Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma
26 Ocak 2017
Burada, ökaryotik hücrelerden protein komplekslerinin ekspresyonu, izolasyonu ve karakterizasyonu için yeni, sağlam ve verimli bir tandem afinite saflaştırma (TAP) yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol, ayrık komplekslerin biyokimyasal karakterizasyonunun yanı sıra yeni interaktörlerin ve işlevlerini düzenleyen translasyon sonrası modifikasyonların tanımlanması için kullanılabilir.
Bu tandem afinite saflaştırma yönteminin genel amacı, biyokimyasal karakterizasyon ve moleküler montajlar için ökaryotik hücrelerden eksprese edilen protein komplekslerini izole etmek ve işlevlerini düzenleyen yeni interaktörlerin ve translasyon sonrası modifikasyonların tanımlanmasıdır. Bu yöntem, ökaryotik hücrelerden bozulmamış protein komplekslerinin saflaştırılmasını, işlevlerini ince ayar yapan yeni interaktörleri ve düzenleyici translasyon sonrası modifikasyonları tanımlamak için mümkün kılar. Bu tekniğin ana avantajı, işlevlerini ve aktivitelerini incelemek için aşağı akış in vitro uygulamalar için yüksek saflıkta ve protein komplekslerinin verimine izin vermesidir.
Hücreler, transfeksiyondan 48 saat sonra STREP afinite saflaştırmasından toplanır. Ortamı çıkarın ve sekiz mililitre soğuk PBS ekleyin. Hücreleri plakadan ayırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
Hücre süspansiyonunu toplayın ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücreleri dört santigrat derecede dört dakika boyunca 800 kez g'de döndürün. PBS süpernatantını çıkarın. Artık PBS'yi ortadan kaldırmak için dört santigrat derecede bir dakika boyunca 800 kez g'de döndürün.
Bu prosedüre başlamak için, her bir hücre peletini pasif lizis tamponunun veya PLB'nin hücre pelet hacminin beş katı kadar yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Süspansiyonu kısaca girdap haline getirin ve dört santigrat derecede 30 dakika boyunca nutat edin.
Hücre süspansiyonunu dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 10.000 kez g'de döndürün. Çözünür lizatı yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hücre peletini atın. Çözünür lizatın son hacminin %10'unu STREP-AP girişi olarak kaydedin ve dört santigrat derecede saklayın.
İlk afinite saflaştırma adımı için STREP boncuklarının kullanılması önemlidir, çünkü STREP boncukları ile aşağı çekilen kompleksler, FLAG boncukları ile aşağı çekilenlerden önemli ölçüde daha fazla protein geri kazanır. Geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak, afinite saflaştırması için uygun miktarda %50 STREP boncuk bulamacını çıkarın. Dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.500 kez g'de döndürün.
Süpernatanı çıkarın ve boncuklara 500 mikrolitre PLB ekleyin. Boncuk karışımını dört santigrat derecede beş dakika boyunca nutate edin. Tekrar aşağı döndürün.
Üçüncü yıkamadan sonra, süpernatanı çıkarın ve PLB'deki boncukları n kez 40 mikrolitrelik bir nihai hacme yeniden süspanse edin, burada n numune sayısıdır. Her hücre lizat örneğine 40 mikrolitre% 50 STREP boncuk bulamacı ekleyin ve dört santigrat derecede iki saat boyunca nutat edin. Bu protein üretimi ve geri kazanımı sırasında birden fazla hücre plakası kullanılabilir ve farklı plakalardan parçalanan aynı protein örnekleri, STREP afinite saflaştırması sırasında bir kısım boncuk ile birleştirilebilir.
Hücre lizatı ve STREP boncuk bulamaç karışımları iki saat inkübe edildikten sonra, dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.500 kez g'de döndürün. STREP AP akarken süpernatanı saklayın ve dört santigrat derecede saklayın. Boncuklara bir adet 500 mikrolitre STREP AP yıkama tamponu ekleyin.
Boncukları tampon karışımında dört santigrat derecede beş dakika boyunca nutate edin ve dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.500 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve 500 mikrolitre STREP AP yıkama tamponu ile tekrar yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, protein arka planını azaltmak için boncuk çözeltisini yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
STREP AP yıkama tamponu ile dördüncü kez yıkayın. Sıkma işleminden sonra, süpernatanı çıkarın ve 500 mikrolitre yıkama yağı ekleyin. Tüpleri ters çevirerek boncukları dengeleyin ve ardından dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.500 kez g'de döndürün.
Süpernatanı atın. 50 mikrolitre STREP elüsyon tamponu ile ilgilenilen proteini güçlendirin. Dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 800 rpm'de girdap.
Boncukları dört santigrat derecede bir dakika boyunca 1.500 kez g'de döndürün. Süpernatanı topla. Bu fraksiyon, STREP AP elüsyon örneğine karşılık gelir.
İkinci bir elüsyon için boncuk fraksiyonunu dört santigrat derecede saklayın. Gümüş boyama ve / veya Western lekeleme için STREP AP elüsyonunun% 10'unu alın. Sonraki FLAG immünopresipitasyonu için başlangıç materyali miktarını artırmak için, FLAG elüsyonunun daha verimli bir şekilde geri kazanılması için birinci ve ikinci STREP elutiyonları bir araya getirilebilir.
Uygun miktarda FLAG boncuk solüsyonunu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak bu prosedüre başlayın. Dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.500 kez g'de döndürün. Süpernatanı çıkarın ve boncuklara 500 mikrolitre FLAG yıkama tamponu ekleyin.
Dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.500 kez g'de döndürün. Süpernatanı atın ve FLAG yıkama tamponu ile tekrar yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, süpernatanı çıkarın ve boncukları FLAG yıkama tamponunda n çarpı 16 mikrolitrelik bir nihai hacme kadar yeniden süspanse edin, burada n numune sayısıdır.
Kalan STREP AP elüsyonuna 16 mikrolitre FLAG boncuk bulamacı ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede nütatlayın. FLAG boncuk bulamacı ve STREP AP elüsyonunun gece boyunca inkübasyonunu takiben, FLAG immünopresipitasyonuna devam edin. FLAG boncuk süspansiyonunu dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.500 kez g'de döndürün.
FLAG IP akarken süpernatanı koruyun ve dört santigrat derecede saklayın. Boncuklara 500 mikrolitre FLAG yıkama tamponu ekleyin. Dört santigrat derecede beş dakika nutat yapın ve dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.500 kez g'de santrifüjleyin.
Süpernatanı atın ve 500 mikrolitre FLAG yıkama tamponu ile tekrar yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, arka planı azaltmak için protein boncuk çözeltisini yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. FLAG yıkama tamponu ile dördüncü kez yıkayın.
Süpernatanı son dönüşten çıkarın ve boncuklara mikrolitre FLAG peptidi başına 200 nanogram içeren 30 mikrolitre FLAG yıkama tamponu ekleyin. Dört santigrat derecede iki saat boyunca 800 rpm'de girdap. İki saat sonra, süspansiyonu dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.500 kez g'de döndürün.
Süpernatanı hasat edin ve FLAG IP elüsyonu olarak dört santigrat derecede saklayın. Bu videoda, Siklin-T1 CDK9 kompleksine Tandem afinite saflaştırması veya TAP yöntemi uygulandı. STREP etiketli Cyclin-T1 ve FLAG etiketli CKD9, HEK293 T hücrelerinde aşırı eksprese edildi.
STREP etiketli CDK9 ve FLAG etiketli Cyclin-T1 ile karşılıklı bir deney de gerçekleştirildi. Western blot analizi, FLAG etiketli CKD9'un STREP boncuklarından STREP etiketli Cyclin-T1 ile koelüt edildiğini, ancak negatif kontrolde olmadığını, AP'nin STREP etiketli Cyclin-T1'den yoksun olduğunu göstermektedir. Her iki protein de FLAG elüsyonunda tespit edildi ve bu da kompleks oluşumunu daha da doğruladı.
Karşılıklı TAP sonuçları, FLAG etiketli Cyclin-T1'in STREP etiketli CDK9 ile koelüt olduğunu ve Cyclin-T1 CDK9 etkileşiminin kullanılan epitoplardan bağımsız olduğunu daha da doğruladığını göstermektedir. TAP ve karşılıklı TAP sonuçları da gümüş boyama ile analiz edildi. Yıldız işaretleri, koelütatlı safsızlıkları gösterir.
FLAG etiketli CKD9, STREP boncuklarından STREP etiketli Cyclin-T1 ile koelütlendi, ancak kontrolden değil AP.In sonraki FLAG elüsyonundan STREP, FLAG boncuklarından FLAG etiketli CDK9 ile koelütlü Cyclin-T1 etiketli. Benzer şekilde, FLAG etiketli Cyclin-T1, STREP boncuklarından STREP etiketli CDK9 ile koelütlenmiştir, ancak kontrol AP'sinden değil. Ve protein-protein kompleksi, ikinci FLAG IP adımından sonra verimli bir şekilde geri kazanıldı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa hücreler toplanmaya hazır olduğunda başlayarak iki gün içinde yapılabilir.
Bu prosedürü denerken, yeterli proteinin geri kazanılabilmesini ve tespit edilebilmesini sağlamak için deney başına hücre plakalarının sayısını buna göre artırmayı unutmamak önemlidir. Örneğin, yeni düzenleyici alt birimlerin tanımlanması ve/veya karmaşık alt birimlerde çeviri sonrası değişikliklerin incelenmesi. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, protein-protein etkileşimlerini inceleyen araştırmacıların, ökaryotik hücrelerde yeni interaktörleri ve translasyon sonrası modifikasyonları keşfetmelerinin yolunu açtı.
Bu videoyu izledikten sonra, STREP ve FLAG etiketlerini kullanarak proteinleri nasıl izole edeceğinizi ve karakterize edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, ökaryotik hücrelerden protein komplekslerinin verimli bir şekilde izole edilmesi ve karakterize edilmesi için tasarlanmış yeni bir tandem afinite saflaştırma (TAP) yöntemini sunmaktadır. Bu yöntem, protein fonksiyonunu etkileyen yeni etkileşimcilerin ve post-translasyonel modifikasyonların tanımlanmasına olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Hücre Biyolojisi
- Protein Etkileşimleri
Arka Plan
- Tandem afinite temizleme, protein komplekslerini izole etmek için kullanılan bir tekniktir.
- Protein etkileşimlerini anlamak, hücresel fonksiyonların aydınlatılması açısından kritik öneme sahiptir.
- Post-translasyonel modifikasyonlar, protein aktivitesinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynar.
- Bu yöntem, ileride yapılacak analizler için protein komplekslerinin saflığını ve verimini artırır.
Çalışmanın Amacı
- Protein komplekslerinin izolasyonu için sağlam bir TAP yöntemi geliştirmek.
- Protein komplekslerinin biyokimyasal karakterizasyonunu kolaylaştırmak.
- Yeni etkileşimcileri ve düzenleyici modifikasyonları tanımlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Ökaryotik hücrelerden protein komplekslerinin izolasyonu.
- Transfeksiyondan 48 saat sonra STREP afinite saflaştırmasının uygulanması.
- Hücrelerin ayrılması için soğuk PBS uygulaması.
- Protein fonksiyonunun incelenmesi için aşağı akışlı in vitro uygulamalar.
Ana Sonuçlar
- İzole edilen protein komplekslerinde yüksek saflık ve verim elde edilmiştir.
- Yeni etkileşimcilerin tanımlanması kolaylaştırılmıştır.
- Protein fonksiyonunu düzenleyenle post-translasyonel modifikasyonlar karakterize edilmiştir.
- Yöntemin biyokimyasal karakterizasyon için etkili olduğu kanıtlanmıştır.
Sonuçlar
- TAP yöntemi, protein komplekslerini incelemek için değerli bir araçtır.
- Kilit düzenleyici etkileşimlerin belirlenmesine olanak tanır.
- Bu yaklaşım, protein fonksiyonu ve aktivitesine dair anlayışımızı geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel İlişkisi
STREP- ve FLAG-etiketli proteinler kullanılarak gerçekleştirilen tandem afinite saflaştırması (TAP), ökaryotik protein komplekslerinin yüksek saflıkta izolasyonuna olanak tanıyarak erken keşif aşamasındaki hedef doğrulamasını ve mekanistik risk azaltma çalışmalarını destekler. Bu yöntem, yeni etkileşimcilerin ve post-translasyonel modifikasyonların tanımlanmasını kolaylaştırarak protein fonksiyonu ve kompleks oluşumuna dair öngörülebilirlik güvenini artırır. Bu yaklaşım, hedef seçimindeki biyolojik belirsizliği azaltır; öncü bileşik tanımlama ve preklinik karakterizasyon için ölçeklenebilir iş akışlarını destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Fonksiyonel karakterizasyon için ökaryotik hücrelerden bozulmamış protein komplekslerini izole ederek terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Geçici olarak eksprese edilen düzenleyici alt birimleri içeren komplekslerin yüksek verimli saflaştırması aracılığıyla biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Öngörücü Değer: Kütle spektrometresi yoluyla birlikte saflaşan etkileşimcilerin ve düzenleyici modifikasyonların tespitine olanak tanıyarak hedef güvenilirliğini artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Enzim aktivitesini veya bağlanma kinetiğini ölçen alt biyokimyasal analizler için valide edilmiş ökaryotik protein komplekslerini hazırlar.
- Operasyonel Değer: Belirli alt birim kompozisyonuna ve modifikasyon durumuna sahip komplekslerin tekrarlanabilir izolasyonu aracılığıyla analiz standardizasyonunu sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: STREP boncuk inkübasyonu sırasında farklı hücre plakalarından gelen lizatları birleştirerek birden fazla hedef için platformun yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Ökaryotik veya patojenik bileşenler tarafından oluşturulan hastalıkla ilgili protein komplekslerini karakterize ederek konakçı-patojen etkileşimlerine dair mekanistik içgörü sağlar.
- Operasyonel Değer: Yapısal ve fonksiyonel çalışmalara uygun kompleksler üreterek keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
- Risk Azaltma: Kompleks fonksiyonunu hassas bir şekilde ayarlayan yeni düzenleyici alt birimleri ve translasyon sonrası modifikasyonları tanımlayarak riskle uyumlu ilerleme kararlarına temel oluşturur.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
TAP yöntemi, hipotez testinden öncü bileşiklerin belirlenmesine kadar olan keşif sürecine entegre olarak, bileşik taraması öncesinde protein komplekslerinin biyokimyasal karakterizasyonuna olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: Yeni etkileşimcilerin ve düzenleyici translasyon sonrası modifikasyonların belirlenmesi amacıyla kompleksleri izole ederek hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturma süreçlerini destekler.
- Tarama: in vitro aktivite ve bağlanma analizlerine uygun saflaştırılmış kompleksler üreterek analiz hazırlığını sağlar.
- Analitik: Farklı koşullar altında kompleks kompozisyonunu karşılaştırmak için kütle spektrometrisi ve Western blot analizi aracılığıyla kantitatif çıktılar üretir.
- Translasyonel Araştırma: Mekanistik risk azaltma amacıyla ökaryotik veya patojenik sistemlerden gelen kompleksleri karakterize ederek keşif aşamasını preklinik sürekliliğe bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Aynı STREP ve FLAG boncuk iş akışı farklı epitop etiketli konstrüktlara uygulanabildiği için birden fazla hedef için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulamada öngörü güvenilirliği, mekanistik belirsizliğin azaltılması ve yeni düzenleyici mekanizmaların belirlenmesi.
- Operasyonel Değer: Çoklu deneysel koşullar altında protein kompleksi izolasyonunun standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: Geliştirilmiş hedef doğrulama yoluyla daha iyi devam/durdur kararları, erken keşif aşamasında sermaye verimliliği ve geç aşamadaki biyolojik başarısızlık riskinin azaltılması.
- Portföy Etkisi: Doğrulanmış kompleks bileşimi ve modifikasyon durumuna dayalı olarak hedeflerin riskle uyumlu önceliklendirilmesi.
Uygulama Hususları
- Moleküler klonlama, ökaryotik hücre kültürü ve afinite saflaştırma tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Santrifüj ekipmanına, mikrosantrifüj tüplerine, STREP ve FLAG afinite reçinelerine erişime bağlıdır.
- Tekrarlanabilir sonuçlar için etiket yerleşimi, liziz tamponu bileşimi ve yıkama katılığı konusunda ekipler arası standardizasyon gereklidir.
- Farklı ökaryotik hücre hatlarına veya patojenik protein ekspresyon sistemlerine uygulandığında adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Pratik sınırlama: Verimlilik, transfeksiyon verimliliğine ve ökaryotik hücrelerde epitop etiketli konstrüktların ekspresyon seviyelerine bağlıdır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Collecting the Cells
1:39
Lysing the Cells
6:01
Equilibrating the FLAG Beads
2:32
Equilibrating the STREP Beads
3:56
STREP Affinity Purification (AP)
7:04
FLAG Immunoprecipitation (IP)
8:39
Results: A Cyclin-CDK Complex is Successfully Purified by Tandem Affinity Purification (TAP)
10:26
Conclusion
