Name: Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Öğrenin, ökaryotik hücrelerde protein komplekslerini tandem affinity arıtma yöntemiyle izole etmeyi. Bu teknik, yeni etkileşimleri ve post-translasyonel modifikasyonları belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu yayında bildirilen araştırma, NIH Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (NIAID) tarafından R01AI114362 numaralı ödül ve Welch Vakfı'nın Iván D'Orso'ya verdiği I-1782 hibesi altında desteklenmiştir.

1. Kaplama Hücreler <ol><li> Bir gün, transfeksiyondan önce,% 10 (h / h) cenin sığır serumu (FBS) ve% 1 (h / h), penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) içinde 10 mL 3.5 x 10 6 HEK293T hücreleri plaka 100 mm tabak başına (10.000 U / ml stok). Plaka 3 - Deney / durum başına 5 100 mm yemekleri yeterli protein iyileşme sağlamak için. Not: plakaların sayısı ilgili protein kompleksi ifade seviyeleri ve çözünürlüğüne bağlı olacaktır, her bir deney / durum için tespit edilmesi gerekir. Daha büyük ölçekli saflaştırma gerektiğinde, alternatif olarak, hücre çizgileri döndürücü şişelere 2 süspansiyonlar büyümeye adapte edilebilir, ancak bu yöntem, geçici nakiller için çalışmaz. </li></ol> 2. Kararlı Hücre Hatları hücrelerin transfekte ya da indükleyici <ol><li> Ertesi gün, mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. proce önce% 80 konfluent - Hücreler 70 olmalıEding. </li><li> 100 mm tabak başına transfeksiyon reaktifi 7 plasmid DNA ug ve 21 ul toplam karışımı hücreleri transfekte. Transfeksiyon etkinliğindeki için bir kontrol olarak, bir vektör ifade GFP (Tablo 1) ile transfekt hücre. Not: doksisiklin 14, 15 karşılık olarak iki veya daha fazla kompleks alt birimleri ekspresyonunu indükleyen bir HEK293-T-Rex veya benzer sabit bir hücre doğrusu kullanılıyorsa, indükleyici hücrelere ilave edildi ve 48 saat süre ile inkübe edilmesi gerekecektir. Benzer şekilde, indükleyici ilave edilmesi üzerine GFP ekspresyonunu indükleyen bir dengeli hücre çizgisi, aynı zamanda, doğrulama için gerekli olacaktır. 2.7 adıma geçin. </li><li> 100 mm tabak başına transfeksiyon karışımı hazırlayın. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, (iki veya daha fazla plazmidin tekabül eder) toplam plazmid DNA 7 ug katkısız DMEM 500 ul karıştırın. Ayrı bir mikrosantrifüj tüpü içinde, katkısız DMEM wi 500 ul karışımıtransfeksiyon reaktifi inci 21 ul. Her transfeksiyon reaksiyon için tekrarlayın. </li><li> plazmid DNA çözeltisi içine transfeksiyon reaktif çözüm pipetle (ters çözüm karışmaz). en az 4 kez pipetleme karıştırın. </li><li> 10, oda sıcaklığında, bu karışım inkübe - 15 dakika, ancak artık, 15 dakika daha. </li><li> Bir medya rezervuar oluşturmak ve dikkatle hücreleri bozmadan plaka iç yüzüne damla damla transfeksiyon karışımı pipetle için plaka yatırın. orijinal düz konumuna çanak dönün ve karışım dağıtmak için hafifçe döndürün. </li><li> (Bu durum, bundan sonra &quot;doku kültür inkübatörü&quot; olarak da adlandırılır),% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. Medya 5 saat sonrası transfeksiyon (opsiyonel) değiştirin. </li></ol> 3. kontrolü Transfeksiyon veya İndüksiyon Verimlilik <ol><li> 24 saat sonrası transfeksiyon at, bir grip altında hücrelerin görselleştirmekFlüoresan mikroskop transfeksiyon verimliliği (ya da GFP ifade kontrol HEK293T-rex istikrarlı bir hücre hattı indüksiyonu) kontrol etmek için. bir 24 saat daha inkübe edilir. </li></ol> 4. STREP Affinity saflaştırma (STREP AP) <ol><li> hücrelerin toplanması <ol><li> 48 saat sonra transfeksiyon da ortamını çıkarın ve soğuk 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 8 ml ekleyin. plaka hücreleri ayırmak için aşağı yukarı pipet ve. </li><li> Toplayın ve 15 ml tüp içine hücre süspansiyonu aktarmak ve 4 ° C&#39;de 4 dakika boyunca 800 xg&#39;de hücreleri aşağı doğru döndürün. </li><li> PBS süpernatantı. herhangi bir artık PBS ortadan kaldırmak için (4 ° C &#39;de 1 dakika boyunca 800 x g) döndürme aşağı tekrarlayın. ileride kullanmak üzere -80 ° C&#39;de hücre pelletini Mağaza veya protein saflaştırma devam etmek için aşağıdaki prosedürü uygulayın. </li></ol></li><li> hücrelerin çözülmesi <ol><li> Pasif Lizis Tamponu hücre peleti hacmi x 5 kullanılarak hücre peletleri (~ plaka başına 250 ul) yeniden süspanse edin(PLB: 20 mM Tris-HCI pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM DTT, proteaz önleyici kokteyl tablet,% 5 h / h gliserol, ve% 1.0 NP-40) ile bir hücre süspansiyonu aktarmak 1.5 ml mikrosantrifüj tüp. </li><li> Kısaca, 4 ° C&#39;de 30 dakika süre ile süspansiyon ve nutate girdap. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de hücre süspansiyonu dönerler. </li><li> Yeni 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine çözünür lizatları aktarın ve hücre pelletleri atın. gibi çözülebilir lizat son hacminin% 10 Kaydet &quot;STREP AP girişi.&quot; 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> STREP boncuk dengeleme NOT: İlk AP adım için kullanın STREP boncuk! STREP boncuk BAYRAK boncuklar ile aşağı çekti göre anlamlı olarak daha fazla protein kurtarmak ile kompleksler aşağı çekti. <ol><li> çıkartın (n 40 ul ×) + n% 50 STREP boncuk bulamacı ul (n = örnek sayısı) ve 4 ° C&#39;de 2 dakika süreyle 1500 xg&#39;de aşağı doğru döndürün. NOT: Geniş m kullanınpipet tanelerine outhed ipuçları. </li><li> Süpernatantı ve boncuk PLB 500 ul ekleyin. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca boncuk karışımı Nutate. 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 1500 x g&#39;de Spin. <ol><li> 3 yıkama toplam tekrarlayın. 40 ul x n nihai bir hacme kadar PLB boncuk tekrar. </li></ol></li><li> 4 ° C&#39;de 2 saat boyunca her bir hücre lizatı numunesi ve nutate% 50 STREP boncuk çamuru 40 ul ekle. </li></ol></li><li> STREP AP <ol><li> 4 ° C&#39;de 2 dakika süreyle 1500 xg&#39;de çözüm aşağı doğru döndürün. </li><li> 4 ° C&#39;de &quot;STREP AP Akış-through (FT)&quot; olarak supernatant ve mağaza çıkarın. </li><li> I (20 mM Tris-HCI pH 7.5, 250 mM NaCI, 1.5 mM MgCl2, 1 mM DTT,% 5 gliserol ve% 0.2 NP-40) STREP AP Yıkama Tamponu tanelere 500 ul ekle. 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 1500 x g&#39;de 5, 4 ° C&#39;de dakikada santrifüj için boncuk karışımı Nutate. süpernatant atın. <ol><li> 4 yıkar toplam için tekrarlayın. <br/&gt; NOT: Dördüncü yıkamadan önce, protein arka plan azaltmak için yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp boncuk çözüm aktarın. Bu adım gereklidir. </li></ol></li><li> 500 ul yıkama tamponu II (100 mM Tris-HCI, pH 8.0, 150 mM NaCl ve 1 mM EDTA) ilave edilir ve tüpler ters çevrilerek boncuk dengeye. 4 ° C&#39;de 2 dakika süreyle 1500 xg&#39;de Spin ve süpernatant atın. </li><li> STREP elüsyon tamponu (100 mM Tris-HCI, pH 8.0, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA ve 2.5 mM destiobiyotin) 50 ul ilgili proteini Zehir. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 800 rpm&#39;de vorteksleyin. </li><li> 4 ° C&#39;de 1 dakika için 1500 x g&#39;de boncuk Spin. süpernatant toplayın. Bu fraksiyon &quot;STREP AP elüsyon&quot; örnek karşılık gelir. </li><li> İlk elüsyon ile elde edilen protein miktarının yarısı kadar verim olabilir ikinci elüsyon, 4 ° C &#39;de boncuk fraksiyonu kaydedin. gümüş boyama ve / veya batı blot STREP AP Tasfiye Kısım 10%16. </li></ol></li><li> BAYRAK boncuk dengeleme <ol><li> (Nx 16 ul) + n BAYRAK boncuk çözümünün ul (numune n = sayı) çıkarın ve 4 ° C&#39;de 2 dakika süreyle 1500 xg&#39;de aşağı doğru döndürün. NOT: pipet boncuk geniş ağızlı ipuçlarını kullanın. </li><li> Süpernatantı ve FLAG yıkama tamponu 500 ul ekle (100 mM Tris-HCI, pH 8.0, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA ve% 0.1 NP-40) ile boncuklara. 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 1500 x g&#39;de Spin. 3 yıkama toplam tekrarlayın. </li><li> nx 16 ul bir son hacme FLAG yıkama tamponu boncuk tekrar. </li><li> 4 ° C &#39;de geri kalan STREP AP elüsyon ve nutate gece boyunca FLAG boncuk çamuru 16 ul ekle. </li></ol></li></ol> 5. BAYRAK IP <ol><li> 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 1500 x g&#39;de FLAG boncuk süspansiyonu dönerler. 4 ° C&#39;de &quot;BAYRAK IP Akış-through&quot; (FT) olarak süpernatant ve mağaza kaydedin. </li><li> 500 ekle81; çözeltiye FLAG yıkama tamponu. 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 1500 x g&#39;de 5, 4 ° C&#39;de dakikada santrifüj için Nutate. 4 yıkar toplam tekrarlayın ve her yıkamadan sonra süpernatant kaldırmak. NOT: Dördüncü yıkamadan önce, arka plan azaltmak için yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne protein boncuk çözüm aktarın. Bu adım gereklidir. </li><li> Final spin süpernatantı ve boncuk haline FLAG peptit 200 ng / ul içeren BAYRAK yıkama tamponu 30 uL ekleyin. 4 ° C&#39;de 2 saat boyunca 800 rpm&#39;de vorteksleyin. </li><li> 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 1500 x g&#39;de süspansiyon Spin. olarak 4 ° C&#39;de supernatant ve mağaza Hasat &quot;FLAG IP Elüsyon.&quot; NOT: elüsyon numuneleri standart protokoller 16 kullanılarak gümüş leke ve / veya western blot ile teyit ve daha fazla protein deneyleri için hazır olabilir. (1) STREP AP Giriş, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Eluti: Batı leke kurarken, aşağıdaki örneklerin hepsi koşmak(4) BAYRAK IP FT, ve (5) BAYRAK IP Tasfiye üzerinde. Yüklenen Birimleri her bir deney için belirlenecek gerekecektir. Toplanan tüm örnekler ve boncuk kısa süreli depolama ve uzun süreli depolama için -80 ° C &#39;de 4 ° C&#39; de muhafaza edilebilir. TAP örnekleri, bileşenlerinin kimliğini doğrulamak için yeni bir post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) tespit etmek, ve / veya saflaştırılmış kompleksi 2, 17 ile herhangi bir yeni protein etkileşimi keşfetmek için kütle spektrometresi ile analiz edilmiştir. Bu amaçla, Coomassie jel veya gümüş leke çalıştırdıktan sonra, bantlar, temiz bir neşter kullanılarak jelden edilebilir. Kütle spektrometresi yöntemlerini tartışmak birkaç mükemmel değerlendirmeleri daha önce, 19 18 yayınlandı. </li></ol>

<ol><li>Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network-based+prediction+of+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Network-based prediction of protein function.</a> Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).</li>
<li>Jager, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+HIV-human+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of HIV-human protein complexes.</a> Nature. 481, 365-370 (2012).</li>
<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340, 245-246 (1989).</li>
<li>Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+two-hybrid+system%3A+a+complementary+approach+to+the+yeast+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system.</a> Biotechniques. 22, 350-352 (1997).</li>
<li>Lee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coimmunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Coimmunoprecipitation assay.</a> Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Jager, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+HIV-human+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of HIV-human protein complexes.</a> Methods. 53, 13-19 (2011).</li>
<li>Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-TEFb%2C+a+cyclin-dependent+kinase+controlling+elongation+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II.</a> Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).</li>
<li>Peterlin, B. M., Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+elongation+phase+of+transcription+with+P-TEFb%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb.</a> Mol Cell. 23, 297-305 (2006).</li>
<li>McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+mediate+the+enzymatic+disassembly+of+promoter-bound+7SK+snRNP+to+locally+recruit+P-TEFb+for+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation.</a> Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).</li>
<li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II%3A+emerging+roles+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).</li>
<li>D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((7SKiing+on+chromatin%3A+move+globally%2C+act+locally%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">7SKiing on chromatin: move globally, act locally.</a> RNA Biol. 13, 545-553 (2016).</li>
<li>McNamara, R. P., Bacon, C. W., D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+Elongation+Control+by+the+7SK+snRNP+Complex%3A+Releasing+the+Pause%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause.</a> Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).</li>
<li>Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline+repressor%2C+tetR%2C+rather+than+the+tetR-mammalian+cell+transcription+factor+fusion+derivatives%2C+regulates+inducible+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells.</a> Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).</li>
<li>McNamara, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KAP1+Recruitment+of+the+7SK+snRNP+Complex+to+Promoters+Enables+Transcription+Elongation+by+RNA+Polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II.</a> Mol Cell. 61, 39-53 (2016).</li>
<li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).</li>
<li>Trudgian, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+label-free+SINQ+normalized+spectral+index+quantitation+in+the+central+proteomics+facilities+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline.</a> Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).</li>
<li>Choudhary, C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+signalling+networks+by+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).</li>
<li>Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics+and+network+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics and network biology.</a> Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).</li>
<li>Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+sequences+common+to+rapidly+degraded+proteins%3A+the+PEST+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis.</a> Science. 234, 364-368 (1986).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

İfade ve ökaryotik hücrelerde protein komplekslerinin izolasyonu için açıklanan protokol, moleküler düzeneklerinin biyokimyasal karakterizasyonu ile sınırlı değildir, aynı zamanda işlevini düzenleyen olabilir yeni interactors ve post-translasyonel modifikasyonlar tanımlanması için de kullanılabilir. afinite etiketleri kullanımı Bu protokolde belirtilen ne ile sınırlı değildir; ancak deneyimi ilk AP adım olarak Strep kullanımı ile önemli ölçüde nihai protein-protein kompleksinin verimi artırır göstermektedir. Hem ve STRE...

<html> Protein-protein etkileşimleri (PPİ) işlevleri yaklaşık 2 bilgilendirebilir biyolojik süreçler 1, bu PPI üzerinde ileri çalışmalar hassas düzenlenmesi için kritik öneme sahiptir. Çeşitli yaklaşımlar PPI çalışma ve karakterizasyonu için, ayrıca bu yeni düzenleyici protein bileşenlerinin de novo tanımlanması için geliştirilmiştir. 1989 yılında, Stanley Alanlar ve arkadaşları maya iki hibrit (Y2H) tahlil 3 bildirdi. Bu yaklaşım, Saccharomyces cerevisiae &#39;interactors oranı (yem) tanımlanmış bir protein için (avlayan) tarafsız ve kapsamlı bir tanımlanmasına izin verir. PPIs keşfetmek için dikkate değer yardımcı ek olarak, Y2H deneyi, maya hücrelerinde protein çiftleri karakterize az etkileşim alanları tanımlamak ve bu etkileşimi ortadan kaldırmak başkalaşımların teşhis edilmesi için kullanılabilir. Y2H deneyi değiştirerek, PPIs, aynı zamanda, memeli hücrelerinde incelenebilirclass = &quot;xref&quot;&gt; 4. Y2H tahlilinde (örneğin, maya, üç-hibrid sistemi) varyasyonları da protein-RNA ve hücrelerde protein küçük organik ligand etkileşimlerini incelemek için uygulanabilir. Homolog bir sistemde PPIs incelemek için bir başka genel olarak kullanılan bir araç ko-immünopresipitasyon (ko-IP) deney 5&#39;tir. ilgili bir proteini immünopresipitasyon bir antikor kullanılarak, CO-IP deney araştırmacılar, çeşitli çevre koşulları ve deneysel durumlarda hücrelere PPI izlemesine izin verir. Epitop etiketli proteinler (örneğin, FLAG, myc, Strep ve HA, diğerleri arasında) afinite temizliği (AP) yöntemleri, batı lekesi de dahil olmak üzere çok sayıda alt-tahliller için kompleks protein karışımları proteinlerin izole edilmesini kolaylaştırmıştır, gümüş leke kullanımı ve enzimatik analizi. Bununla birlikte, bu daha önceki yaklaşımların hiçbiri, in vitro bir de dahil olmak üzere daha ayrıntılı karakterizasyon için protein kompleksleri büyük miktarlarda izole edilmesini sağlamakssays, kütle spektrometresi, ve post-translasyonel modifikasyonlar tanımlanması ile düzenleyici alt birimlerin bulunması. AP yöntemin geliştirilmiş bir versiyonu, iki takip eden AP 6, 7 aracılığıyla saflaştırılır iki epitop bir füzyon proteini oluşturarak PPIs çalışmak için bir saflaştırma tekniğidir Tandem AP (TAP) olarak adlandırılır. Bu makalede, iki alt birimi farklı epitoplar ile etiketlenir ve daha sonra iki ardışık AP (STREP AP FLAG IP elde edilmiş) ile saflaştırılmış edildiği arıtma protein kompleksleri TAP yöntemin bir varyasyonu sunulmuştur. Araştırmacılar kendi ilgi protein kompleksine bunları uygulamak, böylece Biz ilk, TAP minimalist bakış (Şekil 1) ve sonra tüm deneysel adımlar ayrıntılı bir açıklama (Şekil 2) sağlarlar. TAP yöntemin uygulanabilirliğini göstermek için, (karmaşık, iyi karakterize edilmiş siklin cdk PT şu şekilde de ifade seçtikDüzenleyici alt birim, siklin T1 (CycT1) ve bir kinaz (CDK9) oluşmaktadır, ve RNA polimeraz II (pol II), 8, 9, 10 ile transkripsiyonun düzenlenmesinde görevli EFP kinaz). P-TEFb Pol II ve promoter de transkripsiyon duraklatma hafifletir ilişkili olumsuz uzama faktörleri, C-terminal sahasını fosforilleyen ve böylece transkripsiyon uzama 11, 12, 13 kolaylaştırır. Bu akılda bilinen etkileşim sayesinde, CycT1 STREP-etiketli ve FLAG-etiketli CDK9 HEK293T hücrelerinde ifade üzerindeydi. Bir karşılıklı TAP deney daha protein etkileşim kullanılan epitopların bağımsız olduğunu doğrulamak için STREP etiketli CDK9 ve FLAG-etiketli CycT1 ile gerçekleştirildi. Hücreler toplandı ve 48 saat sonra transfeksiyon parçalanmıştır. Çözünür lizat TAP ile saflaştırılmıştır (STREP AP FLAG ardındanIP). Giriş ve saflaştırılmış proteinler Western blot ve gümüş leke (Şekil 3) ile analiz edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td> <td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri/Hyclone</td><td>SH3002.2FS</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>MP Biyomedikaller</td><td>MP091670049</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratuvarları</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11836153001</tr><tr><td>STREP-Tactin Superflow</td><td>IBA Yaşam Bilimleri</td><td>2-1208-010</td><td></td></tr><tr><td>STREP-etiket elüsyon tamponu</td><td>IBA Yaşam Bilimleri</td><td>2-1000-025</td><td></td></tr><tr><td>EZview Kırmızı ANTI-FLAG M2 Afinite Jeli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2426</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm ve zamanlar; 20 mm stil çanak hücre kültürü ile muamele edilmiş pirojenik olmayan polistiren 20 / kol</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>430167</tr><tr><td>Protein Lo-Bind Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Dijital Vorteks Karıştırıcı</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>48 delikli mikro tüp köpük raf</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-386</td><td></td></tr><tr><td>Labquake çalkalayıcı et lokantası&nbsp;</td><td>Termo&nbsp;</td><td>415110</td><td></td></tr></tbody></table>

Ökaryotik hücrelerde protein kompleksleri tandem affinity arıtma

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Aktif protein-protein, protein-nükleik asit komplekslerinin saflaştırılması enzimsel faaliyetlerin ve yeni alt birimleri ve post-translasyonel modifikasyonlar de novo tanımlanması karakterizasyonu için çok önemlidir. Bakteriyel sistemlerde bir polipeptidler ve protein kompleksleri çok çeşitli ekspresyon ve saflaştırma için izin verir. Bununla birlikte, bu sistem, post-translasyonel modifikasyonları (örneğin, fosforilasyon ve asetilasyon) içeren protein alt birimlerinin temizleme, ve ökaryotik sisteminde ifade, sadece mevcut olan yeni düzenleyici alt birimlerin / belirlenmesini sağlamaz. Burada, ökaryotik hücrelerden geçici veya stabil ifade epitop etiketli proteinler ile protein komplekslerinin saflaştırılması kolaylaştıran bir roman, sağlam ve streptokok kullanarak verimli tandem yakınlık arıtma (TAP) yöntemiyle ve FLAG-etiketli proteinlerin ayrıntılı bir açıklama sağlar. Bu protokol, Prot karakterize uygulanabilirein karmaşık işlevsellik, kompleks alt birimlerin üzerine post-translasyonel modifikasyonlar keşfetmek ve kütle spektrometresi ile yeni düzenleyici kompleks bileşenleri tanımlamak için. Özellikle, bu TAP yöntemi ve böylece alt deney imkanları geniş bir dizi elde ökaryotik veya patojenik (viral ve bakteriyel) bileşenlerinin oluşturduğu protein kompleksleri çalışma uygulanabilir. Biz protein kompleksleri ile çalışan araştırmacılar, çok farklı şekillerde bu yaklaşımı kullanmak olabilir öneriyoruz.

Bu yazıda, (aynı zamanda P-TEFb kinaz olarak da bilinir), karmaşık iyi karakterize CycT1-CDK9 TAP yönteminin uygulanabilirliğini göstermek. Ve CDK9,-FLAG (CDK9: F) ya da CDK9-Strep (CDK9: G) ve siklin T1 bayrağı (CycT1: F): Sikline T1 Strep (s CycT1) kodlayan plazmidler (Tablo 1), HEK293T hücrelerine transfekte edildi . F ya da CycT1: (sırasıyla Şekil 3A ve B,) F plazmitleri N...

Burada, ökaryotik hücrelerden protein komplekslerinin ekspresyonu, izolasyonu ve karakterizasyonu için yeni, sağlam ve verimli bir tandem afinite saflaştırma (TAP) yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol, ayrık komplekslerin biyokimyasal karakterizasyonunun yanı sıra yeni interaktörlerin ve işlevlerini düzenleyen translasyon sonrası modifikasyonların tanımlanması için kullanılabilir.

Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Bu tandem afinite saflaştırma yönteminin genel amacı, biyokimyasal karakterizasyon, moleküler düzenlemeler ile fonksiyonlarını düzenleyen yeni etkileşimcilerin vele post-translasyonel modifikasyonların belirlenmesi için ökaryotik hücrelerden eksprese edilen protein komplekslerini izole etmektir. Bu yöntem, ökaryotik hücrelerden bozulmamış protein komplekslerinin saflaştırılmasını sağlayarak, fonksiyonlarını hassas bir şekilde ayarlayan yeni etkileşimcilerin ve düzenleyici post-translasyonel modifikasyonların tanımlanmasına imkan tanır. Bu tekniğin temel avantajı, protein komplekslerinin fonksiyon ve aktivitelerini incelemek için yapılacak sonraki in vitro uygulamalar için yüksek saflık ve verim sağlamasıdır.Hücreler, transfeksiyondan 48 saat sonra STREP afinite saflaştırmasıyla toplanır. Besiyeri uzaklaştırılır ve sekiz mililitre soğuk PBS eklenir. Hücreleri plakadan ayırmak için pipetle yukarı-aşağı çekme işlemi uygulanır.Hücre süspansiyonunu toplayıp 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücreleri 4 °C'de 800 ×g ile dört dakika boyunca santrifüjleyin. PBS süpernatanını uzaklaştırın. Kalan PBS'yi tamamen gidermek için 4 °C'de 800 ×g ile bir dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.Bu pr

tandem-affinity-purification-protein-complexes-from-eukaryotic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Tandem afinite saflaştırma proteinlerine bağlanma ortaklarının belirlenmesi için sağlam bir yaklaşımdır. Kavramı kanıtı olarak, bu metodoloji konak hücre faktörü için inisiyasyon dahil eş-tortu ile iyi karakterize çevirisi başlatma faktörü eIF4E uygulanmıştır. Bu yöntem, kolaylıkla bir hücre ya da viral proteini için uyarlanmıştır.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

Kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde etiketli proteinlerin saflaştırılması Affinity protein etkileşimi ağların sistematik eşleme için ve biyolojik süreçlerin mekanistik temeli araştırmak için güçlü bir yöntem. Burada, bakteri için geliştirilmiş optimize edilmiş sıralı peptid afinite (SPA) antipersonel mayınları prosedürü...

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Bu video, protein-protein etkileşimini incelemek için ökaryotik hücrelerden protein komplekslerini saflaştırmaya yönelik bir teknik olan tandem afinite saflaştırmasını göstermektedir. Kompleks, farklı epitop etiketleriyle etiketlenmiş iki protein içerir. Kompleksin, iki farklı etiket için bir afiniteye sahip iki reçine kullanılarak sıralı bir şekilde saflaştırılması üzerine, elütede her iki proteinin varlığı, ikisi arasındaki etkileşimi doğrular.

Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Tandem Afinite Saflaştırma Testi

Protein kompleksleri önemli hücre fonksiyonlarını katalize eder. Birçok temel komplekslerinin detaylı fonksiyonel ve yapısal karakterizasyonu rekombinant üretimi gerektirir. MultiBac özellikle ökaryotik protein ve kompleksleri ifade etmek için özel bir bakülovirüs / böcek hücre sistemidir. MultiBac açık erişim platformu ve faydayı maksimize için geliştirilmiş standart çalışma prosedürleri olarak uygulanmıştır.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Drosophila ama derinlemesine biyokimyasal analiz uygunluğu için, güçlü genetik manipülasyon ünlüdür. Burada sinek beyin ilgi herhangi bir proteinin etkileşim ortakları belirlemek için TAP-tabanlı bir prosedür mevcut. Bu prosedür, potansiyel araştırma yeni yollar yol açabilir.

Protein-protein etkileşimi belirlenmesi<em&gt; Drosophila</emTandem Affinity Arıtma tarafından&gt; Adult Başlar (TAP)

Tandem Afinite Saflaştırma (TAP) yöntemi, proteomik için başta ökaryotik olmak üzere hücresel ekstrakttan doğal kompleksleri izole etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Burada, yapısal çalışmalar için doğal komplekslerin saflaştırılması için optimize edilmiş bir TAP yöntemi protokolü sunuyoruz.

Bir Tandem Affinity Etiket Yöntemiyle Yapısal Çalışmaları Yerli Komplekslerinin saflaştırılması

Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Protein-protein ve protein-metaboliti etkileşimler tüm hücresel fonksiyonları için önemlidir. Burada, biz seçim bir protein ile bu etkileşimlerin paralel analiz sağlayan bir protokol tanımlamak. Bizim iletişim kuralı bitki hücre kültürleri için optimize edildi ve benzeşme arıtma kütle spektrometresi tabanlı protein ve metaboliti algılama ile birleştirir.

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Burada protein alma kompleksleri (TOC-TIC kompleksi) dokunun etiketini kullanarak kloroplast arıtma için kanıtlanmış ve test iletişim kuralı mevcut. Tek benzeşimi yalıtım Protokolü potansiyel olarak herhangi bir protein için uygulanabilir ve kütle spektrometresi ile yeni etkileşim ortaklar tanımlamak için kullanılan.

Kloroplast Translocon Protein kompleksleri dokunun etiketini kullanarak benzeşme arıtma

Bu makale, bir 6X-histidin etiketi ile etiketlenmiş bir insan rekombinant proteini olan flep endonükleaz 1'in (FEN1) afinite saflaştırılması için bir prosedür sağlar. Protokol, etiketli proteinin saflaştırılması için iki farklı hareketsizleştirilmiş metal iyon kolonunun kullanılmasını içerir.

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması 

Öğrenin, ökaryotik hücrelerde protein komplekslerini tandem affinity arıtma yöntemiyle izole etmeyi. Bu teknik, yeni etkileşimleri ve post-translasyonel modifikasyonları belirlemeye yardımcı olur.

Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma

Daha fazla video keşfet