Name: İnsan İnfluenza A Virüs Enfeksiyonları Zebra balığı Modeller Kullanılarak Antiviral İlaçlar Ekran ve Host Bağışıklık Hücre Yanıtları karakterize etmek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Öğrenin, insan influenza A virüs enfeksiyonlarını zebra balığı modelleri kullanarak antiviral ilaçları tarama ve konak bağışıklık hücre yanıtlarını karakterize etme yöntemlerini. Bu teknikler optik berraklık sayesinde yüksek verimli tarama imkanı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, zebra balığı bakımı ve bakımı için Mark Nalan'a ve NS1-GFP'yi yaydıkları ve IAV titrelerini belirledikleri için Meghan Breitbach ve Deborah Bouchard'a teşekkür etmek istiyor. Bu araştırma, NIGMS hibesi NIH P20GM103534 ve Maine Tarım ve Orman Deney İstasyonu (Yayın Numarası 3493) tarafından desteklenmiştir.

Tüm iş biyogüvenlik düzeyi 2 (veya BSL2) Hastalık Kontrol (CDC) ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komiteleri (IACUC) tarafından kurulan direktifleri doğrultusunda ABD Merkezleri tarafından açıklanan standartlar kullanılarak yapılmalıdır. güvenlik ve uyum sağlamak için uygun yetkililerle görüşmek edin. 1. Zebra balığı Bakım ve Onarım <ol><li> zebrafish spawn ve deneyler için embriyo gerekli sayıda toplamak. Tüm Adatto ve arkadaşları tarafından tarif edilenler gibi, gerekli kitle ıslah tankı. 32, gelişimsel aşamalı embriyoların sayıda toplamak için kullanılabilir. </li><li> Embriyolar düşük yoğunlukta derin Petri kapları istenen gelişim aşamasında (lokalize, yüzmek mesane enfeksiyonu için bir sistemik IAV enfeksiyonu [bölüm 3] ya da 5 gün sonrası fertilizasyon için 48 saat sonrası döllenme [bölüm 4]) (kadar geliştirmeye olanak sağlar &lt; 6 ihtiva eden steril bir yumurta suda 28 ° C &#39;de 100 embriyo / çanak)Distile su içinde 0 ug / ml deniz tuzu (örneğin, Anında okyanus). <ol><li> plastik transferi pipetleri ile ölü embriyolar çıkarın ve optimal sağlık ve gelişimini sağlamak yumurta suyu günlük olarak değiştirin. </li></ol></li></ol> Malzeme ve Reaktiflerin 2. Hazırlık <ol><li> Damıtılmış su ve otoklavda Tricaine-S, 4 mg / ml stok çözeltisi (7.0-7.4 pH ayarlamak) hazırlayın. 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Mikropipet çektirmenin kullanarak filamentler ile borosilikat cam kılcal çekin (aşağıdaki ayarlarla örneğin Mikropipet Çektirme: basınç ayarı = 100, ısı = 550, pull = [hiçbir değer], hız = 130, süresi = 110). NOT: Ön iğne kırpma için, iğne iğne ucu kadar incelecek başlar yerden uzunluğu yaklaşık 12-15 mm olacaktır. Bu tercih ve uygulamaya göre, ancak, değişebilir. Daha uzun, daha yavaş konik çünkü embriyo delmek için artan yetenek ve düşük ri daha tercih edilebilirİğne bükme veya kırılma sk. </li><li> Bir mikrodalga kullanarak 100 ml yumurta suda agaroz 2 gr eritin. sıraya ve derin Petri kapları içine erimiş agaroz ve katılaşmaya izin dökülmesi embriyolar enjekte plakaları olun. </li><li> nükleaz içermeyen su içinde zanamivir 10 mg / ml stok olun. -20 ° C&#39;de kısım ve dondurularak. </li><li> Embriyo agaroz montaj yapmak için bir mikrodalga kullanarak 50 ml yumurta suda 0.5 g agaroz eritin. görüntüleme sırasında kullanmak için hazır olana kadar, 50 ° C&#39;de su banyosu içinde muhafaza edin. </li></ol> 3. Sistemik IAV Enfeksiyon (48 saat sonrası fertilizasyon) DİKKAT: Tüm araştırma personeli IAV ile çalışmaya başlamadan önce aşılama konusunda amirlerine ve doktorlarına danışmalıdırlar. <ol><li> El ile 5. forseps kullanarak deney gününde embriyolar dechorionate. kaldırmak ve / ml Tricaine solüsyon 200 mcg süreç yaralandı embriyolar euthanize özen gösterin. </li><li> Preparat OMikroenjeksiyon f IAV Not: zebra balığı embriyolar enfekte ettiği gösterilmiştir soylar, influenza A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), grip bir X-31 A / Aichi / 68 (H3N2) (X-31) ve bir flüoresan raportör olan grip suşu NS1-GFP 33. APR8 ve X-31 ve diğer suşlar ilgili ayrıntılar, İnfluenza Research Database bulunabilir <ol><li> Daha önce 34, 35 açıklandığı gibi embriyo halindeki tavuk yumurtalarının içinde IAV ve NS1-GFP gerginlik yaymak. Toplamak kısım, ve -80 ° C &#39;de alantoik IAV ihtiva eden sıvı ve mağaza titre. APR8 önceden titre edilmiş ve X-31 virüs ticari olarak satın alınabilir. <ol><li> enfeksiyon hemen önce hızla eldivenli elinde bir IAV kısım Çözülme ve daha sonra hızlı bir şekilde titre kaybını azaltmak için buz üzerine yerleştirin. </li></ol></li><li> viral seyreltme <ol><li> APR8 ya da X-31 virüslerin kullanıldığı takdirde, 3.3 x 10 6 yumurta enfektif doz% 50 (EID50) seyreltin / ml steril, buz gibi soğuk PBS ile bağlı ek olarak% 0.25 fenol kırmızı tasyonlu bir laminer akış başlığı içinde (görselleştirme yardımcı olmak için). Eş zamanlı olarak% 0.25 fenol kırmızısı ile steril PBS içeren bir denetim kurmak. </li><li> NS1-GFP suşu 33 kullanılıyorsa,, steril, buz gibi soğuk PBS içeren% 0.25 fenol kırmızı NL başına 1,5 x 10 2 plak oluşturan birim (pfu) bir laminer akış başlığı içinde (görselleştirme yardım etmek için) seyreltin. Eş zamanlı olarak% 0.25 fenol kırmızısı ile steril PBS virüs gibi seyreltilmiş bulaşmamış tavuk yumurta allantoik sıvı içeren bir denetim kurmak. </li><li> Kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde IAV koruyun. </li></ol></li><li> kullanımdan hemen önce Microloader ipuçlarını kullanarak mikroenjeksiyon iğneler içine Pipetleyin virüs çözümü. Enjeksiyon aparatı (örn MPPI-3 basınçlı enjeksiyon sistemi) uygun tutucu içine mikroenjeksiyon iğne takın. </li><li> Stereo mikroskop altında izlerken, hafifçe keskin, sterilize 5. forseps ile mikroenjeksiyon iğne ucu klibi. NOT: yapılması önerilmiştir olduğunuded mikroenjeksiyon ucu yavaş yavaş kırpılmış olması. </li><li> basınçlı enjeksiyon sistemi ayak pedalına basınız ve bir kalibrasyon mikrometre slayt mikroskop daldırma petrol bir damla enjekte. damla çapını ölçün. , Denklem kullanılarak damla hacmini hesaplayın V = V hacmi nl olduğunu ve r um içinde yarıçapı / 3πr 3 4. NOT: damla çapı çok küçük ise, ek cam kırpılabilir veya basınç ve zamanlama ayarları ayarlanabilir. damla çapı çok büyükse, basınç ve zamanlama ayarları ayarlanabilir. </li><li> Basınç enjektörü basınç ve zamanlama ayarlarını yapın ve / veya istenilen enjeksiyon hacmi (tipik olarak 1-3 nl) elde edilene kadar iğne ucu reclip. 40 ve 80 milisaniye arasında 20 ve 30 psi ve darbe süresi ayarları arasındaki basınç ayarları tipiktir. bu kılcal basınç sayaçları ama IAV (net sıfır basınç) akmaması böylece geri basınç ayarlayın. </li></ol></li><li> Enjeksiyon için Embriyolar hizalayın <ol><li> 200 ug / ml Tricaine içinde dechorionated embriyoların uyutmak. </li><li> hareket durur sonra, plastik bir pipet ile (bölüm 2.3 hazırlanan)% 2 agaroz plaka 10-20 embriyo transferine. Fazla sıvının çıkması için pipet kullanın. </li><li> Yavaşça yangın cilalı ve mühürlü borosilikat cam kapiller ile mikroenjeksiyon için embriyolar hizalayın. Cuvier ve kanal veya posterior kardinal ven mikroenjeksiyon iğne (Şekil 1A) ile uyumlu olacak şekilde, yavaşça şark embriyolar stereo mikroskop kullanarak. </li></ol></li><li> IAV Mikroenjeksiyon <ol><li> Yavaşça Cuvier ve kanal veya posterior kardinal ven içine mikroenjeksiyon iğne takın. Embriyo (Şekil 1A) dolaşım sistemi içine IAV istenen hacim enjekte ayak pedalına basın. Gerekirse Embriyolar birden çok kez enjekte edilebilir. NOT: Enjeksiyon bolus dolaşıma ve distrib içine süpürüldü olmalıdırvücuda uted. enjeksiyon hacmi enjeksiyon yerinde toplar ise, deney ve euthanize embriyo çıkarın. </li><li> seçilen virüs suşu için özel kontrol solüsyonu ile farklı embriyolar üzerinde enjeksiyon tekrarlayın. APR8 ve X-31 için, bölüm 3.2.2.1 tarif kontrolü kullanmak; NS1-GFP için, bölüm 3.2.2.2 açıklanan kontrol kullanır. </li></ol></li><li> 33 ° C&#39;de kuluçka steril yumurta, su ve yer içeren etiketli Petri embriyo transferi. Not: Enfekte embriyolar gelişmiş virüs kopyalanmasını desteklemek için 33 ° C&#39;de yetiştirilir. Buna ek olarak, 33 ° C&#39;de inkübasyon daha yakından IAV enfeksiyonları meydana burada dış ortamda düşük sıcaklıklarda ile yakın temas içinde olan ve üst solunum yolu, sıcaklığını taklit eder. Embriyolar geniş bir sıcaklık aralığında 34 ACCLIMATE edebilirsiniz. </li></ol> 4. Lokalize, Tg içinde yüzmek Mesane IAV Enfeksiyon (mpx: mCherry) </em&gt; Transgenik Zebra balığı (5 gün sonrası fertilizasyon) <ol><li> Mikroenjeksiyon için IAV hazırlanması <ol><li> bölüm 3.2&#39;de anlatıldığı gibi NS1-GFP zorlanma ve kontrol enjeksiyon çözeltisi ile seyreltilir. </li><li> bölüm 2.2&#39;de anlatıldığı gibi iğneler hazırlayın. </li><li> Tg (mpx: mCherry) hizalamak şu istisna ile bölüm 3.3&#39;te anlatıldığı gibi şişirilmiş yüzmek mesane içeren 35 larva. İğne yüzmek mesaneyi delip olabilir ve daha önce 36 (Şekil 2A) açıklandığı gibi virüs, yüzme mesane posterior yatırılır olabilir böyle bir şekilde larva hizalayın. </li></ol></li><li> IAV Mikroenjeksiyon <ol><li> Yavaşça yüzmek mesane içine mikroenjeksiyon iğne takın ve yapısı (Şekil 2A) ve posterior doğru istenilen hacmi (örneğin 5 nl) enjekte edilir. NOT: Enjeksiyon bolus posterior doğru toplamak gerekir ve yüzmek mesane hava kabarcığı b gerekirE öne yerinden. GFP 3 saat sonrası enjeksiyon olarak uyulması gereken başlamalıdır. </li><li> Bölüm 3.4.2&#39;de tarif edildiği gibi, seçilen virüs suşuna özel kontrol çözeltisi ile tekrar enjeksiyonları. </li></ol></li><li> 33 ° C&#39;de kuluçka steril yumurta, su ve yer içeren Petri kapları için larva aktarın. </li></ol> 5. Antiviral İlaç Tedavisi NOT: protokol aşağıda daha önce Gabor ark gösterilen Zanamivir tedavisini tarif etmektedir. 19. Bu protokol, diğer anti-viral ilaçlar taranması için tadil edilmiş bir 96 gözlü levha, yüksek verimli bir biçimde birden çok bileşikleri taramak için değiştirilebilir potansiyeline sahip olabilir. <ol><li> 3 saat sonrası enfeksiyon, 0, 16.7 ya da 33.3 ng / ml Zanamivir içeren steril yumurta su ile yumurta NS1-GFP- suyunu ve kontrol enfekte balık değiştirin. NOT: Bu konsantrasyonlar fo elde fizyolojik seviyelerini çoğaltmak girişimi için seçildiİnsan hastalara (günde iki kez 100, 200 ya da 600 mg, iv, günde iki kez ya da inhale 10 mg) &#39;de zanamivir llowing idaresi. Insan hastalarda serum konsantrasyonları 9.83 45.3 ng / ml 36 arasında değişmekteydi. </li><li> 5 gün boyunca, yumurta suya her 12 saat değiştirin ve zanamivir uygun miktarda içeren steril yumurta su ile değiştirin. </li><li> Enfeksiyon Kursu izleyin. <ol><li> 200 ug / ml Tricaine zebrafish uyutmak. görsel IAV ile enfekte olan ve kontrol balık ile ilaçların farklı konsantrasyonlarda batırma balık arasında enfeksiyon modellerindeki farklar gözlemlemek için bir stereo floresan mikroskop ile GFP ifade izleyin. </li><li> 5 gün boyunca morbidite ve mortalite izleyin. <ol><li> uyuşukluk belirtileri ve ödem kanıt, pigmentasyon farklılıkları, göz ve kraniofasial deformiteler ve lordoz dahil hastalık patoloji ile ilgili enfeksiyon dinamikleri hakkında rekor gözlemler. hastalık patolojitipik olarak enjekte virüs miktarına bağlı olarak, 24-48 saat sonra enjeksiyon de kontrol enfeksiyona balık belirgin hale gelir. görüntüleri 24 saat sonrası enjeksiyon toplayın. </li><li> 5 gün sonrası enfeksiyon için her 24 saat, ölü morbid ve sağlıklı larvaların sayısını kaydedin. Ölüm fark edilebilir bir kalp atışı olmaması ile tanımlanır. İstediğiniz gibi veri çizilir. Örneğin, sağlıklı marazi veya ölü balık yüzdeleri ile yığılmış çubuk grafik olarak arsa verileri, x ekseninde y ekseninde ve tedavi grubuna çizilen. 19 NOT: Ölümleri Kaplan-Meier sağkalım tahminlere göre attı olabilir. Uygulamaya bağlı olarak, gözlenen yukarıda belirtilen patolojik özelliklerine göre morbidite derece ölçmek olabilir bir puanlama matrisine dahil puanlama balık morbidite için alternatif yaklaşımlar geliştirmek için uygun olabilir. </li><li> uygun istatistiksel analiz uygulamak için bir istatistikçi danışın. </li></ol></li></ol></li></ol> 6. nötrofil Göç NOT: protokol aşağıda lokalize, epitel IAV enfeksiyonun ardından yüzmek mesane nötrofil göçünü izlemek için bir yöntem açıklanır. tarif edilen yöntemler genetik ve kimyasal işlemler etkilerini test etmek için modifiye edilebilir. Bu tekniği kullanarak, bir IAV enfeksiyonu sırasında nötrofil davranışı altında yatan mekanizmaları karakterize etmek mümkün olacaktır. <ol><li> Görüntüleme için Zebra balığı Montaj <ol><li> larvaları anestezisi 200 ug / ml Tricaine yansıması. </li><li> Yumurta su (~ 50-100 ul) küçük bir damlacık iyi bir 24 bir kuyuya NS1-GFP ile enfekte olmuştur larva, cam alt plakayı: Tek bir Tg (mCherry mpx) aktarın. Diğer IAV-enfekte ve kontrol balık tekrarlayın. </li><li> Yavaş yavaş büyük kabarcıklar tanıtmak için özen her bir kuyu (bölüm 2.5) için% 1 agaroz embriyo montaj medya ekleyebilirsiniz. <ol><li> onun tarafına monte edilir şekilde hafifçe larva konumunu ayarlamak.Goody ve Henry 37 filamentler ile borosilikat cam kılcal damarlar monte ve yerinde superglued olan böcek pimleri kullanarak bu uygulamada iyi çalışması probları yapmak nasıl açıklar. </li></ol></li><li> Agaroz sertleşince yavaşça 200 ug / ml Tricaine ihtiva eden yumurta su ile, ayrı ayrı kuyuların doldurun. </li><li> konfokal mikroskop ile, 20X objektif kullanılarak aydınlık ve floresan görüntüleri yığını serisi Az yakalama yüzme mesane üzerinde duruldu. <ol><li> hepsi gözle gözlenebilen yeşil ve kırmızı floresan yakalamak böylece üst ve alt limitlerini ayarlayın. </li><li> ≤ 4 mikron olan adımlarla 2.0 mikro-sn / pikselde Yakalama görüntüleri. Piksel başına süresinin arttırılması ve adımlar arasındaki mesafeyi azaltarak (örneğin 0,5-1,0 mikron) resim çözünürlüğü ve kalitesini artırır. </li><li> katmanları birleştirerek iki boyutlu bir görüntü oluşturmak. </li><li> mpx mCherry-pozitif nötrofil mevcut i sayısını karşılaştırınn IAV-enfekte ve kontrol enjekte zebrafish yüzmek mesane. </li></ol></li></ol></li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

insan konak-patojen modellemek için küçük bir hayvan kullanılarak elde edilen yararları maksimize etmek için, model sisteminin doğasında avantajları yararlanmak araştırma soruları ve hipotez sınaması çerçeve önemlidir. İnsan IAV enfeksiyonu için bir model olarak, zebra balığı, yüksek doğurganlık, optik berraklık, ilaç taraması için amenability ve nötrofiller gibi bağışıklık hücreleri etiketlemek transgenik kuşaklar mevcudiyeti de dahil olmak üzere pek çok güçlü, yer alır. Zebra balığı inflamasyon ve doğal bağışıklık çal...

Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) verilerine göre, grip virüsleri yetişkinlerin% 5-10 ve yıllık çocukların% 20-30 bulaştırmak ve şiddetli hastalık 3-5 milyon vaka neden ve dünya çapında 1 500.000 ölüm. Gribe karşı Yıllık aşı hastalığı önlemek için en iyi seçenek olmaya devam etmektedir. DSÖ Küresel Eylem Planı gibi çabalar morbidite ve mevsimsel influenza salgınları 2 ile bağlantılı ölüm azaltmak için daha güçlü aşı stratejileri içine mevsimsel aşı kullanımı, aşı üretim kapasitesi, araştırma ve geliştirme artmıştır. Nöraminidaz inhibitörleri (örn Zanamivir ve oseltamivir) gibi Antiviral ilaçlar bazı ülkelerde mevcuttur ve başlangıcı 3, 4, 5, ilk 48 saat içinde uygulandığında, hafifletici semptomlarda etkili olduğu kanıtlanmıştır. küresel çabalara rağmen, mevsimsel grip çevreleme ouinfluenza virüsü antijenik sürüklenme genellikle virüsün 6 değişen genomunun uyum mevcut yeteneklerini aştığı olarak tbreaks, şu anda müthiş bir sorun olmaya devam etmektedir. Virüsün yeni suşlar hedefleyen aşı stratejileri önceden geliştirilmeli ve bazen nedeniyle, sonunda bir grip sezonu hakim soyların türleri öngörülmeyen değişikliklere en iyi şekilde etkili daha az işlenir. Bu nedenlerden dolayı, enfeksiyonlara içeren ve mortalite azaltmak için alternatif tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için açık bir ihtiyaç vardır. Konak-virüs etkileşiminin daha iyi bir anlayış elde ederek, yeni bir anti-grip ilaçları ve adjuvan tedavilerin 7, 8 geliştirmek mümkün olabilir. insan konak-grip A virüsü (IAV) etkileşim karmaşıktır. insan IAV enfeksiyonu Çeşitli hayvan modelleri dahil olmak, konak-virüs etkileşimi anlamak için geliştirilmiştirfareler, kobay, pamuk sıçan, hamster, dağ gelinciği, olmasmm 9 ing. konak-IAV dinamiklerinin anlaşılmasını arttırmıştır önemli verileri sunarken, her model organizma insan tıp içine bulguları çevirmek için çalışırken dikkate alınması gereken önemli sakıncalar sahiptir. Insan influenza 9 izole bulaşmış Örneğin, en yaygın olarak kullanılan model olan fareler, hali hazırda IAV kaynaklı enfeksiyon semptomları geliştirmez. Faresi epitel hücreleri yerine insan epitelyum hücrelerinin 10 eksprese α-2,6 sialik asit bağlarının α-2,3 sialik asit bağlarının ifade beri insan influenza doğal tropizmi izole yoksun olmasıdır. İnsan IAV mevcut hemaglutinin proteini olumlu, bağlanma ve reseptör dolayımlı endositoz 9, 11 ile α-2,6 sialik asit bağlarının taşıyan konakçı hücrelere giriş izolatları </s12, 13&gt; kadar. Sonuç olarak, artık insan influenza fare modelleri gelişmekte olan, bakım, insan hastalık yönlerini özetlemek hastalık fenotipleri ulaşmak için grip uygun suşu ile fare uygun gerginlik eşleştirmek için alınması gerektiğini kabul edilmektedir. Bunun aksine, dağ gelinciği, üst solunum yolundaki epitel hücreleri, insan hücreleri 14 benzer α-2,6 sialik asit bağlarının sahiptirler. Enfekte gelincikler insan ve kuş gribi virüslerinin 14 patojenite ve bulaşabilirliği, 15 de dahil olmak üzere insan hastalığında gözlenen patolojik ve klinik özellikleri, birçok paylaşıyoruz. Ayrıca aşı etkinliği çalışmalarda yüksek ölçüde uygundurlar. Bununla birlikte, insan influenza gelincik modeli istatistiksel olarak önemli edinimi yapmak esas boyutu ve hayvancılık maliyeti ile ilgili çeşitli dezavantajları vardırcan veriler zorlu. Buna ek olarak, gelincikleri önceden test etkinliği zorlaştıran ilaç farmakokinetiği, biyoyararlanım ve toksisite farklılıkları göstermiştir. Örneğin, dağ gelincikleri M2 iyon kanal inhibitörü amantadin 16 toksisite gösterirler. Nedenle, insan IAV enfeksiyonları ile ilgili soruları incelemek için bir hayvan modeli seçiminde, kendine özgü avantajları ve sınırlamaları ve soruşturma altında konak-virüs etkileşimin yönünü dikkate almak önemli olduğu açıktır. Zebra balığı Danio rerio &lt;bir bağışıklık tepkisi ev sahibi mikrobik enfeksiyon araştırmak için benzersiz bir fırsat sunmaktadır hayvan modeli, potansiyel ilaç tedavileri 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, birdestek sınıfı = &quot;xref&quot;&gt; 24, 25, 26, 27, 28. Zebrabalıkları hücrelerin yüzeyi üzerinde α-2,6-bağlantılı sialik asit infeksiyon çalışmalarında karşılanır ve IAV 19&#39;un bir flüoresan raportör suşu kullanılarak in vivo görüntülenmiştir IAV, karşı duyarlılığının önerdi. IAV enfekte zebrabalıkları, antiviral ifnphi1 ve mxa transkriptlerinin artmış ekspresyonu doğuştan gelen bağışıklık tepkisi teşvik edildiğini göstermiştir ve ödem ve doku tahribi içeren IAV enfekte zebra balığı görüntülenen patoloji, insan influenza enfeksiyonları gözlenene benzerdi . Ayrıca, IAV antiviral nöraminidaz inhibitörü Zanamivir sınırlı mortalite ve zebrabalıkları 19 azalmış viral replikasyon. Bu raporda, sistem başlatma için bir protokolZebra balığı embriyolarının in ic IAV enfeksiyonları tarif edilmektedir. Bir kanıtı madde olarak klinik açıdan uygun dozlarda Zanamivir kullanılarak, anti-viral etkinlik için bileşiklerin elenmesi için zebrabalıkları IAV enfeksiyon modeli yardımcı olduğunu göstermiştir. Buna ek olarak, zebrabalıkları lokalize bir epitel IAV enfeksiyonu üretilmesi için bir protokol, anatomik ve fonksiyonel olarak benzer bir memeli akciğer 21, 29, 30, 31 olarak kabul edilir bir organ mesane yüzmek tarif edilmektedir. Bu yerelleştirilmiş IAV enfeksiyon modeli kullanılarak, enfeksiyon sitesine nötrofil göçünü IAV enfeksiyon ve inflamasyon nötrofil biyoloji rolüne soruşturma sağlayan izlenebilir. Bu zebrabalıkları modeller, insan IAV enfeksiyonlarının mevcut hayvan modelleri tamamlar ve küçük molekülleri ve nedeniyle geliştirilmiş s olasılığı bağışıklık hücrelerinin karşı etkilerini test etmek için özellikle yararlı olantatistical güç, yüksek verimli tahlillerine orta- kapasitesi ve yetenekleri ışık mikroskobu ile bağışıklık hücre davranışlarını ve fonksiyonunu izlemek için.

<table><tbody><tr><td>Anında Okyanus</td><td>Spektrumu Markaları</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 25 mm steril tek kullanımlık Petri kapları&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipetleri&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Trikain-S (MS-222)</td> <td>Filamentli Batı Kimyasal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal damar&nbsp;</td><td>Sutter Enstrümanı&nbsp;</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Alevli/Kahverengi mikropipet çektirmesi&nbsp;</td><td>Sutter Enstrümanı</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Zanamivir</td><td>AK Bilimsel</td><td>G939</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 forseps&nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>72700-D</td><td></td></tr><tr><td>Mikro yükleyici uçları</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskobu daldırma yağı</td><td>Olympus</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop aşaması kalibrasyon slaytı&nbsp;</td><td>AmScope</td><td>MR095</td><td></td></tr><tr><td>MPPI-3 basınç enjektörü&nbsp;</td><td>Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Geri basınç ünitesi</td><td>Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet tutucu kiti</td><td>Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>Ayak pedalı</td><td>Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik taban</td><td>Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon</td><td>Manyetik Baz</td><td></td></tr><tr><td>Fenol kırmızı&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P-4758</td><td></td></tr><tr><td>Düşük sıcaklık inkübatörü</td><td>VWR</td><td>2020</td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V12</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aydınlatıcı</td><td>Zeiss</td><td>HXP 200C</td><td></td></tr><tr><td>Soğuk ışık kaynağı</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>CL6000 LED</td><td></td></tr><tr><td>Cam tabanlı çok kuyulu plaka, 24 kuyulu</td><td>Mattek</td><td>P24G-0-13-F</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX-81, FV-1000 lazer taramalı konfokal sistem</td><td></td></tr><tr><td>Fluoview yazılımı</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism v6</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virüsü&nbsp;</td><td>Charles Nehri&nbsp;</td><td>490710</td><td></td></tr><tr><td>İnfluenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)&nbsp;</td><td>Charles Nehri&nbsp;</td><td></td><td></td>490715</tr><tr><td>Manicassamy et al. 2010'da Referans Verilen</td><td>İnfluenza NS1-GFP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tg(mpx:mCherry)</td><td></td><td></td><td>Lam et al. 2013'te atıfta bulunulmuştur</td></tr></tbody></table>

İnsan İnfluenza a virüs enfeksiyonları zebra balığı modeller kullanılarak antiviral İlaçlar ekran ve host bağışıklık hücre yanıtları karakterize etmek

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Her yıl, mevsimsel grip salgınları dünya çapında toplumları derinden etkiliyor. Küresel çabalara rağmen, influenza inatçı bir sağlık yükü olmaya devam ediyor. Enfeksiyonları azaltmak için temel strateji yıllık aşılamadır. Grip geçirmiş kişilerde, antiviral ilaçlar semptomları hafifletebilir. İnfluenza ile mücadele için alternatif stratejiler geliştirmek için açık ve karşılanmamış bir ihtiyaç vardır. Konak-influenza etkileşimlerini modellemek için çeşitli hayvan modelleri oluşturulmuştur. Burada, sistemik ve lokalize insan influenza A virüsü (IAV) enfeksiyonu için zebra balığı modelleri oluşturmak için protokoller açıklanmaktadır. Sistemik bir IAV enfeksiyon modeli kullanılarak, potansiyel antiviral aktiviteye sahip küçük moleküller taranabilir. Prensip kanıtı olarak, IAV ile enfekte zebra balığında antiviral ilaç Zanamivir'in etkinliğini gösteren bir protokol açıklanmaktadır. IAV ile enfekte zebra balıklarında potansiyel antivirallerin göreceli etkinliğini puanlamak için hastalık fenotiplerinin nasıl ölçülebileceğini gösterir. Son yıllarda, nötrofillerin influenza enfeksiyonuna insan konak yanıtında oynadığı kritik rol için artan bir takdir olmuştur. Zebra balığının, insan tıbbı üzerinde doğrudan etkileri olan nötrofil biyolojisi çalışmaları için vazgeçilmez bir model olduğu kanıtlanmıştır. Lokalize bir viral enfeksiyon bağlamında nötrofil biyolojisini incelemek için Tg(mpx:mCherry) zebra balığı hattında lokalize bir IAV enfeksiyonu oluşturmak için bir protokol tanımlanmıştır. Lokalize enfeksiyon bölgelerine nötrofil alımı, terapötik uygulamalara sahip olabilecek deneysel manipülasyonları değerlendirmek için ek bir ölçülebilir fenotip sağlar. Her iki zebra balığı protokolü de insan IAV enfeksiyonunun yönlerini aslına uygun olarak özetlemektedir. Zebra balığı modeli, yüksek doğurganlık, optik netlik, ilaç taramasına uygunluk ve nötrofiller gibi bağışıklık hücrelerinin floresan proteinlerle etiketlendiği olanlar da dahil olmak üzere transgenik hatların mevcudiyeti dahil olmak üzere çok sayıda doğal avantaja sahiptir. Burada ayrıntılı olarak açıklanan protokoller bu avantajlardan yararlanır ve sonuçta kliniğe dönüşebilecek konakçı-IAV etkileşimleri hakkında kritik içgörüler ortaya çıkarma potansiyeline sahiptir.

Burada, zebrafish sistemik IAV enfeksiyon ilaç etkinliği (Şekil 1A) test etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteren veriler mevcuttur. 48 saat sonra döllenme Embriyolar, bir viral enfeksiyon başlatmak için Cuvier bir kanal yoluyla APR8 (Şekil 1C, 1F), X-31 (Şekil 1D, 1G) ya da NS1-GFP (Şekiller 1 H-1 H) enjekte edilmiştir. 48 saat sonrası döllenme de embriyoların başka kohort viral enfeksiyon (Şekil 1B, 1E)</s...

İnsan influenza A virüsü için sistemik ve lokalize zebra balığı enfeksiyon modelleri gösterilmiştir. Sistemik bir enfeksiyon modeli kullanarak, zebra balığı antiviral ilaçları taramak için kullanılabilir. Lokalize bir enfeksiyon modeli kullanarak, zebra balığı konakçı bağışıklık hücresi tepkilerini karakterize etmek için kullanılabilir.

İnsan İnfluenza A Virüs Enfeksiyonları Zebra balığı Modeller Kullanılarak Antiviral İlaçlar Ekran ve Host Bağışıklık Hücre Yanıtları karakterize etmek

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Bu prosedürlerin genel amaçları, viral enfeksiyona karşı konakçı bağışıklık yanıtını incelemek ve antiviral bileşikleri taramak için zebra balığını bir influenza modeli olarak kullanmaktır. Bu yöntemler, bir enfeksiyon sırasında fagositlerin bağışıklık ve inflamasyonda oynadığı rol ve potansiyel antiviral tedavilerin etkinliği gibi influenza alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bir influenza zebra balığı modeli, gelişmekte olan zebra balıklarının optik berraklığı ve orta ila yüksek kapasiteli analizler gerçekleştirme imkanı sayesinde, daha önce yanıtlanmamış soruların ele alınmasına olanak tanır.Metin protokolüne göre reaktifler hazırlandıktan ve embriyolar istenen evreye getirildikten sonra, deney günü embriyoları dekoryonate etmek için beş numara pens kullanın. APR-8 veya X31 virüsleri kullanılıyorsa, laminer akışlı kabin içerisinde virüsleri, %0,25 fenol kırmızısı eklenmiş steril buz gibi soğuk PBS ile 3,3 × 10⁶ EID₅₀ konsantrasyonuna seyreltin. NS1-GFP suşu kullanılıyorsa, virüsü nanolitre başına yaklaşık 1,5 × 10² PFU olacak şekilde seyreltin.Eş zamanlı olarak, enfekte edilmemiş tavuk yumurtalarından alınan allantoik sıvının virüse benzer şekilde seyreltildiği bir kontrol grubu hazırlayın. Ardından, mikro yükleyici uçlar kullanarak virüs solüsyonunu mikroenjeksiyon iğnelerine pipetleyin ve mikroenjeksiyon iğnesini enjeksiyon cihazının uygun tutucusuna yerleştirin. Metin protokolüne göre iğneyi kestikten sonra, istenen enjeksiyon hacmine ulaşılana kadar basınç enjektöründeki basınç ve zamanlama ayarlarını düzenleyin ve/veya iğne ucunu yeniden kesin.Embriyolar anestezi edildikten sonra, 10 ila 20 embriyoyu yüzde iki'lik agaroz plakasına aktarmak için plastik bir pipet kullanın ve fazla sıvıyı uzaklaştırmak için pipetleme yapın. Stereomikroskop altında, cuvier kanalı veya posterior kardinal ven mikroenjeksiyon iğnesiyle aynı hizaya gelecek şekilde embriyoları nazikçe hizalamak ve yönlendirmek için ateşle cilalanmış ve kapatılmış borosilikat cam kapiler kullanın. IAV mikroenjeksiyonunu gerçekleştirmek için, mikroenjeksiyon iğnesini nazikçe cuvier kanalına veya posterior kardinal vene yerleştirin.Ardından, embriyonun dolaşım sistemine istenen hacimde IAV enjekte etmek için ayak pedalına basın. Sistemik bir enfeksiyon sağlamak için, enjeksiyon bolusunun dolaşıma katılması ve vücut geneline dağılması kritik önem taşır. Bolus enfeksiyon bölgesinde toplanırsa, embriyoyu deneyden çıkarın ve ötanazi uygulayın.Döllenmeden beş gün sonra, bu videonun önceki kısımlarında açıklandığı şekilde iğneleri hazırlayın. Şişmiş hava keselerine sahip TG MPX mCherry larvalarını az önce gösterildiği gibi hizalayın; ancak larvaları, iğnenin hava kesesini delebileceği ve virüsün hava kesesinin posterior kısmına bırakılabileceği şekilde konumlandırın. Mikroenjeksiyon iğnesini nazikçe hava kesesine yerleştirin ve istenen hacmi organın posterior kısmına doğru enjekte edin.Enjeksiyon solüsyonu arka kısımda toplanmalı ve hava kesesinin hava kabarcığı öne doğru itilmelidir. Hava kesesi enfeksiyonu sağlamak için, enjeksiyon bolusunun hava kesesinin arka kısmında toplanması ve hava kabarcığının öne doğru yer değiştirmesine neden olması kritik öneme sahiptir. GFP ekspresyonu, enjeksiyondan sonra üç saat kadar erken bir sürede gözlemlenmeye başlanmalıdır.Kontrol çözeltileri de dahil olmak üzere enjeksiyonları tamamladıktan sonra, larvaları steril yumurta suyu içeren Petri kaplarına aktarın ve balıkları 33 °C'de inkübe edin. Antiviral ilaç uygulamasını gerçekleştirmek için, enfeksiyondan üç saat sonra, NS1-GFP ve kontrol grubu enfekte balıkların yumurta suyunu 0, 16,7 veya 33,3 ng/mL Zanamivir içeren steril su ile değiştirin. Enjeksiyondan 24 ila 48 saat sonra, letarji belirtileri ve ödem kanıtları, pigmentasyon farkları, oküler ve kraniofasiyal deformiteler ile lordoz dahil olmak üzere hastalık patolojisiyle ilişkili enfeksiyon dinamikleri hakkında gözlemleri kaydetmeye başlayın.Enfeksiyon sonrası beş gün boyunca her 24 saatte bir ölü, morbit ve sağlıklı larva sayısını kaydedin. Verileri, Y ekseninde sağlıklı, morbit veya ölü balıkların yüzdeleri ve X ekseninde ise tedavi grubunun yer aldığı yığılmış bir sütun grafiği olarak çizin. Görüntüleme için zebrafish'leri sabitlemek amacıyla, NS1-GFP ile enfekte edilmiş tek bir transgenik MPX mCherry larvayı, 24 kuyucuklu cam tabanlı bir plakanın kuyucuğuna ve küçük bir yumurta suyu damlasına transfer edin.Diğer IAV enfekte ve kontrol balıklarıyla işlemi tekrarlayın. Büyük hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat ederek, her bir kuyucuğa yüzde bir oranında agaroz embriyo montaj ortamı yavaşça ekleyin. Her bir larva yan tarafı üzerine monte edilecek şekilde konumunu nazikçe ayarlayın.Agaroz jelleştikten sonra, her bir kuyucuğu dikkatlice doldurmak için litre başına 200 mikrogram trikayn içeren yumurta suyu kullanın. Konfokal mikroskop ve yüzme kesesine odaklanmış 20 kat objektif ile parlak alan ve floresan görüntülerden oluşan bir z stack serisi yakalayın. IAV enfekte ve kontrol enjeksiyonu yapılan zebra balıklarının yüzme keselerinde bulunan MPX mCherry pozitif nötrofil sayısını belirleyin ve karşılaştırın.Burada, zebrafishlerdeki sistemik IAV enfeksiyonunun ilaç etkinliğini test etmek için nasıl kullanılabileceğini temsil eden veriler gösterilmektedir. Viral enfeksiyonu başlatmak için 48 HPF'deki embriyolara duct of cuvier aracılığıyla APR8, X31 veya NS1-GFP enjekte edilmiştir. Viral enfeksiyon için kontrol görevi gören embriyolara 48 HPF'de enjeksiyon yapılmıştır.Enfeksiyondan 48 saat sonra, IAV enjekte edilen zebra balıklarında perikardiyal ödem ve eritrositlerin tüm perikardyum boyunca mevcut olduğu dolaşım durması bulguları görülmüştür. Zanamivir'e maruz bırakılmayan enfekte balıklarda, sistemik GFP ekspresyonunda ödem özellikleri gözlemlenmiştir. Zanamivir'e maruz kalan NS1-GFP enfekte larvalarda, GFP floresanında azalmış makroskobik patoloji gözlemlenmiştir.Lokalize zebra balığı yüzme kesesi enfeksiyon modelinin kullanıldığı bu deneyde, fertilizasyondan beş gün sonraki transgenik MPX mCherry larvalarının yüzme keselerine NS1-GFP virüsü enjekte edilmiş ve mCherry ile işaretlenmiş nötrofillerin yüzme kesesine göçü takip edilmiştir. Enfeksiyondan 20 saat sonra, PBS enjekte edilen kontrollere kıyasla IAV enfekte balıkların yüzme keselerine önemli miktarda nötrofil göçü gözlemlenmiştir; bu durum, IAV'nin tıpkı insan akciğerine nötrofil topladığı gibi yüzme kesesine de nötrofil toplayabildiğini göstermektedir. Bu tekniklerin etkileri, nihayetinde kliniğe aktarılabilecek olan konakçı influenza A virüsü veya IAV etkileşimlerine dair kritik içgörüler ortaya çıkarma potansiyelleri nedeniyle antiviral tedavilere kadar uzanmaktadır.İnfluenza ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken aşılama ve uygun KKE kullanımı dahil olmak üzere önlemler her zaman alınmalıdır.

using-zebrafish-models-human-influenza-virus-infections-to-screen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada immün-modülatör biyoaktif bileflikler tanımlanmasını amaçlayan bir roman yüksek içeriği kimyasal yolla oluşan inflamasyon testi açıklar. Biz başarıyla inflamatuvar yanıt olarak daha fazla veri işleme, analiz, madencilik ve depolama otomatik ölçümü sağlayan özel geliştirilmiş yazılım komut ile otomatik mikroskopi birleştirdik.

Kolaylaştırılması İlaç Keşfi: Zebra balığı An Otomatik Yüksek içeriği Enflamasyon Assay

Burada, geliştirmek için sistematik bir yaklaşım sunmak fizyolojik, ilgili duyarlı ve...

Br.rerio kullanarak Morbid İnsan Genomu İn Vivo Modelleme

Bu video makalede, başarılı bir bütün omurgalı hayvan organizmayı kullanarak bileşik test ve ilaç keşfi için yeni bir güçlü bir araç sağlayan Zebra balığı embriyolarının büyük sayıda bulaştırmak ve analiz etmek için kurulmuştur yüksek kapasiteli boru hattı açıklanır.

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak

Zebra balığı omurgalı gelişimsel süreçleri ve model insan hastalığı araştırmak için mükemmel bir deneysel organizmadır. Burada, bir ile zebra balığı embriyolarının bir manuel yüksek verimli kimyasal ekran gerçekleştirmek için nasıl bir protokol tarif Okuması in situ hibridizasyon (VVISH) içinde tüm montaj.

Zebra balığı Embriyolar kullanılarak Yüksek verim Yaklaşıyor A Manuel Küçük Molekül Ekran

İn vivo patojen ve immün savunmanın mukozal düzeydeki uzaysal-zamansal etkileşimleri, mevcut omurgalı konakçılarında kolayca görüntülenemez. Burada sunulan yöntem, genç zebra balığının yüzme kesesini bir enfeksiyon bölgesi olarak kullanarak canlı omurgalılarda mukozal kandidiyazisi incelemek için çok yönlü bir platformu tanımlamaktadır.

Swimbladder Enjeksiyon ile Larva Zebra balığı Mukozal Candidiazis Modelleme

Optik olarak şeffaf zebra balığı embriyoları, patojenik mikroorganizmalar ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri gerçek zamanlı olarak incelemek ve görselleştirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Mycobacterium abscessus'un mikro enjeksiyonu, floresan görüntüleme ile birlikte, zebra balığı embriyolarında kordon oluşumu gibi temel patojenik özellikleri incelemek için kullanılır.

Görüntüleme Patogenez ve Cording Deşifre ve<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Zebra balığı Embriyolar

Grip A virüs (IAVs) önemli insan solunum patojenler vardır. İnsan fizyolojisi taklit hayvan modelleri IAVs patojenitesi anlamak ve preklinik roman aşı yaklaşımlar sınamasını gerçekleştirmek için gereklidir. Burada, biz IAV Patogenez, humoral yanıt ve enfeksiyon bir fare modeli kullanarak aşı etkinliğini değerlendirmek için teknikler açıklanmaktadır.

Grip A virüs enfeksiyonu bir fare modeli çalışmalarda

Burada, içinde bir yetişkin zebra balığı kendi doğal patojen Mycobacterium marinumkullanarak bir iletişim kuralı modeli insan tüberküloz için mevcut. Ayıklanan DNA ve RNA gelen virüslü zebra balığı iç organlarının balıklar ve ana bilgisayarın bağışıklık yanıtı qPCR ile toplam Mikobakteriyel yükler ortaya çıkarmak için kullanılabilir.

Tüberküloz Mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebra balığı içinde modelleme

Zebrabalığı ksenogreft modelleri, in vivo mikroortamda yüksek üretimli ilaç taraması ve insan kanser hücrelerinin floresan görüntülemesini sağlar. Zebra balığında hasta kaynaklı lösemi örnekleri üzerinde otomatik floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi kullanılarak büyük ölçekli, otomatik ilaç taraması için bir iş akışı geliştirdik.

Zebrabalığında Primer Hasta Kaynaklı Tümör Xenograftların İlaç Taraması

Bu protokol zebra balığı larvalarında bir Aspergillus enfeksiyon modelini açıklar. Aspergillus sporları larvaların arka beyinlerine mikroenjeksiyona sokuldu ve immünosupresyona neden olmak için kimyasal tedavi kullanıldı. Enfeksiyon ilerlemesi, mantar büyümesini ve immün yanıtları ve canlı sporların koloni oluşturan birim kaplama ile numaralandırılmasını izlemek için günlük görüntüleme kurulumu ile izlenir.

Konakçı-Patojen Etkileşimlerinin Analizi için Zebra Balığı Larvalarının Aspergillus Sporları ile Enfeksiyonu

Öğrenin, insan influenza A virüs enfeksiyonlarını zebra balığı modelleri kullanarak antiviral ilaçları tarama ve konak bağışıklık hücre yanıtlarını karakterize etme yöntemlerini. Bu teknikler optik berraklık sayesinde yüksek verimli tarama imkanı sunar.

İnsan İnfluenza A Virüs Enfeksiyonları Zebra balığı Modeller Kullanılarak Antiviral İlaçlar Ekran ve Host Bağışıklık Hücre Yanıtları karakterize etmek (Video) | JoVE Journal

İnsan İnfluenza A Virüs Enfeksiyonları Zebra balığı Modeller Kullanılarak Antiviral İlaçlar Ekran ve Host Bağışıklık Hücre Yanıtları karakterize etmek

Daha fazla video keşfet