Name: Yoluyla mantarlarda hızlı Silme Üretimi Agrobacterium OSCAR Silme Yapılarının Aracı Dönüştürülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Öğrenin mantarlarda hızlı gen silme mutantı üretimini Agrobacterium aracılı dönüşüm ve OSCAR yöntemiyle. Bu teknik fonksiyonel genetik araştırmalarında gen işlevlerini hızla ortaya koyar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Fusarium verticillioiodes&#39;de OSCAR mutantları üretmek için yaptıkları çalışmalar için aşağıdaki lisans ve lise öğrencilerine teşekkür ederler : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez , Ashle Crepsac, Jeff Delong, Christie Burre, Christie Burre, Daniel O&#39;Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum , Chris Benson, Louis Stokes, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre&#39;Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin , Thi Ngoc Le ve Angel Pham.

1. Gen Flanlarının PCR Amplifikasyonu için Primer Tasarım <ol><li> Açık okuma çerçevesi (ORF) de dahil olmak üzere ilgili genin (GOI) genomik bölgesini ve diğer taraftan geni çevreleyen en az 2 kb&#39;yi, FungiDB&#39;den veya diğer genomik veri kaynağından gelen bir kelime işlem dosyasına indirin. </li><li> Silme ve etiketi başlatma ve durdurma kodonları için amaçlanan ORF&#39;yi vurgulayın. </li><li> İndirilen sekans içinde bitişik ORF&#39;leri belirleyin ve vurgulayın. </li><li> 1 kb&#39;lik asgari bir ürün üretmek için PCR primer çifti O1 ve O2&#39;yi tasarlamak için GOI ORF&#39;nin ve primer tasarım aracının 2 kb&#39;lik 5 &#39;ucunu kullanın (bkz. Malzeme Listesi). Bitişik ORF&#39;leri etkilemeye dikkat edin. <ol><li> 2 kb 5 &#39;kenarını &quot;Sıra Giriş&quot; penceresine yapıştırın. &quot;Özel Parametreleri Göster&quot; kutusunu tıklayın. Aşağıdaki özel tasarım parametrelerini girin: primer TM 58 (dak), 60 (opt) ve 62 (maks.); Astar GC 40 (dak), 50 (opt) ve 60 (maks.); Astar Boyu 22 (dak), 24 (opt) ve 26(Maks); Amplikon Boyutu 1250 (min), 1500 (opt) ve 2000 (maks.). </li><li> ORF&#39;ye en yakın ters primeri (O2) yerleştiren sonucu seçin. Testlerin bir ekran görüntüsünü çekin ve astar dizilerini kopyalayıp kelime işlem belgesine yapıştırın. </li><li> O3 ve O4 primerleri oluşturmak için 3 &#39;kenar için işlemi tekrarlayın, bu sefer hedef ORF&#39;ye en yakın ileri primeri (O3) yerleştiren sonucu seçin. </li></ol></li><li> 1&#39;den 4&#39;e kadar olan primerlerin 5 &#39;uçlarına uygun bağlantı yerleri ekleyin (bkz. Tablo 1 ). </li><li> Ayrıca aşağıdaki bölüm 4&#39;te silme doğrulaması için kullanılacak ORF&#39;ye özgü primerler tasarlayın ve sipariş edin. Gerekirse ORF uzunluğu için ayarlanan Amplicon Boyut 500 (min), 750 (opt) ve 1000 (maks.) Değerlerini kullanmak dışında, parametreler adım 1.4.1&#39;deki ile aynı olmalıdır. Son olarak, homolog rekombinantların doğrulanması için, kromozomun içindeki kanadın hemen dışında bulunan 5 &#39;çıkış ve 3&#39; çıkış primerleri üretin. Bu &quot;dışarı&quot; primerleri ile birlikte kullanılacaktır.Sırasıyla hygR (210) ve hygF (850) ( Şekil 2 ). </li><li> Astar sipariş et. </li></ol> 2. OSCAR Yapılarının Üretimi <ol><li> Bir yüksek doğruluğa sahip Taq kullanarak, bir reaksiyonda primerler (100 uM) O1 ve O2 ve ikinci sırada O3 ve O4 primerleri kullanarak, her biri 5 &#39;ve 3&#39; kenarlar için iki reaksiyon gerçekleştirin. Reaksiyon karışımı aşağıdakileri içerir: 29.5 uL steril damıtılmış su (SDW), 5 uL 10x LA PCR tamponu, 8 uL 2.5 mM dNTP karışımı, 5 uL 25 mM MgCl2, 1 uL şablon (50 ng / μL), 0.5 uL hi- Fidelite Taq , 0.5 μL Primer O1 ve 5 &#39;kenar için 0,5 μL Primer O2 (veya 3&#39; kenar için 0.5 μL Primer O3 ve 0.5 μL Primer O4) Kullanım reaksiyon koşulları aşağıdaki gibidir: 94 ° C&#39;de 1 dakika, daha sonra 30 çevrim 94 ° C 30 saniye, 60 ° C 30 saniye, 72 ° C 2 dakika sonra nihai adımlar 72 ° C&#39;de 5 dakika ve daha sonra süresiz olarak 10 ° C&#39;de tutulur. </li><li> Çalıştırma% 0,8Ürün boyutunu ve göreceli konsantrasyonu belirlemek için standart bir minigel aparatında yaklaşık 125 Vh için agaroz 1x TAE (40 mM Tris asetat pH 8.3, 1 mM EDTA) jel elektroforezi. Post, üreticinin talimatlarına uygun olarak etilyumum lekeli jel boyayı verin. UV aydınlatıcı üzerinde görselleştirin. </li><li> 5 &#39;ve 3&#39; kanatlı ürünler kabaca konsantrasyonda ise bunları birleştirin ve bir afinite kolonu kiti (veya PEG çökeltisi 90 μL kombine PCR ürünleri, 240 μL TE tampon pH 7.5, 160 μL% 30 polietilen glikol PEG8000 30 mM MgCl2 2 ) PCR ürünlerini üreticinin protokolüne göre birlikte saflaştırmak için. Eğer eşit konsantrasyonda değillerse, düşük konsantrasyonlu ürünlerin hepsini yüksek verim reaksiyonundan tahmini eşit miktarda ürünle birleştirin. </li><li> Saf DNA konsantrasyonunu ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. </li><li> Aşağıdakileri karıştırarak BP tepkimesini gerçekleştirin: 1 ng / mL&#39;lik 60 ng / ml&#39;lik bir pOSCAR, 2 ngL&#39;lik 60 ng /ΜL pA-Hyg-OSCAR, 1 μL 60 ng / μL kombine kenarlar, 1 uL klonaz. 25 ° C&#39;de 16 saat inkübe edin. 0.5 uL proteinaz K ekleyerek reaksiyonu durdurun ve 37 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edin. </li><li> Yüksek yeteneği dönüştürme E. Coli hücreleri. Hem piyasada bulunan yetkili hücreler hem de ev yapımı DH5α CaCl 2 yetkili hücreleri, imalatçının talimatlarına göre alıcılar olarak başarıyla kullanılmıştır. 100 μg / mL spektinomisin (Spek) içeren düşük sodyum (0.5 g / L NaCl) LB plakası. </li><li> Yukarıda oluşturulan kolonilerin 10&#39;unu DNA minipreps 10 uygulayarak doğru yapıyı belirleyin. Hin dIII ve Kpn I ile aşağıdaki gibi iki sindirim gerçekleştirin: pipet 5 mcL DNA, her bir enzimden 2 U, 20 mcL toplam hacim için SDW ile 2 mcL uygun 10x tampon. Bu, vektörden ( yaklaşık 7 kb) insert&#39;i (yaklaşık 1.5 kb gen yanları ile 4.5 kb) serbest bırakır veÖngörülebilir bant boyutları verebilen kenarlar. </li><li> Sıra 11 , uygun bir bantlama kalıbı gösteren klonları seçin. </li></ol> 3. Mantarlar Agrobacterium tumefaciens Aracı Dönüşüm (ATMT) <ol><li> Agrobacterium tumefaciens AGL1 soyunu OSCAR silme yapısı ile değiştirin 12 . </li><li> GOI OSCAR silme plasmidini içeren AGL1 ile mantarları dönüştür. Bunu yapmak için aşağıdaki adımları uygulayın: <ol><li> 2 x 10 6 spor / mL&#39;de steril su ile mantar spor süspansiyonu hazırlayın. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı üzerinde sporları ölçün. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne 500 μL yerleştirin. Bu ayar, 4 dönüşüm plakası içindir. </li><li> 2-3 günlük eski LB-Spec 100 ortamından AGL1 ihtiva eden silme plazmidinin görünür bir tıkaç (halka çapının% 20&#39;sini kaplaması gerekir) eklemek için mavi steril tek kullanımlık bir halka kullanın (bkz. MAterials Kompozisyon listesi) içeren plakaları karıştırın ve spor süspansiyonuna karıştırın. Bakteri hücreleri iyi dağılıncaya kadar ( yaklaşık 5 dakika orta hız) girdap. </li><li> Birlikte yetiştirme ortamı içeren dört adet 6 cm&#39;lik Petri kaplarının her birine yerleştirilen bir selüloz zar filtresinin merkezine konidya-Agro süspansiyonundan 100 uL pipetleyin. </li><li> Süspansiyonu membran filtrenin tüm yüzeyini kaplayacak şekilde steril cam boncuklar (yaklaşık 4) ile yayın. Alternatif olarak, süspansiyonu geleneksel bir yayma aracı kullanarak yayabilirsiniz. Zar filtresinin bir kaputta yaklaşık 10 dakika kurumasını bekleyin, parafin filmle sarın. Birden fazla dönüştürme kurmak için 3.2.2 ve 3.2.3 adımlarını yineleyin. </li><li> Plakayı, oda sıcaklığında 2 gün inkübe edin, ters çevirin. </li><li> Membran filtreyi, higromisin B (Hyg) 150 ug / mL, 200 mM sefotaksim ve 100 ug / mL içeren 6 cm Aspergillus seçim ortamı 12 plakasına aktarınmoxalactam. Hig dirençli kolonileri izole etmeden önce oda sıcaklığında 5-7 gün inkübe edin. </li><li> Steril kürdan ile, tahmin edilen transformantları, 150 μg / mL Hyg, 100 ug / mL kanamisin içeren 6 cm Potato Dextrose Agar (PDA) plakalarına aktarın. </li></ol></li></ol> 4. PCR ile silme mutant tanımlanması <ol><li> Termoliz ile transformantlardan PCR için DNA çıkarın 13 . <ol><li> Dönüşümcüler, adım 3.2.7&#39;den itibaren PDA üzerinde koloniler oluşturduktan sonra, koloni içindeki küçük miktarda (2 mm x 2 mm) miselyum veya maya hücrelerini lizis çözeltisinin 100 μL&#39;sine (50 mM sodyum fosfat, pH) aktarmak için steril bir kürdan kullanın. 7.4, 1 mM EDTA,% 5 gliserol) ilave edildi. </li><li> Karışımı 85-90 ° C&#39;de 20-30 dakika inkübe edin. Adım 4.2&#39;de kullanılıncaya kadar, genomik DNA içeren ham özütü -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Dönüştürücü başına 4 PCR reaksiyonu gerçekleştirin;Seçilebilen markör (bu durumda higromisin fosfotransferaz) ve bir tane de GOI ORF için, 5 &#39;ve 3&#39; yanlarının sırasıyla homolog yeniden birleştirilmesi. NOT: Genellikle bu reaksiyonlar için düşük maliyetli, ucuz Taq kullanırız. Tepkime koşulları yukarıdaki 2.1 adımında tarif edildiği gibidir ve SDW 20 uL, 10x Taq tampon 2.5 uL, dNTPS (10 mM) 0.5 uL, ev yapımı Taq 14 , 0.5 uL, Primer A (100 uM) 0.5 uL, Primer B (100 uM) ) 0.5 uL, Şablon 0.5 uL. Daha düşük konsantrasyonda primer stokları (10 uM) eşit derecede kullanılabilir. </li><li> PCR ürünlerinin agaroz jelini ( örn. % 0.8) çalıştırın. Silme mutantları, bir ORF ürününü değil, Hyg bandını üretir. Ektopik bütünleştiriciler iki bandı gösterecek. Vahşi tip sadece ORF bandı üretecektir. </li><li> Silinme mutantlarını (ve ektopik transformant veya kontroller için ikisi) gelecekte kullanmak üzere kalıcı olarak saklayın. NOT:% 15 gliserol,Suşlarımızı -80 ° C&#39;de uzun vadeli yırtıyorduk. </li></ol>

<ol><li>Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+step+construction+of+Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids+%28OSCAR%29%2C+an+efficient+and+robust+tool+for+ATMT+based+gene+deletion+construction+in+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%22%5BJournal%5D)">One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi.</a> Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Klosterman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+yields+insights+into+niche+adaptation+of+plant+vascular+wilt+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens.</a> PLoS Pathog. 7 (7), (2011).</li>
<li>Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+knockout+in+the+maize+pathogen+Setosphaeria+turcica+using+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation.</a> Phytopathology. 103 (6), 641-647 (2013).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+gene+disruption+methodology+for+the+entomopathogenic+fungus+Metarhizium+robertsii%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii.</a> PloS One. 9 (9), (2014).</li>
<li>Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUBT%2C+a+putative+MFS+transporter%2C+promotes+secretion+of+fusaric+acid+in+the+cotton+pathogen+Fusarium+oxysporum+f.+sp.+vasinfectum%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum.</a> Microbiology. 161, 875-883 (2015).</li>
<li>Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s13213-015-1055-8">High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora.</a> Ann Microbiol. 65 (4), 2151-2160 (2015).</li>
<li>Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genetic+Screen+for+Pathogenicity+Genes+in+the+Hemibiotrophic+Fungus+Colletotrichum+higginsianum+Identifies+the+Plasma+Membrane+Proton+Pump+Pma2+Required+for+Host+Penetration%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration.</a> PloS One. 10 (5), e0125960(2015).</li>
<li>Chettri, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Regulation+of+dothistromin+toxin+biosyn+by+the+pine+needle+pathogen+Dothistroma+septosporum%3A+a++presented+in+the+partial+fulfilment+of+the+requirements+for+the+degree+of+Doctor+of+Philosophy+%28%29+in+Genetics+at+Massey+University%2C+Manawatu%2C+New+Zealand%22">Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand </a>. , Massey University. Manawatu, New Zealand. (2014).</li>
<li>Chen Zhou,, Yujun Yang,, Jong, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-prep+in+ten+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mini-prep in ten minutes.</a> Biotechniques. 8 (2), 172(1990).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+SciUSA%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> P Natl Acad SciUSA. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhang%2C+CH+%22Agrobacterium+Protocols%22">Agrobacterium Protocols</a>. Wang, K. an 2, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 403-420 (2007).</li>
<li>Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+genomic+DNA+extraction+suitable+for+analysis+of+bulk+fungal+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains.</a> Lett Appl Microbiol. 51 (1), 114-118 (2010).</li>
<li>Pluthero, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+high-activity+Taq+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase.</a> Nucleic Acids Res. 21 (20), 4850-4851 (1993).</li>
<li>McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCluskey%2C+K+%22Gene+Expression+Systems+in+Fungi%3A+Advancements+and+Applications%22">Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications</a>. , Springer International Publishing. 361-384 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bir Adım Agrobacterium Yapısı -Rekombinasyona hazır plazmid (OSCAR), gittikçe artan sayıda Ascomycota mantarları ile başarıyla kullanılmıştır. Yöntem, Basidiomycota&#39;ya ve diğer fungal filumlardan (seçilebilir markör genleri sürükleyen uygun promotörler ile birlikte) olan türlere, Agrobacterium aracılı transformasyon ve homolog rekombinasyonun mümkün olduğunu varsayarak kolayca uygulanabilir olmalıdır. Anti-mantar bileşiğinin seçeneklerini çeşitlendirmek ve çift ve daha yüksek dereceli mutantların ü...

Genetik diseksiyon, bireylerin veya gen kombinasyonlarının fonksiyonel önemini belirlemek için güçlü bir metodolojidir. Spesifik genlerin rolünü anlamak için standart bir yaklaşım, başka herhangi bir gende değiştirilmemiş tek gen mutantlarının üretilmesidir. En güçlü ve en az potansiyel olarak karıştırıcı yaklaşım, başka bir gen fonksiyonuna zarar vermeden, ilgi alanının açık okuma çerçevesinin (GOI ORF) eksiksiz ve kesin bir şekilde silinmesidir. Silme plasmidinin üretilmesi için standart ligasyon yaklaşımları çoklu adımları gerektirdiğinden, OSCAR 1 için rasyonel , in vitro daha hızlı bir yaklaşım üretmektir. Şekil 1 OSCAR yaklaşımındaki montaj sürecini göstermektedir. Burada açıklanan yöntem, bireysel gen silme vektörlerinin hızlı yapımını, tekli çok parçalı bir reaksiyonda, sonraki Agrobacterium tumefaciens aracılı transfo ile kombinasyon halinde birleştirmenin avantajına sahiptirRmation (ATMT). OSCAR çok hızlıdır ve maya 2&#39;de Gibson grubunun kullanımı gibi diğer stratejilerle iyi bir karşılaştırma yapmaktadır. OSCAR yöntemi, birkaç Ascomycota mantar türü ile başarıyla kullanılmıştır. Bu türler şunları içerir: Fusarium verticillioides (yayımlanmamış), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 ve Dothistroma septosporum 9 ve Sarocladium zeae (yayınlanmamış) . Bu protokol, primer tasarımı, flank PCR amplifikasyonu, OSCAR BP reaksiyonu, silme yapısı yapısı onayı, transformat gibi yöntem için adım adım talimat sağlarİyonunu Agrobacterium&#39;un yapısı ile, ardından da silme konstruktunun mantar hücrelerine ATMT&#39;ye dayalı olarak aktarılmasını ve nihayet mantar delesyon mutantlarını ektopik olarak entegre edilmiş silme yapılarıyla olanlardan ayırt eder.

<table><tbody><tr><td>FungiDB</td><td></td><td></td><td>Veritabanı/ http://fungidb.org/fungidb/</td></tr> <tr><td>IDT PrimerQuest</td><td>IDT</td><td></td><td>Primer tasarımı çevrimiçi yazılım/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index</td></tr><tr><td>Microsoft Word</td><td></td><td></td><td>Dizisi dosya manipülasyonu</td></tr><tr><td>Düşük Na LB Spec 100 orta</td><td></td><td></td><td>E. coli dönüştürücü seçimi, bileşim: %1 tripton, %0.05 NaCl, %0.5 maya özütü, katı ortam için ise %1.5 agar</td></tr><tr><td>Birlikte yetiştirme ortamı</td><td></td><td></td><td>ATMT dönüşüm indüksiyonu (Referans 12)</td></tr><tr><td>Higromisin</td><td></td><td></td> ile Aspergillus minimal ortamı <td>Mantar dönüştürücü seçimi</td></tr><tr><td>PDA ortamı</td><td>Acumedia</td><td>7149A</td><td></td></tr> <tr><td>Tek spor eğimli tüplerPDA-Hyg-Kan orta</td><td></td><td></td><td>Fungal ransformant izolasyonu, 150 & mu içeren PDA; g / mL higromisin B ve 100 &mu; g / mL Kanamisin</td></tr><tr><td>Cam boncuklar</td><td>Genlantis</td><td>C400100</td><td>Plaka yayma</td></tr><tr><td>Nitroselüloz filtreler (47 mm)</td> <td>Fisher</td><td>09-719-555</td><td>ATMT için ortak kültürleme</td></tr><tr><td>Çeşitli kırlangıç tüpleri</td><td></td><td></td><td>çoklu hazırlıklar</td></tr><tr><td>Petri plakaları (çeşitli)</td><td></td><td></td> <td>Bakteri ve Mantarların Kültürü</td></tr><tr><td>pA-Hyg OSCAR</td><td>Addgene</td><td>29640</td><td>Seçilebilir işaretleyici vektör</td></tr><tr><td>pOSCAR</td><td>Addgene</td><td>29639</td><td>Montaj vektörü</td></tr><tr><td>DH5&#945; Tek Atım Yetkin E. coli cells</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp;</td><td>12297-016</td><td>BP reaksiyon dönüşümü</td></tr><tr><td>ccdB sağkalım E. coli hücreleri</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp;</td><td>A10460</td><td>pOSCAR'ın bakımı</td></tr><tr><td>Ahşap transfer çubukları</td><td></td><td></td><td>Koloni çizgili</td></tr><tr><td>Kürdan</td><td></td><td></td><td>Koloni toplama</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td></td><td></td><td>Peletleme Bakteriler, etc.</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Hazırlayıcı santrifüj</td><td>Mantar sporları toplama</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td></td><td></td><td>Tek spor izolasyonu</td></tr><tr><td>Otomatik Hücre Sayacı</td><td></td><td></td><td>Spor süspansiyon hesaplaması</td></tr><tr><td>Bileşik mikroskop</td><td></td><td></td><td>Hemositometre hücre sayımı</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Saflaştırma Kiti&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>PCR geni yan ürün saflaştırması</td></tr><tr><td>TaKaRa LA Taq&nbsp;</td><td>Takara Bio USA</td><td>RR002A</td><td>OSCAR kanat üretimi için Hi Fidelity taq polimeraz</td></tr><tr><td>Higromisin B</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg-5</td><td></td></tr><tr><td>Spektinomisin</td><td>Sigma</td><td>22189-32-8</td><td></td></tr><tr><td>Sefotaksim</td><td>TCI Amerika</td><td>C2224</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td></td><td>11815032</td><td></td></tr><tr><td>Mokzalaktam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43963</td><td></td></tr><tr><td>JelRed</td><td>&nbsp; Phoenix Araştırma Ürünleri</td><td>RGB-4103</td><td>Boyama sonrası agaroz jeller</td></tr><tr><td>Qiagen QIAquick PCR Saflaştırma Kiti (Kat. No. 28104)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(OneShot_ Mach1TM T1R veya One Shot_ OmniMAX&trade; Invitrogen'den 2 T1R)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C862003</td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II Enzim karışımı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11789020</td><td>pOSAR'da delesyon yapısını birleştirmek için kullanılır</td></tr></tbody></table>

yoluyla mantarlarda hızlı silme Üretimi<em&gt; agrobacterium</em&gt; oscar silme yapılarının aracı dönüştürülmesi

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Gereksinim genini geri kalanını değiştirmeden kesin bir şekilde çıkarmak, canlıdaki organizmada belirli bir genin işlevini belirlemek için ideal bir ürün sağlar. Bu protokolde, hassas ve hızlı silme plazmid konstrüksiyonu OSCAR yöntemi anlatılmıştır. OSCAR, ilgilenilen genin saflaştırılmış PCR ile güçlendirilmiş 5 &#39;ve 3&#39; yanları ve pA-Hyg OSCAR (işaretleyici vektör) ve pOSCAR (birleştirme grubu) olmak üzere tek bir rekombinaz reaksiyonunun gerçekleştirildiği klonlama sistemine dayanmaktadır. vektör). Doğru monte edilen silme vektörünün doğrulanması, kısıtlama sindirim haritalaması ve bunu takiben sıralama ile gerçekleştirilir. Agrobacterium tumefaciens daha sonra silme yapısının fungal sporlara (ATMT olarak anılacaktır) yönlendirilmesine aracılık etmek için kullanılır. Son olarak, silme yapısının homolog veya homolog olmayan rekombinasyon ile entegre edilip edilmediğini belirlemek için bir PCR testi tarif edilmiştir, bu, gen silinmesini veyaSırasıyla ektopik entegrasyon. Bu yaklaşım Verticillium dahliae&#39;de ve Fusarium verticillioides&#39;de diğer türler arasında çok sayıda genin silinmesi için başarıyla kullanılmaktadır .

Tek bir reaksiyonda OSCAR yöntemi, seçilebilir işaretleyici kaseti çevreleyen silinilecek hedef genin yanlarını içeren bir plazmid üretir. OSCAR kullanarak silme yapılarının üretilmesi çok etkilidir. Bununla birlikte, sistem, bazı parçacıkları içermeyen kısmi yapılar (iki gen kenarı ve seçilebilir işaretleyici) üretebilir. Genellikle, E. coli transformantlarının çoğunluğu doğru OSCAR yapısını içerir. Örneğin, Şekil 2 , Verticillium dahliae geni VDAG_068...

Homolog rekombinasyon yoluyla üretilen gen silme mutantları, gen fonksiyonu çalışmaları için altın standarttır. Silme yapılarının hızlı oluşturulması için OSCAR (Agrobacterium-Rekombinasyona hazır plasmidler&#39;in Bir Adımlı Yapısı) yöntemi anlatılmıştır. Agrobacterium aracılı fungal transformasyon izlenir. Son olarak, fungal transformantlarda gen çıkarılmalarının PCR tabanlı onay yöntemi.

Yoluyla mantarlarda hızlı Silme Üretimi<em&gt; Agrobacterium</em&gt; OSCAR Silme Yapılarının Aracı Dönüştürülmesi

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

Bu prosedürün genel amacı, funguslarda hassas gen delesyon mutantları oluşturmaktır. Bu yöntem, fungusların hastalık yapma yeteneğinde belirli bir ilgi odağı olan genin nasıl bir rol oynadığı gibi, fungusların fonksiyonel genetiğine dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hassas delesyonlar oluşturmak için plazmidlerin çok hızlı bir şekilde inşa edilmesine olanak tanımasıdır.Bu yöntem, etkili bir homolog rekombinasyon sistemine sahip olan her türlü mantar hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca protist veya vermilyon hücreleri gibi diğer sistemlere de potansiyel olarak uygulanabilir. Bu yöntemle ilgili ilk fikri, Oscar ile ilişkili olan ancak agrobacterium aracılığıyla değil, protoplast transformasyonu için kullanılan DelsGate sistemini geliştirdiğimizde edindik.Optimize edilmiş veya sezgisel olmayan birçok adım olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Prosedürü My Laboratory'den teknisyen Nicole Crenshaw sunacaktır. Primer tasarlamaya yönelik bu strateji, ilgilenilen genin açık okuma çerçevesini ve genin her iki yanındaki en az iki kilobaslık flanke bölgeleri içeren genomik bölgenin bir kelime işlemci dosyasında bulunmasını gerektirir.Silinmesi planlanan açık okuma çerçevesini vurgulayarak başlayın ve başlangıç ve stop kodonlarını işaretleyin. İndirilen sekans içerisindeki komşu açık okuma çerçevelerini belirleyin ve vurgulayın. Ardından, ilgilenilen genin açık okuma çerçevesinin beş prime flanaları için PCR primerleri tasarlamak üzere bir primer tasarım aracı kullanın.En az 1 kb boyutunda bir ürün elde etmek için, ilgilenilen genin açık okuma çerçevesinin 5' ucundaki 2 kb'lık bölgeyi kullanarak O1 ve O2 PCR primer çiftini tasarlayın. Ters O2 primerini açık okuma çerçevesine en yakın konuma yerleştiren sonucu seçin. Bitişikteki açık okuma çerçevesinin etkilenmediğinden emin olun.Deneylerin ekran görüntüsünü alın ve primer dizilerini kelime işlemci belgesine kopyalayıp yapıştırın. O3 ve O4 primerlerini oluşturmak için işlemi üç primer flanğı için tekrarladıktan sonra, dört primerin beş primandına uygun ekleme bölgeleri ekleyin. Son olarak, metin protokolündeki talimatları izleyerek delesyon onayı ve homolog rekombinasyon onayı için kullanılacak primerleri tasarlayın.Bu prosedüre biri 5' flanğı, diğeri ise 3' flanğı için olmak üzere iki PCR reaksiyonu hazırlayarak başlayın. Her iki reaksiyon karışımına şunları ekleyin: 29,5 µL steril distile su, 5 µL 10x LA PCR tamponu, 8 µL 2,5 mM dNTP karışımı, 5 µL 25 mM magnezyum klorür, 1 µL kalıp ve 0,5 µL hi-fidelity Taq. 5' flanğı için olan reaksiyona 0,5 µL Primer O1 ve 0,5 µL Primer O2 ekleyin. 3' flanğı için olan reaksiyona 0,5 µL Primer O3 ve 0,5 µL Primer O4 ekleyin. PCR'ı şu reaksiyon koşullarında gerçekleştirin: 1 dakika boyunca 94 °C, ardından 30 siklus boyunca 30 saniye 94 °C, 30 saniye 60 °C ve 2 dakika 72 °C; son olarak, süresiz olarak 10 °C'de bekletilmeden önce 5 dakika boyunca 72 °C'de final adımı.Ürün boyutunu ve göreceli konsantrasyonu belirlemek için, PCR ürünlerine standart bir mini-gel apparatusında 0.8% agar içeren 1x TLE jelinde yaklaşık 125 volt saat boyunca elektroforez uygulayın. Jeli, üretici talimatlarına göre etidyum içermeyen bir boyayla sonradan boyayın ve bir UV illuminator üzerinde görüntüleyin. Eğer beş-prime ve üç-prime flanklar yaklaşık olarak eşit konsantrasyonlardaysa, bunları birleştirin.Konsantrasyonları eşit değilse, düşük konsantrasyonlu ürünü, yüksek verimli reaksiyondan elde edilen tahmini eşit miktardaki ürünle birleştirin. PCR ürünlerini üretici protokolüne göre birlikte saflaştırmak için bir infinity column kiti kullanın. Ardından, şunları karıştırarak BP klonaz reaksiyonunu gerçekleştirin: bir mikrolitre montaj vektörü, iki mikrolitre marker vektörü, bir mikrolitre birleştirilmiş flankler ve bir mikrolitre klonaz.25 °C'de 16 saat inkübe edin. 0,5 µL proteinaz-K ekleyip 37 °C'de 10 dakika inkübe ederek reaksiyonu sonlandırın. BP reaksiyonu ile E.coli hücrelerini transforme edip metin protokolünde açıklandığı şekilde DNA'yı izole ettikten sonra, HindIII ve KpnI ile çift sindirim gerçekleştirerek doğru konstrüktü belirleyin.Çift sindirim sekanslaması ile OSCAR delesyon konstrüktünün tanımlanmasının ardından, konstrükt agrobacterium tumefaciens suşu AGL1'e transforme edilir. Bir sonraki adım, OSCAR delesyon konstrüktünü içeren AGL1 ile fungusları transforme etmektir. Steril su ile mililitrede 2 × 10⁶ spor konsantrasyonuna sahip bir fungal spor süspansiyonu hazırlayarak başlayın.Sporlar seyreltildikten sonra, fungal spor süspansiyonundan 500 microliter alarak 1,5 mililitrelik bir mikro-santrifüj tüpüne yerleştirin. AGL1 içeren delesyon plazmidinden kolayca görülebilir bir miktar eklemek için mavi steril tek kullanımlık bir öze kullanın. Bakteriyel hücreler iyice dağılana kadar vorteksleyin.Ortak kültüre ortamı içeren dört adet altı santimetrelik petri kabının her birine bir selüloz membran filtre yerleştirin ve ardından her kaba yaklaşık dört adet steril cam boncuk ekleyin. Her bir membran filtrenin merkezine 100 µL konidya agar süspansiyonu pipetleyin ve süspansiyonu, membran filtrenin tüm yüzeyini kaplayacak şekilde boncuklar yardımıyla yayın. Boncukları çıkardıktan sonra, membran filtrelerin çeker ocak içinde yaklaşık on dakika boyunca kurumasına izin verin ve ardından petri kaplarını parafin film ile sarın.Kapları ters çevirin ve oda sıcaklığında iki gün boyunca inkübe edin. İki gün sonra, her bir membran filtreyi Hygromycin B ve kanamisin içeren altı santimetrelik bir agar jel seçici besiyeri plağına aktarın. Oda sıcaklığında beş ila sekiz gün boyunca inkübe edin.Hygromycin-dirençli kolonları izole etmek için, muhtemel transformantları Hygromycin ve kanamisin içeren altı santimetrelik patates dekstroz agar plaklarına aktarmak amacıyla steril kürdanlar kullanın. Plakları oda sıcaklığında inkübe edin. Transformantlar plaklar üzerinde kolonlar oluşturduğunda, kolonlardan küçük bir miktar miselyum veya maya hücresini bir mikro santrifüj tüpündeki 100 µL lize çözeltisine aktarmak için steril bir kürdan kullanın.Karışımı 85 ila 90 °C'de 20 ila 30 dakika boyunca inkübe edin. Genomik DNA içeren ham ekstraktı, PCR işlemini gerçekleştirene kadar -20 °C'de saklayın. Delesyon mutantlarını tanımlamak için, öncelikle her bir transformant için ilgili genin açık okuma çerçevesini ve seçilebilir belirteci tespit etmek amacıyla PCR gerçekleştirin.OSCAR konstrüktlarının üretimi için aynı reaksiyon koşullarını kullanın. Tek spor izolasyonu ve termal lizis sonrası, açık okuma çerçevesi ve Higromisin için PCR'ı ve ayrıca beş-prime ile üç-prime flanların homolog rekombinasyonunu saptamak için PCR'ı tekrarlayın. Ardından, PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezini gerçekleştirin.OSCAR yöntemi, bu örnekte bir verticillium dahliae geni olan silinecek hedef genin yan bölgeleriyle çevrelenmiş, seçilebilir marker geni içeren bir plazmid oluşturur. Çift sindirim yapıldığında, bu vakada 4, 247 baz çiftlik bir insertin salınması, beşinci ve 11. şeritler hariç tüm şeritlerde plazmid yapısının doğru olduğunu doğrular. Silinmeyi doğrulamak için bir PCR yaklaşımı kullanılır.Bu örnek, beş Fusarium verticillioides transformantının analizini göstermektedir. Üstteki jelde, iki ile altı arasındaki şeritler 5' flank amplifikasyonlarını, yedi ile 11 arasındaki şeritler ise açık okuma çerçevesi (ORF) amplifikasyonlarını temsil etmektedir. Alttaki jelde, iki ile altı arasındaki şeritler seçilebilir marker geni amplifikasyonlarını, yedi ile 11 arasındaki şeritler ise 3' flank amplifikasyonlarını göstermektedir.Beş-prime flank, üç-prime flank ve seçilebilir markör geni amplifikasyonlarında bantların görülmesi ve açık okuma çerçevesi amplifikasyonunda bantların yokluğu, 1131, 1132 ve 1133 suşlarının delesyon transformantları olduğunu doğrular. Açık okuma çerçevesi ve seçilebilir markör genleri amplifikasyonlarında bantların görülmesi, beş-prime flank ve üç-prime flank amplifikasyonlarında ise bantların yokluğu, 1134 ve 1135 suşlarının atopik transformantlar olduğunu gösterir. Gen delesyonları ayrıca Southern blot ile de doğrulanabilir.Bu teknik bir kez kavrandığında, sekanslama süresi hariç olmak üzere, iki gün içinde fungal transformasyonlar için hazır Oscar delesyon plazmidleri üretilebilir. Bu prosedürü uygularken, yüksek sadakatli (hi-fidelity) Taq ön hazırlıklarının kullanıldığını hatırlamak ve komşu genlerin etkilenmeyeceğinden emin olmak önemlidir. Bu prosedürün ardından, bir genin ilaç duyarlılığı veya direnci gibi belirli süreçlerde önemli olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla mutant fenotiplerini test etmek için diğer yöntemler uygulanabilir.Agrobacterium ve funguslar gibi canlı organizmalarla çalışmanın, özellikle kişi bağışıklık sistemi baskılanmışsa tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedürle birlikte, işlem sonrası el yıkama gibi önlemler her zaman uygulanmalıdır.

rapid-deletion-production-fungi-via-agrobacterium-mediated

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Üretimi C. elegans Recombineering yoluyla transgenlerin GalK Seçilebilir Marker

Yeşil Canavar yöntemi bir muhabir gen kodlaması yeşil flüoresan protein ile işaretlenmiş birden silme hızlı montaj sağlar. Bu yöntem, tekrarlanan delesyonlar cinsel çeşit döngüleri ve daha fazla silme taşıyan hücrelerin floresan merkezli zenginleştirme yoluyla maya suşu sürüş dayanmaktadır.

Çoklu Gen Delesyonlar Taşıma Maya Suşlarında Nesil için Yeşil Canavar Süreci

Verimli bir genom tek gen mutasyonu yöntemi kullanılarak...

Genom çapında Gen Delesyonlar içinde<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Yüksek Verimli PCR ile

Biyolistik dönüşüm homolog yeniden bağlama aracılığıyla fırsatçı patojen Cryptococcus neoformans genomuna DNA'nın kararlı bütünleşmesinin oluşturmak için kullanılan bir yöntemdir. Biz C.neoformans içine floresan etiket mCherry kaynaşmış kodlayan gen asetat kinaz olan bir yapı, biolistik dönüşümü gösterecektir.

Fırsatçı mantar patojenlere bir Floresan etiketli geninin biyolistik transformasyonu<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Burada, gelişmiş gen delesyon verimliliği için Yarrowia lipolytica Po1g suşunun moleküler genetik manipülasyonuna ilişkin yöntemleri rapor ediyoruz. Elde edilen mühendislik ürünü Y. lipolitica suşları, biyoyakıt ve biyokimyasal üretimde potansiyel uygulamalara sahiptir.

Yenilenebilir Biyoyakıt ve Biyokimyasal Üretim için bir Sıradışı Maya Genetik Mühendisliği

Genetik Ustilago Maydis'in karalamak mantar işlemek için Biz sağlam bir gen değiştirme stratejisini açıklar. Bu protokol enfeksiyon fenotipleri araştırmak için silme mutantlarını üretmek açıklar. Bir floresan protein etiketi kodlayan bir sekansı ilave olarak, örneğin, arzu edilen herhangi bir şekilde, genleri değiştirme uzatılabilir.

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Mantar Biyoloji ve Bitki Mikrop Etkileşimleri Eğitim için

Bu makalede ayrıntılı bir metodoloji fisyon mayası bir hedef gen rasgele mutagenesis için. Örnek olarak, biz bir alt birim 19S proteasome ve ekran heterochromatin istikrarsızlaştırmak mutasyonlar için kodlar rpt4 +, hedef.

Fisyon mayası Heterochromatin kararsız hale Proteasome mutantlar seçmek için rasgele Mutagenesis Gene hedefli

Burada bir protokol antibiyotik direnç-kaset silme yapıları silme mutantlar diğer E. coli suşları yapmak için bir temel olarak önceden var olan kullanım için mevcut. Böyle silme mutasyonlar seferber ve büyük bir alıcı yük P1 bakteriyofaj iletim kullanarak odağı karşılık gelen eklenmiş.

Escherichia coli Excisable antibiyotik direnci kasetleri ile P1 iletim tarafından üreten gen silme

Burada tanımlanan floksed kaset allelic değişim mutagenezi, FLAEM kullanarak Chlamydia trachomatis hedefli, markerless gen delemesi için bir yöntemdir.

Klamidya trachomatis Floxed Kaset Allelic Exchange Mutagene tarafından Markerless Gen Deletion

Tilki kuyruğu mozaik virüsünün ve şeker kamışı mozaik virüslerinin mısır fidelerine aşılanması için Agrobacterium bazlı enjeksiyon (agroinjection) protokolü sunulmaktadır. Bu şekilde aşılama viral enfeksiyona, belirteç genlerinin virüs kaynaklı gen susturmalarına ve GFP'nin viral aşırı ekspresyonuna yol açar.

Rekombinant Foxtail Mozaik Virüs ve Şeker Kamışı Mozaik Virüs Bulaşıcı Klonlar ile Enjeksiyon ile Mısır Fidelerinin Doğrudan Agroinokokülasyonu

Bu çalışma, Schizosaccharomyces pombe'de çok kopyalı baskılayıcı genetik ekran için bir protokolü açıklamaktadır. Bu ekran, bir sorgu mutant suşu ile ilişkili bir fonksiyon kaybı fenotipinin baskılayıcı klonlarını tanımlamak için genom çapında bir plazmid kütüphanesi kullanır. Bu ekran kullanılarak ell1 null mutantının yeni genetik baskılayıcıları tanımlandı.

Şizosakkaromices pombe'de Multicopy Suppressorların Tanımlanması için Genetik Ekran

Öğrenin mantarlarda hızlı gen silme mutantı üretimini Agrobacterium aracılı dönüşüm ve OSCAR yöntemiyle. Bu teknik fonksiyonel genetik araştırmalarında gen işlevlerini hızla ortaya koyar.

Yoluyla mantarlarda hızlı Silme Üretimi

Daha fazla video keşfet