışının nicelleştirilmesi

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila tımar etme davranışı hem ön hem arka kıskaçların koordine hareketini gerektiren karmaşık, çok adımlı bir lokomotif programdır. Burada, damlama deneyi protokolünü ve Drosophila damatlaştırma konusundaki küçük ölçekli veya büyük ölçekli araştırmalar için uygun maliyetli ve ölçeklendirilebilir yeni oda tasarımı sunuyoruz. Sinekler Brilliant Yellow boya ile vücudun her tarafına tozlanır ve boya oda içindeki bedenlerinden uzaklaştırılması için zaman verilir. Sinekler daha sonra, boya çözündürmek için belirli bir hacimde etanol içine çöker. Dezenilmemiş hayvanlara kıyasla bakımsız hayvanlar için boya etanol numunelerinin göreceli spektral absorbansı ölçülür ve kaydedilir. Protokol, tek tek sinekler için boya birikiminin niceliksel verilerini verir; bunlar kolaylıkla ortalanabilir ve örnekler arasında karşılaştırılabilir. Bu, deneysel tasarımların mutant hayvan çalışmaları veya devre manipülasyonları için damat yeteneğini kolayca değerlendirmesini sağlar. Bu verimli prosedür çok yönlü ve ölçeklenebilir. WOrk akışını ve Drosophila tip I Dopamin Reseptörü ( DopR ) için WT hayvanları ve mutant hayvanlar arasındaki karşılaştırma verileri.

Damatlık tahlilinde, ayarlama için belirlenen bir süre boyunca (30 dakika) sineklerin bedenlerinde kalan biriken boyanın göreli geri kalanına dayanılarak davranış performansını değerlendirmek için niceliksel veriler elde edilir. Sürgülü damat odası tasarımının örnek görüntüleri ve tahlilin ana adımları Şekil 1&#39;de vurgulanmaktadır. Sinekler, boya varlığında vorteks yaparak hemen tozlanma olayından önemli miktarda boya toplarlar ( Şekil 2d, 2e ). Tozla...

Bu protokol, bakım davranışı ölçmek için sağlam, nicel veri üreten, Drosophila&#39;daki ölçeklendirilebilir bireysel bakım tezgah tekniğini tanımlamaktadır. Yöntem, bakımsız ve bakımlı hayvanlar arasındaki boya birikimindeki farkın belirli bir süre boyunca karşılaştırılmasına dayanmaktadır.

Drosophila Bakım Davranışının Nicelleştirilmesi

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

Bu yöntemin genel amacı, temizleme yapmış ve yapmamış koşullardaki hayvanların vücudunda kalan renkli parlak sarı boyanın miktarını belirleyip karşılaştırarak Drosophila'nın temizleme davranışını ölçmektir. Bu yöntem, ince lokomotor becerilerin koordinasyonu ve bunlarla ilişkili moleküler düzenleyiciler ve devreler gibi nörobiyoloji ve davranışsal genetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları; hızlı, sağlam olması ve farklı beceri seviyelerindeki birçok araştırmacı ve öğrenci tarafından kolayca uygulanabilmesidir.Bu prosedürü, laboratuvarımdaki bir öğrenci olan Frankie Barradale gösterecek. Deneye başlamak için, canlı Drosophila örneklerini kültür tüpünden temizleme odasına taşımak üzere bir aspiratör hazırlayın. Makas kullanarak 1.5 feet uzunluğunda Tygon tüp kesin.Bir mililitrelik tek kullanımlık mikro-pipet ucunun ucundan en az bir inçlik kısmını kesin ve bir santimetrekarelik gözenekli örgü parçasını kesilmiş ucun 1/16 inçlik açıklığının üzerine tutun. Sinekler için bir tutma odası oluşturmak amacıyla, yeni bir bir mililitrelik mikro-pipet ucunu örgü ve kesik ucun üzerine sıkıca yerleştirin. Tek bir sineğin geçişine izin verecek kadar açıklığı genişletmek için yeni mikro-pipet ucunun en uç kısmını kesin.Delik, yaklaşık olarak bakım odasının açıklığıyla eşleşecektir. İç içe geçmiş uçları Tygon borusunun ucuna sıkıca yerleştirin. Vakum basıncına izin verecek sıkı bir oturuş sağlamak için uçları borunun içine itin.Tüpün diğer ucunda, 200 mililitrelik bir mikro-pipet ucunun tepesini kesin ve aspiratörün ağız kısmını oluşturmak için kesilen dar ucu tüpe yerleştirin. Toz alikvot tüplerini hazırlamak için, tartım kağıdı üzerine beş miligram parlak sarı boya tartın. Tozu 8 mililitrelik bir mikro-santrifüj tüpüne boşaltın ve kapağı sıkıca kapatın.Ardından, etanol tüplerini hazırlamak için 15 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine bir mililitre %100 etanol pipetleyin. Tüpleri etiketleyin, kapatın ve temizleme deneyi tamamlanana kadar saklayın. Ayrıca, negatif kontroller için sinek içermeyen, sadece bir mililitre etanol içeren en az bir boş örnek ekleyin.Her bir temizleme odasını, küçük deliklerin bulunduğu kayar üst plakayı vidalayarak ancak toz eklemesi için büyük deliklerin bulunduğu alt plakayı çıkarılmış halde bırakarak birleştirin. Gerekli her bir temizleme odasını, üst yüzü aşağı bakacak şekilde düz bir masaya yerleştirin. Tüpü, istenen kuyucuğun üzerindeki oda yüzeyine vurarak, her bir odaya beş miligram parlak sarı boya alikotu yükleyin.Tüm tozların elek üzerinden plağın üst kısmına düştüğünden emin olmak için hazneyi masaya hafifçe vurun. Ardından, konik açıklıkların geniş uçları dışarı bakacak ve delikler kuyucukların üzerine gelmeyecek şekilde alt plağı her bir hazneye vidalayın. Boyanın sızmaması ve plağın kaymaması için alt plağı sıkıca sabitleyin.Hazanlık tozun elekten geçerek alt plakaya çökmesi için hazneye ters çevirip birkaç kez masaya hafifçe vurun. Sineklerin tekil kuyucuklara yerleştirilmesini sağlamak için, haznenin üst plakasını küçük deliklerin 15 kuyucukla hizalandığı açık konumlara kaydırın. Bir pipet kullanıyormuş gibi aspiratörün bir ucundan nazikçe vakum yaparak, ağız aspiratörüne bir sinek yükleyin.Sinekleri, hafifçe üfleyerek ve açıklığı hedefe doğru yönlendirerek yerleştirin. Bir kuyucuğu doldurduktan, sineğin hazneye hapsolması için üst plakayı kaydırın ve diğer kuyucuklar doldurulurken sineğin kaçmasını önlemek için kuyucuk haznesinin açıklığının üzerine bant yapıştırın. Eğer tek bir kuyucuğa birden fazla sinek aspire edilirse, içeride sadece bir sinek kalana kadar o açıklığıB kapalı bırakmayın.Gerekli tüm kuyucuklar sineklerle doldurulduktan sonra, alt plaka yukarı gelecek şekilde hazneyi ters çevirin; böylece toz, gözenekli yapıdan geçip düşerek sinekleri kaplayabilir. Vidaları sıkarak üst ve alt plakaları sıkıca sabitleyin ve sinekleri tozlamak için hazneyi dört saniye boyunca vorteksleyin. Boyanın diğer taraftan düşmesi için hazneyi, üst plaka masaya bakacak şekilde iki kez masaya vurun.Ardından, üst plaka yukarı bakacak şekilde hazneyi ters çevirin ve boyanın, üst haznede tutulan sinekten uzakta, alt haznenin tabanına çöktüğünden emin olmak için hazneye iki kez vurun. Temizlenmelerine izin verilmeyen kontrol sinekleri için hemen numune hazırlama aşamasına geçin. Sineklerin temizlenmesine izin vermek için hazneyi üst plaka yukarıya bakacak şekilde 30 dakika boyunca masa veya tezgah üzerine düz bir şekilde bırakın.Tüm grooming deneyleri için ortamınızı sabit tutmak amacıyla, hazneyi gürültü ve titreşimden uzak bir alana yerleştirin. Hazneyi üst plaka yukarıya bakacak şekilde düz tutarak, alt plakayı dikkatlice sökün ve hiçbir boya kaybına yol açmadan hazneden çıkarın. Sinekler anestezi olana kadar hazneyi düşük hava akışlı bir CO2 pedinin üzerine yerleştirin.Üst plakayı odadan vidalayarak çıkarın, bir bacağı tutmak için dikkatli bir şekilde pens kullanın ve her odadan tozlanmış bir sineği çıkarıp etanol içeren 1,5 mililitrelik bir mikro-santrifüj tüpüne yerleştirin. Her mikro-santrifüj tüpü bir sinek içerdiğinde, kapağı kapatın ve boya ile etanol çözeltisini çalkalayıp karıştırmak için tüpleri üç kez ters çevirin. Boyanın sinekten çözeltiye tamamen geçtiğinden emin olmak için etanol ve sinek içeren tüpleri oda sıcaklığında beş saat boyunca inkübe edin.Beş saat sonra, boyaların sineklerden tamamen temizlendiğinden emin olmak için her tüpü iki saniye boyunca kısaca vorteksleyin. Her örneğin plakadaki konumunu not ederek, deneysel 1.5 mililitre tüpten 50 mikrolitreyle bir 96 kuyucuklu plaka kuyucuğuna aliquot edin. Aşırı tozlanmış sineklerin veya büyük tımar kusurlarının neden olabileceği tıkanma etkilerini önlemek için, örneği beş kat seyreltmek üzere 200 mikrolitre etanol ekleyin.Her örneği 397 nanometrede analiz etmek için bir plaka okuyucu kullanın. Örnekleri plaka okuyucu aracılığıyla kaydedin ve plaka üzerindeki kayıtlı örneklerin yer aldığı hesap tablosunu kaydedin. Bu yöntemi, güçlü bir hipomorf ve null DopR mutantlarının temizlenme performanslarını bir vahşi tip suşuyla karşılaştırarak DopR'yi incelemek için kullandık.DopR mutantları, vahşi tip veya kurtarılmış karşılıklarına göre anlamlı derecede daha fazla boya tutmuştur; bu durum, DopR mutantlarının temizleme davranışında daha az verimli olduğunu göstermektedir. Rutabaga sinekleri ile yapılan paralel bir deneyde, mutantlar DopR mutantlarından daha yüksek boya birikim seviyeleri sergilemiş olup, bu da DopR'nin temizleme davranışında önemli bir rolü olduğunu düşündürmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, davranışsal analizler için sineklerin nasıl yönetileceği ve temizleme davranışının nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

quantification-of-drosophila-grooming-behavior

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Drosophila melanogaster bir yüzyıl 1 aşkın süredir birçok önemli biyolojik işlemlerin moleküler ve hücresel temelini anlamak için kullanılan bir genetik ve davranışsal uysal modeli sistemidir. Drosophila iyi sinek davranışının genetik temeli içgörü kazanmak için istismar edilmiştir.

Test için Yöntemler Drosophila Davranış

Bu videoda, böcekleri anestezi olmadan muhafazalar arasında aktarmak için kullanılabilecek bir sinek aspiratörü oluşturma yöntemi açıklanmaktadır. Örnek protokoldeki aspiratör, bireysel bakım davranışlarını ölçmek için bir deney için...

Fly Aspiratör Tüpü: Canlı Drosophila'yı Aktarmak İçin Basit Bir Araç

Otomatik izleme sistemi Flywalk Drosophila melanogaster koku güdümlü davranış yüksek çözünürlüklü ölçümü için kullanılır.

Koku kılavuzluğunda Davranış Yüksek çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Drosophila melanogaster</emKullanma&gt;<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigma

Mekanosasyonu etkileyen yeni mutasyonları tanımlamak için, MARCM yöntemi ile üretilen mutant klonlarda sinek kıllarının dokunsal uyarımına davranışsal tepkiyi ölçen bir test tasarladık. Tekniklerin kombinasyonu, aksi takdirde ölümcül olabilecek mekanosensitif mutasyonların tanımlanmasına izin verir.

Arasında Mechanosensation için bir davranış tahlilinde klonlarda MARCM tabanlı<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Bu makale melanogaste motivasyon incelemek için r Drosophila erkek çiftleşme sürücüsünü kullanan bir davranış deneyi anlatır. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacılar bu motivasyonu altında yatan genetik moleküler ve hücresel mekanizmaları ortaya çıkarmak için ileri sinek neurogenetic teknikler kullanabilirler.

Ölçme ve Male Değiştirme Çiftleşme Sürücü<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Bu protokol, kur şartlama denilen bir Drosophila öğrenme ve bellek deneyi tanımlar. Bu klasik tahlil, resepsiyona açık olmayan prematüre bir kadının cinsel reddetmesinden sonra erkek kovuşturma davranışının azaltılmasına dayanmaktadır. Davranışsal esnekliğin bu doğal biçimi, öğrenmeyi, kısa vadeli belleği ve uzun süreli belleği test etmek için kullanılabilir.

Öğrenme ve Bellek Tedrisi Olan Drosophila Kurbanlığı İklimlendirme

Bu çalışma, yetişkin meyve sineklerinde aversif ilişkilendirilebilir öğrenmenin analizine izin veren basit bir davranış paradigmasını açıklar. Yöntem, belirli bir çevresel bağlam ile elektrik çarpması arasında oluşan ilişki nedeniyle doğuştan gelen negatif jeotaksi davranışını bastırmaya dayanır.

Drosophila İlişkisel Aversive Öğrenmeyi İncelemek İçin Yeni Bir Paradigma Olarak Pasif Kaçınma Davranışı

Otizm Spektrum Bozukluğu (OSB), bozulmuş sosyal ve iletişimsel davranış ve tekrarlayan davranışların ortaya çıkması ile ilişkilidir. Drosophila modelinde ASD genleri ve davranışsal eksiklikler arasındaki ilişkiyi incelemek için, bu yazıda sosyal boşluk, saldırganlık, kur yapma, tımar etme ve alışkanlık davranışını test etmek için beş davranışsal paradigma açıklanmaktadır.

Otizm Spektrum Bozukluğunun Drosophila Modelinde Davranışsal Değerlendirme Paradigmaları

Kemirgen modelleri, otizm spektrum bozukluğu (ASD) ile ilgili temel davranışları incelemek için değerli araçlardır. Bu makalede, farelerde ASD'nin temel özelliklerini modellemek için iki davranış testini açıklıyoruz: tekrarlayan davranışları değerlendiren kendi kendini tımar etme ve sosyal bozuklukları belgeleyen üç odacıklı sosyal etkileşim testi.

Farelerde Otistik Benzeri Davranışları Değerlendirme Stratejileri

Burada sunulan yöntem, belirli tımar davranışları için Drosophila melanogaster'den elde edilen görüntülerin manuel olarak açıklanmasını içerir. Atipik kendi kendine bakım fenotiplerini değerlendirmek için hem tımar nöbetlerinin sayısının hem de tımar için harcanan toplam sürenin ölçülmesine izin verir.

Aşırı Bakım Fenotiplerinin Değerlendirilmesi için Drosophila melanogaster Tımar Davranışının Miktarının Belirlenmesi

Öğrenin, Drosophila bakım davranışını nicelendirmek için boya birikimini ölçen bu ölçeklenebilir yöntemi. Hızlı ve sağlam teknik, sinirbilim ve davranış genetiği araştırmalarında gen işlevlerini incelemeye yardımcı olur.

Drosophila Bakım Davranışının Nicelleştirilmesi

Daha fazla video keşfet