Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma
January 26th, 2017
Burada, ökaryotik hücrelerden protein komplekslerinin ekspresyonu, izolasyonu ve karakterizasyonu için yeni, sağlam ve verimli bir tandem afinite saflaştırma (TAP) yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol, ayrık komplekslerin biyokimyasal karakterizasyonunun yanı sıra yeni interaktörlerin ve işlevlerini düzenleyen translasyon sonrası modifikasyonların tanımlanması için kullanılabilir.
Bu tandem afinite saflaştırma yönteminin genel amacı, biyokimyasal karakterizasyon ve moleküler montajlar için ökaryotik hücrelerden eksprese edilen protein komplekslerini izole etmek ve işlevlerini düzenleyen yeni interaktörlerin ve translasyon sonrası modifikasyonların tanımlanmasıdır. Bu yöntem, ökaryotik hücrelerden bozulmamış protein komplekslerinin saflaştırılmasını, işlevlerini ince ayar yapan yeni interaktörleri ve düzenleyici translasyon sonrası modifikasyonları tanımlamak için mümkün kılar. Bu tekniğin ana avantajı, işlevlerini ve aktivitelerini incelemek için aşağı akış in vitro uygulamalar için yüksek saflıkta ve protein komplekslerinin verimine izin vermesidir.
Hücreler, transfeksiyondan 48 saat sonra STREP afinite saflaştırmasından toplanır. Ortamı çıkarın ve sekiz mililitre soğuk PBS ekleyin. Hücreleri plakadan ayırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
Hücre süspansiyonunu toplayın ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücreleri dört santigrat derecede dört dakika boyunca 800 kez g'de döndürün. PBS süpernatantını çıkarın. Artık PBS'yi ortadan kaldırmak için dört santigrat derecede bir dakika boyunca 800 kez g'de döndürün.
Bu prosedüre başlamak için, her bir hücre peletini pasif lizis tamponunun veya PLB'nin hücre pelet hacminin beş katı kadar yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Süspansiyonu kısaca girdap haline getirin ve dört santigrat derecede 30 dakika boyunca nutat edin.
Hücre süspansiyonunu dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 10.000 kez g'de döndürün. Çözünür lizatı yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hücre peletini atın. Çözünür lizatın son hacminin %10'unu STREP-AP girişi olarak kaydedin ve dört santigrat derecede saklayın.
İlk afinite saflaştırma adımı için STREP boncuklarının kullanılması önemlidir, çünkü STREP boncukları ile aşağı çekilen kompleksler, FLAG boncukları ile aşağı çekilenlerden önemli ölçüde daha fazla protein geri kazanır. Geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak, afinite saflaştırması için uygun miktarda %50 STREP boncuk bulamacını çıkarın. Dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.500 kez g'de döndürün.
Süpernatanı çıkarın ve boncuklara 500 mikrolitre PLB ekleyin. Boncuk karışımını dört santigrat derecede beş dakika boyunca nutate edin. Tekrar aşağı döndürün.
Üçüncü yıkamadan sonra, süpernatanı çıkarın ve PLB'deki boncukları n kez 40 mikrolitrelik bir nihai hacme yeniden süspanse edin, burada n numune sayısıdır. Her hücre lizat örneğine 40 mikrolitre% 50 STREP boncuk bulamacı ekleyin ve dört santigrat derecede iki saat boyunca nutat edin. Bu protein üretimi ve geri kazanımı sırasında birden fazla hücre plakası kullanılabilir ve farklı plakalardan parçalanan aynı protein örnekleri, STREP afinite saflaştırması sırasında bir kısım boncuk ile birleştirilebilir.
Hücre lizatı ve STREP boncuk bulamaç karışımları iki saat inkübe edildikten sonra, dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.500 kez g'de döndürün. STREP AP akarken süpernatanı saklayın ve dört santigrat derecede saklayın. Boncuklara bir adet 500 mikrolitre STREP AP yıkama tamponu ekleyin.
Boncukları tampon karışımında dört santigrat derecede beş dakika boyunca nutate edin ve dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.500 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve 500 mikrolitre STREP AP yıkama tamponu ile tekrar yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, protein arka planını azaltmak için boncuk çözeltisini yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
STREP AP yıkama tamponu ile dördüncü kez yıkayın. Sıkma işleminden sonra, süpernatanı çıkarın ve 500 mikrolitre yıkama yağı ekleyin. Tüpleri ters çevirerek boncukları dengeleyin ve ardından dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.500 kez g'de döndürün.
Süpernatanı atın. 50 mikrolitre STREP elüsyon tamponu ile ilgilenilen proteini güçlendirin. Dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 800 rpm'de girdap.
Boncukları dört santigrat derecede bir dakika boyunca 1.500 kez g'de döndürün. Süpernatanı topla. Bu fraksiyon, STREP AP elüsyon örneğine karşılık gelir.
İkinci bir elüsyon için boncuk fraksiyonunu dört santigrat derecede saklayın. Gümüş boyama ve / veya Western lekeleme için STREP AP elüsyonunun% 10'unu alın. Sonraki FLAG immünopresipitasyonu için başlangıç materyali miktarını artırmak için, FLAG elüsyonunun daha verimli bir şekilde geri kazanılması için birinci ve ikinci STREP elutiyonları bir araya getirilebilir.
Uygun miktarda FLAG boncuk solüsyonunu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak bu prosedüre başlayın. Dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.500 kez g'de döndürün. Süpernatanı çıkarın ve boncuklara 500 mikrolitre FLAG yıkama tamponu ekleyin.
Dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.500 kez g'de döndürün. Süpernatanı atın ve FLAG yıkama tamponu ile tekrar yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, süpernatanı çıkarın ve boncukları FLAG yıkama tamponunda n çarpı 16 mikrolitrelik bir nihai hacme kadar yeniden süspanse edin, burada n numune sayısıdır.
Kalan STREP AP elüsyonuna 16 mikrolitre FLAG boncuk bulamacı ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede nütatlayın. FLAG boncuk bulamacı ve STREP AP elüsyonunun gece boyunca inkübasyonunu takiben, FLAG immünopresipitasyonuna devam edin. FLAG boncuk süspansiyonunu dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.500 kez g'de döndürün.
FLAG IP akarken süpernatanı koruyun ve dört santigrat derecede saklayın. Boncuklara 500 mikrolitre FLAG yıkama tamponu ekleyin. Dört santigrat derecede beş dakika nutat yapın ve dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.500 kez g'de santrifüjleyin.
Süpernatanı atın ve 500 mikrolitre FLAG yıkama tamponu ile tekrar yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, arka planı azaltmak için protein boncuk çözeltisini yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. FLAG yıkama tamponu ile dördüncü kez yıkayın.
Süpernatanı son dönüşten çıkarın ve boncuklara mikrolitre FLAG peptidi başına 200 nanogram içeren 30 mikrolitre FLAG yıkama tamponu ekleyin. Dört santigrat derecede iki saat boyunca 800 rpm'de girdap. İki saat sonra, süspansiyonu dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.500 kez g'de döndürün.
Süpernatanı hasat edin ve FLAG IP elüsyonu olarak dört santigrat derecede saklayın. Bu videoda, Siklin-T1 CDK9 kompleksine Tandem afinite saflaştırması veya TAP yöntemi uygulandı. STREP etiketli Cyclin-T1 ve FLAG etiketli CKD9, HEK293 T hücrelerinde aşırı eksprese edildi.
STREP etiketli CDK9 ve FLAG etiketli Cyclin-T1 ile karşılıklı bir deney de gerçekleştirildi. Western blot analizi, FLAG etiketli CKD9'un STREP boncuklarından STREP etiketli Cyclin-T1 ile koelüt edildiğini, ancak negatif kontrolde olmadığını, AP'nin STREP etiketli Cyclin-T1'den yoksun olduğunu göstermektedir. Her iki protein de FLAG elüsyonunda tespit edildi ve bu da kompleks oluşumunu daha da doğruladı.
Karşılıklı TAP sonuçları, FLAG etiketli Cyclin-T1'in STREP etiketli CDK9 ile koelüt olduğunu ve Cyclin-T1 CDK9 etkileşiminin kullanılan epitoplardan bağımsız olduğunu daha da doğruladığını göstermektedir. TAP ve karşılıklı TAP sonuçları da gümüş boyama ile analiz edildi. Yıldız işaretleri, koelütatlı safsızlıkları gösterir.
FLAG etiketli CKD9, STREP boncuklarından STREP etiketli Cyclin-T1 ile koelütlendi, ancak kontrolden değil AP.In sonraki FLAG elüsyonundan STREP, FLAG boncuklarından FLAG etiketli CDK9 ile koelütlü Cyclin-T1 etiketli. Benzer şekilde, FLAG etiketli Cyclin-T1, STREP boncuklarından STREP etiketli CDK9 ile koelütlenmiştir, ancak kontrol AP'sinden değil. Ve protein-protein kompleksi, ikinci FLAG IP adımından sonra verimli bir şekilde geri kazanıldı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa hücreler toplanmaya hazır olduğunda başlayarak iki gün içinde yapılabilir.
Bu prosedürü denerken, yeterli proteinin geri kazanılabilmesini ve tespit edilebilmesini sağlamak için deney başına hücre plakalarının sayısını buna göre artırmayı unutmamak önemlidir. Örneğin, yeni düzenleyici alt birimlerin tanımlanması ve/veya karmaşık alt birimlerde çeviri sonrası değişikliklerin incelenmesi. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, protein-protein etkileşimlerini inceleyen araştırmacıların, ökaryotik hücrelerde yeni interaktörleri ve translasyon sonrası modifikasyonları keşfetmelerinin yolunu açtı.
Bu videoyu izledikten sonra, STREP ve FLAG etiketlerini kullanarak proteinleri nasıl izole edeceğinizi ve karakterize edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, ökaryotik hücrelerden protein komplekslerinin verimli izolasyonu ve karakterizasyonu için tasarlanmış yeni bir tandem afinite saflaştırma (TAP) yöntemi sunmaktadır. Yöntem, protein fonksiyonunu etkileyen yeni etkileşimcilerin ve post-translasyonel modifikasyonların tanımlanmasını sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Hücre Biyolojisi
- Protein Etkileşimleri
Arka Plan
- Tandem afinite saflaştırma, protein komplekslerini izole etmek için kullanılan bir tekniktir.
- Protein etkileşimlerini anlamak, hücresel fonksiyonların açıklanması için kritik öneme sahiptir.
- Post-translasyonel modifikasyonlar, protein aktivitesini düzenlemede önemli bir rol oynar.
- Bu yöntem, protein komplekslerinin daha ileri analizler için saflığını ve verimini artırır.
Çalışmanın Amacı
- Protein kompleksi izolasyonu için sağlam bir TAP yöntemi geliştirmek.
- Protein komplekslerinin biyokimyasal karakterizasyonunu kolaylaştırmak.
- Yeni etkileşimcileri ve düzenleyici modifikasyonları tanımlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Ökaryotik hücrelerden protein komplekslerinin izolasyonu.
- Transfeksiyon sonrası 48 saatte STREP afinite saflaştırması kullanımı.
- Hücre ayrılması için soğuk PBS uygulaması.
- Protein fonksiyonunu incelemek için kullanılan in vitro aşağı akış uygulamaları.
Ana Sonuçlar
- İzole edilen protein komplekslerinin yüksek saflığı ve verimi elde edildi.
- Yeni etkileşimcilerin tanımlanması kolaylaştırıldı.
- Protein fonksiyonunu düzenleyen post-translasyonel modifikasyonlar karakterize edildi.
- Yöntemin biyokimyasal karakterizasyon için etkili olduğu kanısına varıldı.
Sonuçlar
- TAP yöntemi, protein komplekslerinin incelenmesi için değerli bir araçtır.
- Bu, önemli düzenleyici etkileşimlerin tanımlanmasını sağlar.
- Bu yaklaşım, protein fonksiyonu ve aktivitesi hakkındaki anlayışımızı artırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Tandem affinity purification (TAP) using STREP- and FLAG-tagged proteins enables high-purity isolation of eukaryotic protein complexes, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The method facilitates identification of novel interactors and post-translational modifications, improving predictive confidence in protein function and complex assembly. This approach reduces biological ambiguity in target selection and supports scalable workflows for lead identification and preclinical characterization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating intact protein complexes from eukaryotic cells for functional characterization.
- Operational Value: Supports biological de-risking through high-yield purification of complexes containing transiently expressed regulatory subunits.
- Predictive Value: Enhances target confidence by enabling detection of co-purifying interactors and regulatory modifications via mass spectrometry.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated eukaryotic protein complexes for downstream biochemical assays measuring enzymatic activity or binding kinetics.
- Operational Value: Enables assay standardization through reproducible isolation of complexes with defined subunit composition and modification status.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple targets by combining lysates from different cell plates during STREP bead incubation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Characterizes disease-relevant protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic components, enabling mechanistic insight into host-pathogen interactions.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation by generating complexes suitable for structural and functional studies.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying novel regulatory subunits and post-translational modifications that fine-tune complex function.
Pipeline & Workflow Integration
The TAP method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, enabling biochemical characterization of protein complexes prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating complexes to identify novel interactors and regulatory post-translational modifications.
- Screening: Enables assay readiness by producing purified complexes suitable for in vitro activity and binding assays.
- Analytics: Generates quantitative outputs via mass spectrometry and Western blot analysis to compare complex composition under different conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by characterizing complexes from eukaryotic or pathogenic systems for mechanistic de-risking.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for multiple targets, as the same STREP and FLAG bead workflow can be applied across different epitope-tagged constructs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity, and identification of novel regulatory mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of protein complex isolation across multiple experimental conditions.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions through improved target validation, capital efficiency in early discovery, and reduced late-stage biological failure risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on validated complex composition and modification status.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, eukaryotic cell culture, and affinity purification techniques.
- Depends on access to centrifugation equipment, microcentrifuge tubes, and STREP and FLAG affinity resins.
- Necessitates cross-team standardization of tag placement, lysis buffer composition, and wash stringency for reproducible results.
- Requires adaptation considerations when applying to different eukaryotic cell lines or pathogenic protein expression systems.
- Practical limitation: Efficiency depends on transfection efficiency and expression levels of epitope-tagged constructs in eukaryotic cells.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Collecting the Cells
1:39
Lysing the Cells
6:01
Equilibrating the FLAG Beads
2:32
Equilibrating the STREP Beads
3:56
STREP Affinity Purification (AP)
7:04
FLAG Immunoprecipitation (IP)
8:39
Results: A Cyclin-CDK Complex is Successfully Purified by Tandem Affinity Purification (TAP)
10:26
Conclusion
