Name: Şişe burunlu yunus (Tursiops truncatus) sperm: koleksiyon, dondurma ve kapaklı In Vitro fertilizasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Keşfedin şişe burunlu yunus spermi toplama, dondurma ve heterolog in vitro fertilizasyon yöntemlerini. Tursiops truncatus sperminin işlevselliğini değerlendirmek için sığır oositleri kullanılan bu teknik, üreme biyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

onun iş ekonomi ve rekabet (AGL2015-70140-R ö. Rizos için), AGL2015-66145R A. Gutierrez-Adan ve J. F. Pérez-Gutiérrez ve Seneca Murcia Vakfı (Grant 20040/mikrop/16 F. García-Vázquez için) İspanyolca Bakanlığı tarafından finanse edildi

etik beyanı: deneysel yordamları gözden geçirilmiş ve kurumsal hayvan bakım ve Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INİA) kullanım Komitesi tarafından onaylanmış. Üreme çalışma için ve Deniz memelileri bakımı için hayvan refah Yasası için toplum tarafından kabul edilen Kılavuzu uygun bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları, Bütün deneyler yapıldı.
 1. Yunus Sperm toplama ve dondurma <ol><li>hazırlık <ol><li>FERT yapmak orta (heparin-hypotaurine-özgür ve). 25 mM bikarbonat, sodyum laktat 22 mM, 1 mM sodyum pyruvate, 6-mg/mL yağ asidi içermeyen BSA ve 10 mg/mL heparin (pH 7,4) ile FERT-TALP orta hazırlayın. 
		Not: Bu orta kullanım gününde hazırlamak ve % 5 CO 2 ve en yüksek nem için kullanmadan önce en az 2 h ile havada bir atmosfer altında 38,5 ° C'de devam.</li>
		<li>Hazırlamak TRIS yumurta sarısı tabanlı arabellek. 30.28 g/L Tris, 16.75 g/L sitrik asit, 12,5 g/L fruktoz ve 0.5 g/L streptomisin ultrasaf su dağıtılması (pH 7.3, osmolalite = 310 mOsm/kg). % 20 yumurta sarısı (v/v) ekleyin.</li>
	</ol></li> <li>Havuzun kenarına gönüllü sperm koleksiyonu için yakınındaki dorsal recumbence yalan söylemek bir kanıtlanmış damızlık erkek şişe burunlu yunus tren. 
	Not: Erkek yunus 6 ay mutlak güçlendirme tarafından eğitilmesi daha önce 4 açıklandığı gibi.</li>
	<li>Penis genital groove üzerinden gönüllü ekstrüzyon temin için hafifçe yunus genital oluk kafatası alan üzerine basarak çeşitli dokunsal elektrodlar gerçekleştirmek.</li>
	<li>Tam bir ereksiyon elde sonra penis ucu steril bir kap içine boşalmak edinmek için doğrudan.</li>
	<li>Sperm örneği 37 ° C'e kadar analiz korumak. 1.3 1.4 her seferinde yeni bir propilen cam kullanarak birbirini izleyen boşalmak koleksiyonları için aygıtlarından.</li>
	<li>Hemen toplandıktan sonra daha önce 37 ° C. değerlendir rengi, pH ve (bir mikro-osmometer kullanarak) Osmolarite boşalmak ısındı mezun cam silindir kullanarak birimi belirlemek.</li>
	Ejakülatta sperm konsantrasyonu değerlendirmek için <li>90 µL distile su içeren bir eppendorf tüp sperm süspansiyon 10 µL ekleyin. Bir sperm odası sayma kullanarak sperm konsantrasyonu belirlemek. 
	Not: değerlendirme sırasında boşalmak kalanı 37, tutmak ° C.</li>
	<li>Motilite parametreleri değerlendirmek.
	<ol><li>10 µL sperm örneği alıp Önceden ısıtılmış sperm odasında yerleştirin.</li>
		<li>Motilite sperm hareketliliği 2 objektif değerlendirmek için daha önce şişe burunlu yunus için doğrulanmış bir bilgisayar destekli sperm analizi sistemi kullanarak değerlendirmek. 
		Not: gerekirse, sperm örneği ile FERT orta (heparin ve hypotaurine-içermeyen) sperm motilitesi yeterli görselleştirme için oranında seyreltin. Değerlendirme sırasında örnek 37 ° C'de ısıtılmış mikroskop sahneye korumak.</li>
	</ol></li> <li>20 µL sperm örneği alıp canlılığı ve sperm morfolojisi yukarıda açıklanan 5 olarak değerlendirmek.</li>
	<li>Sperm örnek bir santrifüj tüpü aktarın. Sperm örneği 5 min için 250 x g'santrifüj kapasitesi. Sonra bir sayım odası kullanarak sperm konsantrasyonu belirlemek, 400 x 10 6 sperm hücreleri/ml sperm konsantrasyonu ayarlayın. 
	Not: gerekirse, yoğun cinsel ilißki üzerinden Pelet aynı boşalmak aşırı bir biriminden izole seminal plazma ile Santrifüjü tarafından (250 x g, 10 dk) oranında seyreltin.
	<ol><li>5 dk boyunca, yavaş yavaş seyreltik sperm 1:1 (v/v) % 1.5 gliserol içeren bir TRIS yumurta sarısı tabanlı bir arabellek ile örnek. 1 h 30 dk. 5 ° C'de sperm süspansiyon içeren tüp yer</li>
		<li>Gerçekleştir sperm süspansiyon bir TRIS ile ikinci bir seyreltme yumurta sarısı tabanlı arabellek içeren gliserol %3 son gliserol konsantrasyon ve 200 x 10 6 sperm/mL nihai bir konsantrasyon elde etmek için. 10 dakika süreyle 5 ° C'de sperm süspansiyon korumak</li>
	</ol></li> <li>Sperm süspansiyon 0.25 mL payet yük. Payet ve. Bir rafa 4,5 cm yukarıda 10 dakika süreyle sıvı azot payet payet sıvı azot Dalma ve mağaza kadar değerlendirme yer.</li>
</ol> 2. Kapaklı In Vitro fertilizasyon kullanarak Zona olduğu gibi sığır yumurta <ol><li>hazırlık <ol><li>boyama hazırla çözüm ve montaj orta.
		<ol><li>Hazırlamak Höchst hisse senedi çözüm Höchst 1 mg 1 mL distile su içinde eriterek tarafından. 30 µL aliquots yapmak ve onları kadar kullanmak-20 ° C'de karanlıkta bırakın. Boyama çözüm fosfat tamponlu tuz (PBS) 1 g/L ile PVA takıma 5 ml 25 µL Höchst hisse senedi çözüm ekleyerek hazırlayın. Mix iyi ve 4 ° c kadar kullanmak anlatmamanı.</li>
			PBS 6.25 mL 6.25 mL gliserol ve 6.25 µL Höchst hisse senedi çözüm ile karıştırma tarafından montaj orta <li>hazırla. Mix iyi ve 4 ° c kadar kullanmak anlatmamanı.</li>
		</ol></li> <li>Orta yumurta toplama ve vitro fertilizasyon için hazırlamak.
		<ol><li>Tuzlu çözüm viomisin 0.5 mL % 0,9 NaCl distile su ekleyerek hazırlayın.</li>
			<li>Hisse senedi olgunlaşma orta TCM-199 için 10 mL 10 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF) ve % 10 fetal buzağı serum (FCS) ekleyerek hazırlayın. Her iki medya % 5 CO 2 ve en yüksek nem için kullanmadan önce en az 2 h ile havada bir atmosfer altında 38,5 ° C'de korumak.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>33-35 ° c tuzlu çözüm mezbahada, yumurtalık toplamak ve onları 4 h içinde laboratuvar koleksiyonundan taşıma.</li>
	<li>Bir kez laboratuvarda, yumurtalık üç kez yıkayın enkaz kaldırmak ve daha önce 37 için sıcak tuzlu çözüm kullanarak kan ° C. korumak için yumurtalıkların 37 ° C'de tuzlu çözüm sürecinde.</li>
	<li>Aspire edin 2-8 mm köklerinin 18G ile iğne ve 10 mL şırınga. 50 mL tüpler emişli foliküler sıvı toplamak.</li>
	<li>Yaklaşık 15 dakika 37 ° C'de hücreler tortu kadar durmak için yumurta içeren foliküler sıvı izin. Pasteur pipet ile tüp süpernatant kaldırmak ve Pelet PBS içinde yeniden askıya alma.</li>
	<li>Bir stereomicroscope altında 90 mm yemeklerinde kümülüs oosit kompleksleri (COCs) kurtarmak.</li>
	<li>COCs üç kez PBS ve bir kez olgunlaşma orta yıkayın.</li>
	<li>Morfolojik normal COCs 4-iyi yemekleri, her şey iyi başına 50 COCs gruplar halinde olgunlaşma orta 500 mL içeren transfer. 
	Not: Burada, üç kuyuları &#8211; kapaklı tüp bebek, homolog IVF için iyi bir kontrol ve bir de yalnızca içeren bir iyi olgunlaşmış COCs parthenogenetic kontrol olarak &#8211; kullanılmıştır.</li>
	<li>COCs % 5 CO 2 ve maksimum nem ile havada bir atmosfer altında 38,5 ° C'de 24 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Orta ve yoğunluk gradient hazırlayın.
	<ol>Gübreleme orta (FERT) hazırlamak, 25 mM bikarbonat, sodyum laktat 22 mM, 1 mM sodyum pyruvate, 6 mg/mL yağ asidi içermeyen BSA ve 10 mg/mL heparin ile FERT-TALP orta tamamlamak için <li>. %5 CO 2 ve en yüksek nem için kullanmadan önce en az 2 h ile havada bir atmosfer altında 38,5 ° C'de korumak.</li>
		<li>Yoğunluğu degrade orta 15 mL tüp ve çözüm için bir 15 mL tüp yıkama 3 mL 1 mL ekleyerek yoğunluğu degrade hazır olun. Onları korumak için en az 1 h. 38,5 ° C'de</li>
	</ol></li> <li>Yıkama vitro olgunlaşmış FERT ortamda iki kez yumurta.</li>
	<li>Yumurta 4-iyi yemekleri, her FERT 250 ml 50 COCs de içeren transfer. 4-iyi yemekler %5 CO 2 ve maksimum nem ile havada bir atmosfer altında 38,5 ° C'de gübreleme için sperm hazırlarken korumak.</li>
	<li>Donmuş bir saman 50 37 ° C'de bir su banyosunda yunus sperm hücreleri içeren çözülme s. 
	Not: Sığır meni homolog IVF için paralel, homolog sığır IVF için standart protokol sonrası işlenmelidir.</li>
	<li>Al 10 µL sperm örnek ve Önceden ısıtılmış bir sperm odası sayma yerleştirin. Motilite sperm motilitesi objektif değerlendirmek için daha önce türler için doğrulanmış bir bilgisayar destekli sperm analizi sistemi kullanarak değerlendirmek. Bu süre zarfında sperm örneği 38,5'korumak ° C.</li>
	<li>Sperm örnek yoğunluk gradient tüp (Adım 2.10.2) ekleyin. 250 x g., 10 dk santrifüj</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde Pasteur pipet kullanarak süpernatant çıkarın. Pelet içeren tüp 3 mL yıkama çözeltisi ekleyin. Pelet yavaşça karıştırarak yeniden askıya alma.</li>
	<li>Santrifüj 250 x g., 5 min için kaldırmak için 300 µL sperm hacmi Pasteur pipet ile süpernatant.</li>
	<li>Ekleyin 5 µL sperm süspansiyon için 95 µL distile su içeren bir microcentrifuge. 38,5, sperm süspansiyon korumak ° C. Hücre sayımı dolgu Odası 1:20 10 µL ile sperm seyreltme ve ölçü konsantrasyonu. 2 x 10 6 sperm hücreleri/mL elde etmek için sperm 100 µL eklenmelidir FERT orta tutarını hesaplar.</li>
	<li>Hesaplanan FERT ve sperm cilt 15 mL tüp ekleyin ve karışımı yavaşça Pasteur pipet kullanarak.</li>
	<li>Ekleyin 250 µL sperm-FERT süspansiyon her şey 1 x 10 6 sperm hücreleri/mL nihai bir konsantrasyon elde etmek için olgunlaşmış yumurta ile FERT orta içeren 4-iyi yemeğin için.</li>
	<li>Co gamet 38,5 ° c, % 5 CO 2 ve maksimum nem ile havada bir atmosfer altında 18 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Sentetik oviductal sıvı %5 FCS ile desteklenen temel kültür orta hazırlayın. 35-mm yemeklerinde 3 mL mineral yağ ile kaplı sentetik oviductal sıvı kültür damlacıkları 25 µL hazırlayın. %5 CO 2 ve en yüksek nem için kullanmadan önce en az 2 h ile havada bir atmosfer altında 38,5 ° C'de korumak.</li>
	<li>, 2,5 h sonrası yardımcı kuluçka, 20 yumurta yemek Kaldır; kuluçka aynı koşullar altında kalan yumurta korumak.
	<ol><li>Tarafından şiddetle dar geçişli Pasteur pipet ile yumurtalar yarısı 10 kez pipetting gevşek olarak bağlı sperm hücreleri kaldırmak.</li>
		<li>50 µL % 0.5 oxazolidin 30 dk PBS 5 dakika süreyle yumurta Transfer yıkama için 20 yumurta yumurta 50-µL 15dk için Höchst boyama çözümü için tamir ve PBS 5 dakika süreyle yumurta yıkama</li>
		<li>Yumurta tek tek slayt başına 10 yumurta oranında montaj orta 2 µL damlacıkları aktarın. Yavaşça kapağı ile bir coverslip ve tırnak cilası ile mühür.</li>
		<li>Epifluorescent optik ve 40 x büyütme, 361 nm uyarma filtre ile donatılmış bir faz kontrast mikroskop kullanarak sığır yumurta bağlı sperm hücreleri saymak.</li>
	</ol></li> <li>12 h, co kuluçka sonra 10 meşru zigotları gelen 4-iyi yemekler Kaldır; kuluçka aynı koşullar altında kalan meşru zigotları korumak.
	<ol><li>Transfer 10 meşru zigotları 15 mL santrifüj için PBS ve hafifçe 2 min için girdap kümülüs hücreleri kaldırmak için içeren 2 mL tüp. Yıkama iki kez PBS, düzeltme ve leke, daha önce açıklandığı gibi (Adım 2.23.2.)</li>
	</ol></li> <li>18, 20, 22 ve 24 h, co kuluçka, 10 kaldırdıktan sonra 4-iyi yemekler ve girdap, meşru zigotları, düzeltmek ve onları daha önce açıklandığı gibi (Adım 2.23.2) leke. Aynı koşullar altında kuluçka meşru zigotları geri kalanı korumak.
	<ol><li>Pronuclear oluşumu ve polyspermy homolog ve kapaklı tüp bebek gruplar halinde bir faz-kontrast/epifluorescent mikroskop altında Höchst ile boyama tarafından değerlendirmek.</li>
		<li>Pronuclear örnek başına 10 rasgele seçilmiş meşru hibrid zigotları oluşumunda değerlendirin. 488-nm argon lazer uyarma, mikroskop ve 515-530 nm algılama tarama confocal lazer altında pronuclear oluşumu onaylayın.</li>
		<li>Optik meşru zigotları sırayla bölüm (2 mm) ve toplamak bir görüntüleme yazılımı kullanarak görüntüleri. 3D analiz yazılım paketi kullanarak görselleştirmek.</li>
		<li>, Co kuluçka 24 saat sonra PBS ve kültür orta iki kez 50 meşru zigotları dört kez yıkayın.</li>
	</ol></li> <li>25 gruplar halinde onları kültür daha önce hazırlanan ve equilibrated orta microdroplets için transfer.</li>
	<li>Bakım altında bir atmosfer %5 O 2 / %5 38.5 ° C'de CO 2 ve havada maksimum nem ile.</li>
	<li>Sonra 26 ve 28 h, co kuluçka, 10 meşru zigotları kaldırmak yemekleri ve girdap, düzeltme ve onları, daha önce açıklandığı gibi (Adım 2.23.2) leke.</li>
	<li>Kültür 48 saat sonra bir stereomicroscope altında bölünme gözlemlemek.</li>
	<li>5 mg/mL proteaz çözüm embriyo transfer ederek zona pelusida (ZP) kaldırın.</li>
	<li>Tek tek her embriyo PBS içinde üç kez yıkayın. Ek onları 0.2 mL microcentrifuge tüpler içinde sıvı azot kıpırdama. Onları analiz kadar-80 ° C'de depolayın.</li>
</ol> 3. PCR <ol><li>malzemeler ve Kimyasalları Not: reaktifler, malzemeleri ve aletleri PCR Protokolü gerçekleştirmek için kullanılan malzemeler tablo ayrıntılı ve PCR tüp raf ve MİKROPİPETLER (P2, P20, P200, P1000), bir takım 1,5 mL microcentrifuge tüpler, PCR tüpleri ve kapaklar, termal cycler, UV ışığı, özel jel ve arabellek (Tris Bor EDTA (TBE)).
	<ol><li>Yavaşça tüm reaktifler buz çözme. Onları buz deneme boyunca korumak. Deoxynucleotides kullanın (dNTPs; dATP, dCTP, dTTP ve dGTP), hedef referans gen yunus 18 S ribozomal protein (DQ404537.1); için kodlama üzerinde astar R1: TTGGACACACCCACGGTGCGG ve F2: CAGAAGGACGTGAAGGATGGA), DNA polimeraz, 5 X arabellek DNA polimeraz, DNA şablon, steril su ve magnezyum klorür (MgCl 2 ' de 5.0 mM son bir konsantrasyon).</li>
		<li>Özel jel ve örnek hazırlama.
		<ol><li>Hazırla yunus ve sığır sperm DNA örnekleri.
			<ol><li>Tezcan 37 ° C'de bir su banyosu içinde her tür donmuş bir saman 50 s., çözüm yıkama 3 mL ekleyin. 10 dakika süreyle santrifüj 250 x g de süpernatant kaldırın. STES lizis arabelleği (50 mM Tris-HCl, pH 8; 20 mM NaCl; ve 1 mM % 0,1 SDS), 30 µL eklemek, İndinavir K 2 µL (20 mg/mL) ve dithiothreitol (DTT); 5 µL son konsantrasyonu: 150 mM. Gecede 55 ° C. Ekle 200 µL ultrasaf su korumak. 5 dakika süreyle santrifüj 250 x g de süpernatant tutun. Bir Spektrofotometre kullanarak DNA toplama ölçmek.</li>
			</ol></li> <li>Seri dilutions DNA PCR koşulların yeteneğine sahip olduğunu kontrol etmek için ultrasaf su ile yunus sperm hücreleri (Yani, 40, 4 ve 0,4 ng/mL) gerçekleştirmek Yunus DNA az miktarda tespit.</li>
			<li>Sığır Sperm DNA (Yani, 4000, 400, 40 ve 4 ng/mL) PCR koşulların sığır DNA'ın küçük bir miktar algılama yeteneğine sahip olduğunu kontrol etmek için ultrasaf su ile seri dilutions gerçekleştirmek.</li>
			<li>Yunus ve sığır embriyoları hazırlayın. Embriyo buz çözme. 100 µg/mL İndinavir K 8 µL eklemek ve gecede 55 ° C'de bakımını yapmak Reaksiyon durdurmak için örnekleri 5 dakika süreyle 96 ° C'de yer</li>
			<li>% 2 özel jel TBE tampon hazırlamak ve nükleik asit leke standart yöntemlerle 20 µL ekleyin.</li>
		</ol></li> <li>PCR hazırlık.
		<ol><li>Etiket PCR tüpler: yunus seri dilutions (40, 4 ve 0.4 ng/mL), sığır seri dilutions (4.000, 400, 40 ve 4 ng/mL), homolog sığır iki hücreli embriyo, iki hücreli meşru Contegra embriyo ve negatif kontrol.</li>
			<li>Steril 1.5 mL microcentrifuge tüp tepki başına 25 µL son hacmi için ana bir karışım hazırlayın.
			<ol><li>Ekleyin 5 µL 5 X DNA polimeraz flexi arabelleği, dNTPs (10 mM) 1.5 0.5 µL µL MgCl 2 (25 mM), ileriye ve geriye doğru astar (10 µM), 1,5 µL DNA şablonunun (sperm) veya DNA şablonunun (iki hücreli embriyo) 8 µL 0.5 µL , 0,07 µL Taq polimeraz ve steril distile su 25 µL son hacim kadar. Mix iyi.</li>
			</ol></li></ol></li></ol></li> <li>Amplifikasyon Protokolü <ol><li>tüpler içinde termal cycler yerleştirin. Aşağıdaki programı seçin: 94 ° C 3 dakika; 40 devredir 15 94 ° c s, 59 ° C 25 s, 20 72 ° C s; ve 72 ° C 5 dakika süreyle programı başlatmak.</li>
		<li>4 ° C. Ekle 2.5 µL % 2 özel jel kuyu arabellek her karışımı 4 ° C ve yük 15 µL PCR ürünü için yükleme, tüpler saklayın. Bir DNA merdiven marker PCR parçaları doğru boyutu tahmin için kullanın.</li>
		<li>Gerçekleştir Elektroforez DNA geçiş izin vermek 15 dakika. Görselleştirildiği UV ışığı kullanarak bantları.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Montano, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+motility%2C+membrane+status+and+DNA+integrity+of+frozen-thawed+bottlenose+dolphin+%28Tursiops+truncatus%29+spermatozoa+after+sex-sorting+and+recryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation.</a> Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).</li>
<li>Sánchez-calabuig, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+field+based+chromatin+dispersion+assay+to+assess+sperm+DNA+fragmentation+in+the+bottlenose+dolphin+%28Tursiops+truncatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Domest+Anim%22%5BJournal%5D)">Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus).</a> Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).</li>
<li>Sánchez-calabuig, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+murine+and+bovine+IVF+using+bottlenose+dolphin+%28Tursiops+truncatus%29+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa.</a> Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).</li>
<li>Keller, K. V. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books/about/Training_Atlantic_Bottlenose_Dolphins_Tu.html?id=RKstOAAACAAJ">Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination.</a> IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).</li>
<li>Robeck, T. R., O'brien, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cryopreservation+methods+and+precryopreservation+storage+on+bottlenose+dolphin+%28Tursiops+truncatus%29+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa.</a> Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).</li>
<li>Coy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hardening+of+the+zona+pellucida+of+unfertilized+eggs+can+reduce+polyspermic+fertilization+in+the+pig+and+cow%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow.</a> Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).</li>
<li>Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).</li>
<li>Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchroeder%2C+JP+%22The+Bottlenose+dolphin%22">The Bottlenose dolphin</a>. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).</li>
<li>Sánchez-Calabuig, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cryopreservation+on+the+sperm+DNA+fragmentation+dynamics+of+the+bottlenose+dolphin+%28Tursiops+truncatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Domest+Anim%22%5BJournal%5D)">Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus).</a> Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).</li>
<li>Robeck, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrous+cycle+characterisation+and+artificial+insemination+using+frozen-thawed+spermatozoa+in+the+bottlenose+dolphin+%28Tursiops+truncatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus).</a> Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).</li>
<li>Robeck, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+deep+intra-uterine+artificial+insemination+using+cryopreserved+sexed+spermatozoa+in+bottlenose+dolphins+%28Tursiops+truncatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus).</a> Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).</li>
<li>Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchroeder%2C+JP+%22The+Bottlenose+dolphin%22">The Bottlenose dolphin</a>. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).</li>
<li>Madeddu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cooling+rate+on+the+survival+of+cryopreserved+rooster+sperm%3A+Comparison+of+different+distances+in+the+vapor+above+the+surface+of+the+liquid+nitrogen%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen.</a> Anim Reprod Sci. , (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Birçok farklı memeli türü için dondurulmuş çözdürülen sperm kullanılarak çeşitli yararları vardır. Bu değerli genetik materyal, dünya çapında dağıtımı için potansiyel, düşük kirlenme riski ve erkek gamet yıllardır korumak yeteneği aktarma yeteneği içerir. Bu tür ek II, taşıma ve hayvanların farklı su parkları arasında değişimi sınırlayan DEĞİNİR altında korunduğu için cryopreserved sperm kullanımı şişe burunlu yunus için esastır. Yunuslar taşıma, lojistik sorunlar ve tehlikeli riskler oluşturur bir etkinliktir. Ancak, on...

Yardımlı üreme teknikleri kötü vahşi hayvanlar, Deniz memelileri de dahil olmak üzere geliştirilir. Hassas yöntemler sperm Gübreden başarı değerlendirmek için eksikliği yunus gibi türlerin üreme teknolojileri yavaş gelişmesine katkıda bulunur. Yakın zamana kadar şişe burunlu yunus (Tursiops truncatus) temel seminal parametreler bildirilen1,2vardı değildi. Ancak, hareketliliği ve Morfoloji, gibi değişkenler her ne kadar yaygın olarak kullanılan, üreme verimliliği hakkında sınırlı bilgi verir. En iyi sperm kalitesini Gübreden potansiyeli değerlendirme göstergesidir.
Son zamanlarda, bizim grup erkek pronuclear oluşumu ve/veya melez embriyo oluşumu zona olduğu gibi sığır yumurta3kullanarak kapaklı tüp bebek sonra değerlendirme tarafından potansiyel gübreleme yunus sperm değerlendirmek için kullanılan bir yöntem. Yunus-sığır kapaklı tüp bebek gibi yunus yumurta elde etme zorluk üstesinden homolog IVF, önemli avantajları vardır ve iyi sınanmış vitro sığır oosit olgunlaşma sistemlerinin kullanımı kolaylaştırır. Türler Özgüllük önlemek amacıyla, kapaklı fertilizasyon genellikle ZP olmaması durumunda gerçekleştirilir. Her ne kadar vitelline membran ile sigorta yeteneği acrosome tepki sperm değerlendirilmesi için sağlar, gübreleme için ilgili diğer özelliklerin değerlendirilmesi bozar. Açıklanan yordamı zona sağlam yumurta kullanır ve izni aşağıdaki parametrelerin değerlendirilmesi: sperm zona bağlama ve eki, penetrasyon, polyspermy, pronuclear oluşumu ve Melez embriyo bölünme.
Burada, çeşitli protokoller sperm toplama, temel sperm analizi, sperm dondurma yanı sıra yunus sperm işlevselliği değerlendirilmesi için kapaklı tüp bebek sonra erkek pronuclear ve/veya melez embriyo oluşumu değerlendirmek tarafından zona olduğu gibi kullanarak mevcut sığır yumurtalar.

<table><tbody><tr><td>FERT-TALP orta</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCM-199</td><td>Sigma</td><td>M-4530</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>B-2261</td><td></td></tr><tr><td>4 kuyulu bulaşıklar</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Yoğunluk gradyanı BoviPure</td><td>Nidacon International</td><td>BP-100</td><td></td></tr><tr><td>Yıkama solüsyonu Boviwash</td><td>Nidacon International</td><td>BW-100</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Promega</td><td>A35 1H</td><td></td></tr><tr><td>Steril su</td><td>Mili Q sintesis A10 Millipore</td><td>A35 1H</td><td></td></tr><tr><td>Tampon Tris Borat EDTA Sigma</td><td></td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>MB agaroz</td><td>Biotools</td><td>20.012</td><td></td></tr><tr><td>5X GoTaq esnek tampon</td><td>Mili Q sintesis A10 Millipore</td><td>M 890 A</td><td></td></tr><tr><td>MB agaroz</td><td>Biotools</td><td>20.012</td><td></td></tr><tr><td>Taq polimeraz</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SafeView</td><td>NBS Biologicals Ltd.</td><td>M 890 A</td><td></td></tr><tr><td>Makler sayma odası</td><td>Sefi Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thoma odası</td><td>Hecht-Asistan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pHmetre MicropH 2000</td><td>Crison Aletleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ozmometre Gelişmiş mikro ozmometre 3300</td><td>Norwood</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bilgisayar destekli sperm analiz sistemi</td><td>Projeksiyonlar y Serveis R+D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop MZ 95</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifloresan optik Eclipse Te300</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokal asistan 4.02 yazılımı</td><td>Bio-Rad</td><td>3D analiz yazılımı</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal lazer tarama mikroskobu</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropippetes (P2. P20, P200, P1000)</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV aydınlatıcı</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Termal döngüleyici Primus 96 Plus</td><td>MWG AG Biotech</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Şişe burunlu yunus (tursiops truncatus) sperm: koleksiyon, dondurma ve kapaklı in vitro fertilizasyon

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Cryopreserved yunus sperm kullanımı su parkları arasında genetik malzeme alışverişini kolaylaştırır ve sperm hücreleri laboratuarlar anlayışımız Deniz memelileri üreme daha ileri çalışmalar için hale getirmektedir. Kapaklı tüp bebek, yerine homolog tüp bebek, sperm doğurganlık potansiyel test etmek için bir araç sağlayabilir; çalışma gamet fizyolojisi ve erken embriyo gelişimi için; ve elde etmek zordur değerli yunus yumurta kullanmaktan kaçının. Burada, başarılı bir şekilde toplamak ve yunus sperm elde cryopreserve için kullanılmış olan protokolleri mevcut. Sperm toplama eğitimli yunuslar üzerinde el ile stimülasyon tarafından gerçekleştirilir. Dondurma TRIS yumurta sarısı dayalı extender gliserol ile kullanılarak yapılır. Buna ek olarak, biz bir protokolü kapaklı tüp bebek yunus sperm hücreleri ve sığır yumurta kullanarak açıklar ve PCR kullanarak elde edilen embriyo hibrid doğası doğrular mevcut. Kapaklı döllenme fertilizasyon tarih soruları yanıtlayan ve çalışma gamet fizyolojisi ve erken embriyo gelişimi için bir araç olarak kullanılabilir. Buna ek olarak, kapaklı tüp bebek başarı daha fazla muayene olan kapasitesi, gübreleme yunus sperm test etmek için bu teknik potansiyelini gösterir.

Tüm sonuçlar, tablo ve şekiller burada sunulan (1 ve 2) izni3ile çoğaltılamaz.
Yunus sperm dondurma ve çözme sonra yüksek hareketlilik var
Dondurulmuş çözdürülen yunus cinsel ilißki oranlarda (% ± SD), 84,5 ± 5.3 Toplam hareketli ve 69.1 ± 5.1 Progresif hareketli sperm hücreleri gösterdi. Motilite açısından, bu yüksek kaliteli cryopreserved sperm t...

Burada, Yunus sperm toplama, dondurma ve sığır yumurta kullanarak kapaklı tüp bebek performansı için başarılı bir şekilde kullanılmıştır protokolleri mevcut.

Şişe burunlu yunus (Tursiops truncatus) sperm: koleksiyon, dondurma ve kapaklı In Vitro fertilizasyon

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

Bu tekniğin genel amacı, kriyoprezerve yunus spermatozoaları ve zona tabakası sağlam sığır oositleri kullanılarak heterolog in vitro fertilizasyon yoluyla, kriyoprezerve yunus sperm fonksiyonelliğini değerlendirmektir. Bu videoda, yunus spermatozoalarının nasıl toplandığını, değerlendirildiğini ve kriyoprezerve edildiğini göstereceğiz. Ardından, sperm etkileşimini ve zona pellucida'ya kadar olan penetrasyonu değerlendireceğiz.Erkek pronükleus oluşumu ve hibrit embriyo bölünmesi. Yardımcı üreme teknolojilerinin gelişimindeki kritik bir sorun, en iyi dölleme yeteneği ile belirtilen sperm fonksiyonunun değerlendirilmesidir. Sperm fonksiyonunun değerlendirilmesi için yaygın olarak homolog IVF teknikleri kullanılmaktadır ancak yunus oositi elde etmek oldukça zordur.Heterolog in vitro fertilizasyonun temel avantajı basitliğidir. Sığır oositleri kolayca elde edilebilir ve iyi test edilmiş protokollerle in vitro olarak işlenebilir. Ayrıca, yunus spermatozoalarının sıvı azot buharları kullanılarak nasıl kriyoprezerve edileceğini de göstereceğiz.Çok uzmanlaşmış dondurma ekipmanları gerektirmeyen basit bir tekniktir. Bu prosedür için erkek yunus, pozitif pekiştirme kullanılarak önceden altı a

bottlenose-dolphin-tursiops-truncatus-spermatozoa-collection

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video-makale-çözülme sonrası sağkalım oranları yüksek bir hamster oosit toplamak ve cryopreserve nasıl bir adım-adım gösteri sunuyoruz. Aynı işlem, başarılı bir şekilde dondurma ve preimplantasyon gelişimi farklı aşamalarında fare embriyoları Çözülme uygulanabilir.

Hamster Oosit ve Fare Embriyolar Toplama ve Kriyoprezervasyon

Bu zebrafish yüksek verimlilik için bir sperm dondurulması protokol. Sperm bu protokolü kullanarak,% 25, ​​sonraki vitro fertilizasyon doğurganlık ortalama ve uzun yıllardır istikrarlı dondurularak saklanabilir.

Zebra balığı sperm Kriyoprezervasyon için bir Yüksek Verim Yöntem ve In Vitro Gübreleme

Fare embriyoları için etilen glikol tabanlı Vitrifikasyon yöntemi açıklanmıştır. , Sadeliği ve düşük embriyonik toksisite diğer yöntemler için avantajlı olduğunu ve bu nedenle farelerin kendilenmiş ve gen modifiye fareler de dahil olmak üzere birçok suşları, genel olarak uygulanabilir.

Etilen Glikol Tabanlı Vitrifikasyon Fare Embriyolar Kriyoprezervasyon

Burada fare sperm dondurulması için yeni geliştirilen I • Cryo kiti göstermektedir. Sperm ile dondurulmuş çözülmüş İki hücreli evre embriyo gelişimi bu kit kullanımı ile 5 fare suşlarının sürekli geliştirildi. 1.5 yıllık bir dönemde, 49 genetiği değiştirilmiş fare hatları I • Cryo kiti ile sperm dondurulması tarafından arşivlendiği ve daha sonra başarılı IVF tarafından kurtarıldı.

I · Cryo Kit kullanarak Fare Sperm Kriyoprezervasyon ve Kurtarma

Zebra balığı, daha yüksek omurgalılarla genetik benzerlikleri nedeniyle gelişimsel biyoloji ve insan hastalıkları araştırmaları için güçlü bir model sistemdir. Bu protokol, erken embriyogenez için gerekli olan genlerdeki resesif mutasyonları tanımlamak için ileri tarama stratejileri için kullanılabilecek haploid zebra balığı embriyoları oluşturmak için bir metodolojiyi açıklar.

Haploit Zebra balığı Embriyolar üretimi ile<em&gt; In Vitro</em&gt; Gübreleme

ploid manipülasyon için değiştirilmiş bir protokol, erken embriyoda sitokinez bir tek çevrim durak uyarılması için bir ısı şoku kullanır. Bu protokol zebrabalıkları gösterilmiştir, ancak diğer türlere uygulanabilir.

Isıl Şok 2 Tedavi ile Zebra balığı Embriyolar ploidisi Manipülasyon

Bu çalışmanın temel amacı iğne adapte Vitrifiye (NIV) yordamı tüm Zebra balığı testis cryopreserve dalmış oldu. Ayrıca, beş farklı Zebra balığı suşları yönteminde tekrarlanabilirlik test edildi.

Zebra balığı Spermatogonia bütün testis iğne tarafından dondurma hızlı soğutma dalmış

Mevcut iletişim kuralını kullanarak bilgisayar destekli sperm analizi ve soğutma aygıtlarının balık sperm değerlendirmesi bir yordam açıklanır. Yazılım bir hızlı, doğru ve kantitatif analiz yetiştiricilik üreme başarı geliştirmek için yararlı bir araç olabilir sperm hareketliliği göre balık sperm kalitesi verir.

Yazılımı kullanarak ve soğutma aygıtlarının balık Sperm değerlendirmesi

İletişim kuralları Avrupa yılan balığı olgunlaşma ve sperm dondurma için son yıl içinde geliştirilmiştir. Bu makalede, en iyi Protokolü olgunlaşma ve cryoprotectant olarak metanol inducing için insan Korionik gonadotropin (hCG) kullanarak kullanılabilir.

Kullanım ve tedavi, erkek Avrupa yılan balığı (Anguilla anguilla) Hormonal olgunlaşma ve Sperm dondurma için

Bu protokol, genetik çeşitliliği güvence altına almayı ve resif restorasyon çabalarını desteklemeyi amaçlayan, tehdit altındaki mercan türlerinden spermin işlenmesi ve dondurularak saklanmasının verimliliğini ve kapasitesini artırmak için yarı otomatik bir yolu tanımlar.

Biyobankacılık ve su ürünleri yetiştiriciliğini desteklemek için mercan spermlerinin dondurularak saklanması için yarı otomatik bir iş akışı

Bu protokol, kriyokonsertif at menisinden canlı somatik hücreleri (SC'ler) izole etmek için basit bir mikroaspirasyon tekniği sunar. Geleneksel yaklaşımların aksine, bu teknik uzun in vitro kültürlerden kaçınır ve sperm kontaminasyonunu engeller; böylece somatik hücre klonlamasında hemen kullanılmasını sağlar.

Klonlama için Nükleer Donör olarak Kryokonserif At Sperminden Somatik Hücreleri İzole Etmek İçin Basit Bir Mikroaspirasyon Tekniği

Keşfedin şişe burunlu yunus spermi toplama, dondurma ve heterolog in vitro fertilizasyon yöntemlerini. Tursiops truncatus sperminin işlevselliğini değerlendirmek için sığır oositleri kullanılan bu teknik, üreme biyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

Şişe burunlu yunus (Tursiops truncatus) sperm: koleksiyon, dondurma ve kapaklı In Vitro fertilizasyon

Daha fazla video keşfet