Drosophila Bakım Davranışının Nicelleştirilmesi

Bu yöntemin genel amacı, temizleme yapmış ve yapmamış koşullardaki hayvanların vücudunda kalan renkli parlak sarı boyanın miktarını belirleyip karşılaştırarak Drosophila'nın temizleme davranışını ölçmektir. Bu yöntem, ince lokomotor becerilerin koordinasyonu ve bunlarla ilişkili moleküler düzenleyiciler ve devreler gibi nörobiyoloji ve davranışsal genetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları; hızlı, sağlam olması ve farklı beceri seviyelerindeki birçok araştırmacı ve öğrenci tarafından kolayca uygulanabilmesidir.

Bu prosedürü, laboratuvarımdaki bir öğrenci olan Frankie Barradale gösterecek. Deneye başlamak için, canlı Drosophila örneklerini kültür tüpünden temizleme odasına taşımak üzere bir aspiratör hazırlayın. Makas kullanarak 1.5 feet uzunluğunda Tygon tüp kesin.

Bir mililitrelik tek kullanımlık mikro-pipet ucunun ucundan en az bir inçlik kısmını kesin ve bir santimetrekarelik gözenekli örgü parçasını kesilmiş ucun 1/16 inçlik açıklığının üzerine tutun. Sinekler için bir tutma odası oluşturmak amacıyla, yeni bir bir mililitrelik mikro-pipet ucunu örgü ve kesik ucun üzerine sıkıca yerleştirin. Tek bir sineğin geçişine izin verecek kadar açıklığı genişletmek için yeni mikro-pipet ucunun en uç kısmını kesin.

Delik, yaklaşık olarak bakım odasının açıklığıyla eşleşecektir. İç içe geçmiş uçları Tygon borusunun ucuna sıkıca yerleştirin. Vakum basıncına izin verecek sıkı bir oturuş sağlamak için uçları borunun içine itin.

Tüpün diğer ucunda, 200 mililitrelik bir mikro-pipet ucunun tepesini kesin ve aspiratörün ağız kısmını oluşturmak için kesilen dar ucu tüpe yerleştirin. Toz alikvot tüplerini hazırlamak için, tartım kağıdı üzerine beş miligram parlak sarı boya tartın. Tozu 8 mililitrelik bir mikro-santrifüj tüpüne boşaltın ve kapağı sıkıca kapatın.

Ardından, etanol tüplerini hazırlamak için 15 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine bir mililitre %100 etanol pipetleyin. Tüpleri etiketleyin, kapatın ve temizleme deneyi tamamlanana kadar saklayın. Ayrıca, negatif kontroller için sinek içermeyen, sadece bir mililitre etanol içeren en az bir boş örnek ekleyin.

Her bir temizleme odasını, küçük deliklerin bulunduğu kayar üst plakayı vidalayarak ancak toz eklemesi için büyük deliklerin bulunduğu alt plakayı çıkarılmış halde bırakarak birleştirin. Gerekli her bir temizleme odasını, üst yüzü aşağı bakacak şekilde düz bir masaya yerleştirin. Tüpü, istenen kuyucuğun üzerindeki oda yüzeyine vurarak, her bir odaya beş miligram parlak sarı boya alikotu yükleyin.

Tüm tozların elek üzerinden plağın üst kısmına düştüğünden emin olmak için hazneyi masaya hafifçe vurun. Ardından, konik açıklıkların geniş uçları dışarı bakacak ve delikler kuyucukların üzerine gelmeyecek şekilde alt plağı her bir hazneye vidalayın. Boyanın sızmaması ve plağın kaymaması için alt plağı sıkıca sabitleyin.

Hazanlık tozun elekten geçerek alt plakaya çökmesi için hazneye ters çevirip birkaç kez masaya hafifçe vurun. Sineklerin tekil kuyucuklara yerleştirilmesini sağlamak için, haznenin üst plakasını küçük deliklerin 15 kuyucukla hizalandığı açık konumlara kaydırın. Bir pipet kullanıyormuş gibi aspiratörün bir ucundan nazikçe vakum yaparak, ağız aspiratörüne bir sinek yükleyin.

Sinekleri, hafifçe üfleyerek ve açıklığı hedefe doğru yönlendirerek yerleştirin. Bir kuyucuğu doldurduktan, sineğin hazneye hapsolması için üst plakayı kaydırın ve diğer kuyucuklar doldurulurken sineğin kaçmasını önlemek için kuyucuk haznesinin açıklığının üzerine bant yapıştırın. Eğer tek bir kuyucuğa birden fazla sinek aspire edilirse, içeride sadece bir sinek kalana kadar o açıklığıB kapalı bırakmayın.

Gerekli tüm kuyucuklar sineklerle doldurulduktan sonra, alt plaka yukarı gelecek şekilde hazneyi ters çevirin; böylece toz, gözenekli yapıdan geçip düşerek sinekleri kaplayabilir. Vidaları sıkarak üst ve alt plakaları sıkıca sabitleyin ve sinekleri tozlamak için hazneyi dört saniye boyunca vorteksleyin. Boyanın diğer taraftan düşmesi için hazneyi, üst plaka masaya bakacak şekilde iki kez masaya vurun.

Ardından, üst plaka yukarı bakacak şekilde hazneyi ters çevirin ve boyanın, üst haznede tutulan sinekten uzakta, alt haznenin tabanına çöktüğünden emin olmak için hazneye iki kez vurun. Temizlenmelerine izin verilmeyen kontrol sinekleri için hemen numune hazırlama aşamasına geçin. Sineklerin temizlenmesine izin vermek için hazneyi üst plaka yukarıya bakacak şekilde 30 dakika boyunca masa veya tezgah üzerine düz bir şekilde bırakın.

Tüm grooming deneyleri için ortamınızı sabit tutmak amacıyla, hazneyi gürültü ve titreşimden uzak bir alana yerleştirin. Hazneyi üst plaka yukarıya bakacak şekilde düz tutarak, alt plakayı dikkatlice sökün ve hiçbir boya kaybına yol açmadan hazneden çıkarın. Sinekler anestezi olana kadar hazneyi düşük hava akışlı bir CO2 pedinin üzerine yerleştirin.

Üst plakayı odadan vidalayarak çıkarın, bir bacağı tutmak için dikkatli bir şekilde pens kullanın ve her odadan tozlanmış bir sineği çıkarıp etanol içeren 1,5 mililitrelik bir mikro-santrifüj tüpüne yerleştirin. Her mikro-santrifüj tüpü bir sinek içerdiğinde, kapağı kapatın ve boya ile etanol çözeltisini çalkalayıp karıştırmak için tüpleri üç kez ters çevirin. Boyanın sinekten çözeltiye tamamen geçtiğinden emin olmak için etanol ve sinek içeren tüpleri oda sıcaklığında beş saat boyunca inkübe edin.

Beş saat sonra, boyaların sineklerden tamamen temizlendiğinden emin olmak için her tüpü iki saniye boyunca kısaca vorteksleyin. Her örneğin plakadaki konumunu not ederek, deneysel 1.5 mililitre tüpten 50 mikrolitreyle bir 96 kuyucuklu plaka kuyucuğuna aliquot edin. Aşırı tozlanmış sineklerin veya büyük tımar kusurlarının neden olabileceği tıkanma etkilerini önlemek için, örneği beş kat seyreltmek üzere 200 mikrolitre etanol ekleyin.

Her örneği 397 nanometrede analiz etmek için bir plaka okuyucu kullanın. Örnekleri plaka okuyucu aracılığıyla kaydedin ve plaka üzerindeki kayıtlı örneklerin yer aldığı hesap tablosunu kaydedin. Bu yöntemi, güçlü bir hipomorf ve null DopR mutantlarının temizlenme performanslarını bir vahşi tip suşuyla karşılaştırarak DopR'yi incelemek için kullandık.

DopR mutantları, vahşi tip veya kurtarılmış karşılıklarına göre anlamlı derecede daha fazla boya tutmuştur; bu durum, DopR mutantlarının temizleme davranışında daha az verimli olduğunu göstermektedir. Rutabaga sinekleri ile yapılan paralel bir deneyde, mutantlar DopR mutantlarından daha yüksek boya birikim seviyeleri sergilemiş olup, bu da DopR'nin temizleme davranışında önemli bir rolü olduğunu düşündürmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, davranışsal analizler için sineklerin nasıl yönetileceği ve temizleme davranışının nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.