Name: Kuyruktaki Motor fonksiyonların Biyofiziksel Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Keşfedin bakteri kamçı motorlarının biyofiziksel karakterizasyonunu prob boncukları ve gerçek zamanlı izleme kullanarak. Bu yöntem E. coli'de mekanobiyoloji ve moleküler motor davranışlarını anlamak için uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, boncuk izleme mikroskobu/fotoçoğaltıcıları ve Texas A&M Mühendislik Deney İstasyonu'nu fon olarak hediye ettiği için Howard Berg'e teşekkür eder.

1. Hücre Hazırlanması <ol><li> 10 ml taze TB 100 seyreltme: 1 ile inokülasyon ardından Tryptone Broth (TB,% 1 pepton,% 0.5 NaCl) alleli 15,22 yapışkan Flic taşıyan istenen gerginlik gecede kültürleri büyütün. OD 600 = 0.5 kadar bir çalkalama inkübatöründe 33 ° C&#39;de kültür büyütün. </li><li> 1,500 xg&#39;de hücreleri Pelet 5-7 dk yeniden disperse pelet kuvvetli bir şekilde süzülerek sterilize motilite tamponu 10 mL (MB; 10 mM fosfat tampon maddesi ile: 0,05-0,06 M NaCl, 10 4 M EDTA, 1 uM metionin pH 7.0). </li><li> Adımı yineleyin 1.2 iki kez daha ve 1 mL MB son pelet yeniden dağıtmak. </li><li> (- 12 cm uzunluğunda, 0.58 mm iç çapı 7) polietilen boru ile bağlı 21 ila 23 ölçü adaptörleri ile iki şırınga arasında ileri ve geri ~ 75 kez geçerek süspansiyon kayma. 45 s - 30 kesme için toplam süreyi sınırlayın. </li><li> 5-7 dakika boyunca 1.500 xg&#39;de makaslanmış hücreleri Santrifüj ve yeniden dağıtmakMB 500 ul - 100 pelet. </li></ol> 2. Slayt Hazırlama <ol><li> Bir kapak kayma ve bir mikroskop lamı arasında iki çift taraflı yapışkan bantlar sandviç ile bir görüntüleme odası hazırlayın. kemotaksis deneyleri için, MB ve kimyasal uyarıcılar alışverişini sağlayan herhangi bir mikroakışkan odasını kullanır. </li><li> odası içinde% 0.01 poli-L-lisin solüsyonu ilave edin ve 5 dakika sonra yavaşça MB yüzeyleri yıkayın (80-100 ul). </li><li> odasına hücre süspansiyonu 40 ul ekleyin ve cam yüzeyine bağlanması için yeterli bir süre sağlar (7-8 dakika). Diğer taraftan bir filtre kağıdı ile çözelti emme ise, odacığın bir tarafında 100 uL MB eklenerek yapışmamış hücreleri dışarı akar. </li><li> odasına lateks boncuk 15 mcL ve boncuk yerleşmek ve hücrelere takmak için yeterli zaman tanımak - 10 Ekle (7-8 dk). boncuk ayrılmak kaldırmak için, adım 2.3 anlatıldığı gibi yavaşça, MB 100 uL ile yıkayın. boncuk-si bir dizi kullanıniyi bir kontrast mevcut sürece deneyler için zes. </li></ol> 3. Boncuk İzleme <ol><li> Bir mikroskop sahnede örnek yerleştirin ve motorlara bağlı boncuklar için yüzey taraması. Faz mikroskopi gerekli değildir, ancak gözlem yapmaya 40X fazlı amacı kullanın. Alternatif olarak, bu kadar uzun yeterli kontrast açıkça karanlık bir arka plan üzerinde parlak boncuk ayırt etmek korunur olarak parlak alan görüntüleme kullanır. </li><li> Bir kordon seçildikten sonra, Şekil 1B &#39;de gösterildiği gibi önceden belirlenmiş bir köşesinde boncuk konumlandırmak için yanal olarak sahne hareket ettirin. aynı köşede Pozisyon boncuk tanenin dönme yönü doğru bilinen emin olmak için. İdeal boncuk yörünge yaklaşık dairesel ama eliptik yörüngeleri kabul edilebilir. </li><li> aliasing ile ilişkili hataları önlemek için motorun iki dönme frekansı daha örnekleme frekansı yüksek koruyun. Bu çalışmada, dönen bir motor kullanmak10 kat daha yüksektir (500 Hz) olan frekanslarda 50 Hz ve örnek, düzgün bir sinyal elde edildi. </li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> 23 Gerekirse Merkezi afin dönüşümler yörüngelerde PMT çıkış gerilimleri ve doğru ekliptiğinde ölçek ve. Rotasyon oranlarını 17 belirlemek için bir güç spektrum analizi kullanın. </li><li> polar açıları, θ (t) = Atan (y (t) / x (t)) belirler. motor devir değişimleri belirlemek ve omega hesaplayarak zamanla geçiş <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/55240/55240eq1.jpg" /> 14. </li><li> Motor hız verilerini düzeltmek için bir medyan filtresi kullanır. Iki tam rotasyonlar üzerinde bir filtre penceresi 23,24 tavsiye edilir. </li></ol>

<ol><li>Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+factors+of+uropathogenic+Echerichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Antimicrob.+Ag%22%5BJournal%5D)">Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli.</a> Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).</li>
<li>Lane, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+motility+in+the+colonization+of+uropathogenic+Escherichia+coli+in+the+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract.</a> Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).</li>
<li>Kao, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+interplay+among+bacterial+motility+and+virulence+factors+in+different+Escherichia+coli+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).</li>
<li>Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rotary+motor+of+bacterial+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The rotary motor of bacterial flagella.</a> Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).</li>
<li>McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+Dynamometer+Controls+Swarmer+Cell+Differentiation+of+V.+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus.</a> Cell. 54 (3), 345-351 (1988).</li>
<li>Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+mechanosensing+in+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).</li>
<li>Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+sensing+in+Vibrio+parahaemolyticus+triggers+a+programme+of+gene+expression+that+promotes+colonization+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence.</a> Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).</li>
<li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).</li>
<li>Belas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%2C+flagella%2C+and+mechanosensing+of+surfaces+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria.</a> Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).</li>
<li>Silverman, M., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+rotation+and+the+mechanism+of+bacterial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility.</a> Nature. 249, 73-74 (1974).</li>
<li>Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+Kinetics+in+Bacterial+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis.</a> J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).</li>
<li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).</li>
<li>Blair, D. F., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+torque+in+defective+flagellar+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Restoration of torque in defective flagellar motors.</a> Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).</li>
<li>Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-generating+units+of+the+flagellar+motor+of+Escherchia+coli+have+a+high+duty+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio.</a> Nature. 403, 444-447 (2000).</li>
<li>Yuan, J., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resurrection+of+the+flagellar+rotary+motor+near+zero+load%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).</li>
<li>Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+of+the+bacterial+flagellar+motor+near+zero+load%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Switching of the bacterial flagellar motor near zero load.</a> J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).</li>
<li>Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-speed+Relationship+of+the+Na%2B-driven+Flagellar+Motor+of+Vibrio+alginolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus.</a> J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).</li>
<li>Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-speed+relationship+of+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).</li>
<li>Meacci, G., Tu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+bacterial+flagellar+motor+with+multiple+stators%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).</li>
<li>Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flagellar+motor+of+Caulobacter+crescentus+generates+more+torque+when+a+cell+swims+backwards%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Phys%22%5BJournal%5D)">The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards.</a> Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).</li>
<li>Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+thresholds+in+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Response thresholds in bacterial chemotaxis.</a> Sci Adv. 1 (9), e1500299(2015).</li>
<li>Berg, H. C., Turner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque+Generated+by+the+Flagellar+Motor+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli.</a> Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).</li>
<li>Bai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Spread+as+a+Mechanism+for+Cooperativity+in+the+Bacterial+Flagellar+Switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch.</a> Science. 327, 685-689 (2010).</li>
<li>Reid, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maximum+number+of+torque-generating+units+in+the+flagellar+motor+of+Escherichia+coli+is+at+least+11%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).</li>
<li>Chen, X., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-Speed+Relationship+of+the+Flagellar+Rotary+Motor+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli.</a> Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).</li>
<li>Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+switching+of+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor.</a> Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

gergin boncuk izleme ve motor tork doğru tahmin kolaylaştırmak amacıyla, aşağıdaki bilgiler gözden geçirilmelidir. flagellated hücrelerle bu ölçümleri yaparken, kesme kritik bir adımdır. Kesme ve böylece motordaki viskoz yük boncuk ağırlıklı nedeniyle ve% 10 hata 16 içinde tahmin edilebilir olmasını sağlamak, sadece saplama flagellar filamanın azaltır. Kesme de sıkı dağıtılan dışmerkezliliğinden (&lt;boncuk çapı 14) ile dairesel yörüngeleri bulma şansını artırır. izleme ve yapışkan drags hesaplanma...

Kamçılı motorlar sarmal dışı filamentler çevirerek yüzmeye hücreleri sağlar. Motor flagellum&#39;un (yani, viskoz yük) belirli bir uzunluk için oluşturabilir tork miktarı, yüzme hızlarını belirler. Öte yandan, dönüş yönünü değiştirmek için yeteneğidir kimyasallar, kemotaksis olarak bilinen bir işleme karşılık olarak hücre göçü kontrol eder. Kemotaksis ve hareketlilik olan virülans 1-3, kamçılı motorlar yıllar 4 üzerinde iyi karakterize edilmiştir faktörleri. Montaj kanıtlar motor mekanosensör olarak işlev gördüğünü düşündürmektedir - mekanik katı yüzeylerde 5,6 varlığını algılar. Bu yetenek muhtemelen yüzey kolonizasyonu ve enfeksiyonlara 5,7 tetikleme yardımcı olur. Bunun bir sonucu olarak, motorlu yüzeyleri ve başlatır sinyal algılar ve böylece mekanizmaları önemli 8,9 sahiptir. Flagellar motoru kolayca flagell tethering ele alınabilirum bir alt tabakaya ve hücre dönme gözlemleyerek. Bu tür bağlama birinci anti-kancalı antikorlar 10 cam alt tabakalar için polyhook E. coli içinde mutant ve başarılı bir şekilde bağlanmış kanca ile çalışmış Silverman ve Simon, elde edildi. gergin hücre deneyi kimyasal uyaranlara çeşitli motor anahtarı yanıtları çalışma etmesini sağlamıştır. Örneğin, Segall ve arkadaşları kimyasal iyontoforetik pipetler yardımıyla gergin hücreleri uyarılır. CW önyargı karşılık gelen değişiklikler kemotaksis ağı 11,12 adaptasyon kinetiği ölçmek için onları etkin (zaman motorların fraksiyonu CW, saat yönünde döndürmek). Gergin hücre deneyi anahtarı yanıtları okuyan etkili iken, sadece viskoz yükleri 13 sınırlı bir aralıkta motorlu mekaniği içgörü sunmayı başardı. Bu sorunu aşmak için, Ryu ve arkadaşları yüzeylere yapışmış hücreler üzerinde koçanları filament için küresel, lateks boncuklar gergin. boncuklar vardıDaha sonra zayıf optik tuzakları 14 ile geri odak interferometrik kullanılarak izlenir. farklı boyutlarda boncuk ile birlikte çalışarak, araştırmacılar yükler çok daha geniş bir aralıkta motoru çalışma olabilir. Bu tahlil, daha sonra lazer karanlık alan aydınlatma ile birlikte photomultiplier tabanlı boncuk izleme tekniğini geliştirdi Yuan ve Berg tarafından geliştirildi. Dış viskoz dirençleri rotasyon 15,16 iç viskoz dirençleri kıyasla düşük olduğunu bu nedenle küçücük gergin altın nanobeads (~ 60 nm) Onların yöntemi etkin izleme. Bu, E. coli içinde elde edilebilen maksimum hızdan (~ 300 Hz) ölçümlerine yol açtı. V. alginolyticus&#39;un olarak, benzer boncuk deneyleri ara viskoz yükler (~ 700 Hz) 17 yaşında iplik oranları ölçümleri sağladı. (Sıfır yükten yakın durak) viskoz yüklerin tüm olası aralığında motor yanıtların ölçümleri sağlayarak, boncuk deneyleri t anlamak için önemli bir biyofiziksel araç sağladıorque nesil süreci 18,19. Son zamanlarda, bireysel motorlar 6 hassas mekanik uyaranlara uygulamak için etkin optik cımbız içerecek şekilde Yuan-Berg tahlil güncellenmiştir. Onlar viskoz yüklerde değişikliklere tepki olarak pişmanlık - Bu tekniği kullanarak, biz motoru döndürmek kuvvet jeneratörler dinamik mechanosensors olduğunu göstermiştir. Mekanizmaları tam olarak bilinmemektedir, ancak böyle bir yük algılama, kaynıyordu bakterilerin içine hücre farklılaşmasını tetikler mümkündür. Doğrudan bir kanıt yoktu, ancak diğer türlerdeki flagellar motorlar da 20 mechanosensitive olması da muhtemeldir. Burada, kamçılı filamentler 15 gergin lateks boncuk dönüşünü izlemek için photomultiplier tabanlı (PMT) yaklaşımları tartışıldı. gerçek zamanlı olarak ve uzun dura üzerinde tek boncuk izlemek için nispeten basittir, çünkü çok hızlı kameralarla izlemeye karşılaştırıldığında, photomultiplier-Kur avantajlıleri. Nedeniyle çevresel uyaranlara 21 Flagellar motoru komplekslerinde biçimlenme uzun süre eğitim zaman özellikle yararlıdır. Özel olarak, E. coli için ayrıntılarıyla protokolleri rağmen, hali hazırda diğer türlerdeki flagellar motorlar çalışmak için adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Poli-L-lizin Çözeltisi (% 0.1)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Polybead Microspheres</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>7307</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>1 mL Luer Kayma Uçlu Şırınga</td><td>Exel Int.</td><td>26048</td><td>http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php</td></tr><tr><td>Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adaptörü 23 gauge</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>427565</td><td>http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp</td></tr><tr><td>Polietilen boru</td><td>Harvard Aparatı</td><td>59-8325</td><td>http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html</td></tr><tr><td>Fotoçoğaltıcı Tüpler</td><td>Hamamatsu</td><td>R7400U-20</td><td>300 ila 920 nm spektral tepki aralığı, Tepe dalga boyu 630 nm,&nbsp; 0.78 ns tepki süresi&nbsp; http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html</td></tr><tr><td>3 x 1 mm hassas yarıklar</td><td>Edmund Optics</td><td>NT39-908</td><td>Fotoçoğaltıcı tüpler üzerine birbirine dik açıyla monte edilmiş 2 yarık</td></tr><tr><td>Osiloskop</td><td>Tektronix</td><td>TBS 1032B</td><td>Alternatif markalar kabul edilebilir. Dijital Osiloskop, TBS 1000B Serisi, 2 Analog, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts&nbsp; http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope</td></tr><tr><td>8 Kutuplu LP/HP Filtre</td><td>Krohn-Hite</td><td>3384</td><td>Alternatif markalar kabul edilebilir. 0,1 Hz ila 200 kHz arasında bir frekans aralığı önerilir. &nbsp; &nbsp; http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf</td></tr><tr><td>Optiphot mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>Herhangi bir dik veya ters faz mikroskobu kullanılabilir. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754</td></tr><tr><td>50:50 (R:T) Küp Işın Ayırıcı</td><td>ThorLabs</td><td>BS013</td><td></td></tr></tbody></table>

kuyruktaki motor fonksiyonların biyofiziksel karakterizasyonu

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

Kamçı motorlarının bakteri motilitesi ve kemotaksisindeki rolü iyi anlaşılmıştır. Son keşifler, kamçılı motorların çeşitli çevresel uyaranlara yanıt olarak yeniden şekillenebildiğini ve yüzey kolonizasyonu ve enfeksiyonları için tetikleyiciler arasında olduğunu göstermektedir. Motorların hücresel adaptasyonu yeniden şekillendirdiği ve teşvik ettiği kesin mekanizmalar, muhtemelen temel motor özelliklerine bağlıdır. Burada sunulan fotoçoğaltıcı tabanlı boncuk izleme tekniği, motor hızlarındaki ve anahtar dinamiğindeki adaptasyonlar dahil olmak üzere motor fonksiyonlarının doğru biyofiziksel karakterizasyonunu sağlar. Bu yaklaşım, gerçek zamanlı izleme avantajı ve uzun süreler boyunca motor davranışını araştırma yeteneği sunar. Tartışılan protokoller, çeşitli bakteri türlerinde kamçı motorlarını incelemek için kolayca genişletilebilir.

Photomultiplier kurulumu Şekil 1A&#39;da gösterilmiştir. Proje Yönetim Ekipleri ilgi boncuk tarafından dağınık dalga boyları aralığında yüksek hassasiyetleri sahip olması önemlidir. Burada kullanılan Proje Yönetim Ekipleri görünür ve yakın kızılötesi aralıkları faaliyet ve halojen ışık kaynağı tarafından aydınlatılan boncuk tarafından saçılan ışık tespit başardık. Optimum aydınlatma koşulları ve stok gerilimleri bir kurulum diğerine değişecektir. Bu çalışmada kullanılan ...

Son bulgular, bakteriyel kamçı motorlarının çeşitli çevresel sinyalleri algıladığını ve yanıt olarak yeniden şekillendiğini göstermektedir. Burada tartışılan boncuk tahlillerinin, çevresel stres faktörlerine hücresel adaptasyonda yeniden şekillenmenin rolünü açıklamaya yardımcı olması beklenmektedir.

Kuyruktaki Motor fonksiyonların Biyofiziksel Karakterizasyonu

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

Bu deneysel prosedürün genel amacı, canlı bakteri hücrelerindeki tekil kamçı motorlarına tutturulmuş prob boncuklarının rotasyonunu ölçmektir. Tanımlayacağımız teknik, motor yanıtlarının gerçek zamanlı takibi ve kabul edilebilir ile kabul edilemez veriler arasında gerçek zamanlı ayrım yapabilme avantajını sunmaktadır. Bu yaklaşım, mekanobiyoloji alanındaki temel soruları yanıtlamamıza ve moleküler motor davranışının altında yatan fiziği ortaya çıkarmamıza yardımcı olmaktadır.Bu teknikleri ağırlıklı olarak E.coli'deki kamçı motorlarını incelemek için kullansak da, bu protokoller kamçılı diğer bakteri türlerindeki motorları incelemek için kolayca uyarlanabilir. Yapışkan fliC alelini taşıyan istenen suşun gece boyu TB içinde kültürlerini büyütün. Ertesi gün, 10 mililitre taze TB'yi 1:100 dilüsyonunda inoküle edin. Kültürü, 600 nanometredeki optik yoğunluk 0.5 olana kadar bir çalkalamalı inkübatörde 33 degrees Celsius sıcaklıkta büyütün.Hücreleri 1500 ×g'de beş ila yedi dakika boyunca pelletleyin. Ardından, pelletini 10 mL filtre ile sterilize edilmiş motilite tamponu içinde kuvvetlice yeniden dağıtın. Santrifüj ve resüspansiyon işlemlerini iki kez daha tekrarlayın.Son peleti bir mililitre MB içerisinde yeniden dağıtın. Süspansiyonu, polietilen tüple birbirine bağlanmış 21 ila 23 gauge adaptörlere sahip iki şırınga arasında yaklaşık 75 kez ileri geri geçirerek parçalayın. Toplam parçalama süresini 30 ila 45 saniye ile sınırlandırın. Parçalanmış hücreleri santrifüj ettikten sonra, peleti 100 ila 500 mikrolitre MB içerisinde yeniden dağıtın. Bir lamel ve bir mikroskop lamı arasına iki adet çift taraflı yapışkan bant yerleştirerek bir görüntüleme haznesi hazırlayın.Hazneye %0.01'lik poly-L-lysine çözeltisi ekleyin ve beş dakika sonra yüzeyleri MB ile nazikçe durulayın. Hazneye 40 microliters hücre süspansiyonu ekleyin ve cam yüzeye tutunmaları için yeterli süre tanıyın. Haznenin bir tarafından 100 microliters MB eklerken diğer taraftan çözeltiyi filtre kağıdı ile çekerek tutunmayan hücreleri dışarı akıtın. Ardından, hazneye 10 ila 15 microliters lateks boncuk ekleyin.Deneyler için iyi bir kontrast sağlayan çeşitli boncuk boyutları kullanın. Boncukların çökelmesi ve hücrelere tutunması için yeterli süre tanıyın. Tutunmamış boncukları uzaklaştırmak için boncukları 100 microliters MB ile nazikçe durulayın.Numuneyi mikroskop tablasına yerleştirin ve motorlara tutunmuş boncuklar için yüzeyi tarayın. Koyu bir arka plan üzerinde parlak bir boncuğun net bir şekilde ayırt edilebilmesi için yeterli kontrast korunduğu sürece 60X objektif ile parlak alan görüntüleme uygulayın. Bir boncuk seçildikten sonra, boncuğu önceden belirlenmiş bir köşeye konumlandırmak için tablayı yanal olarak hareket ettirin.Boncuğun dönüş yönünün doğru şekilde bilinmesini sağlamak için boncukları aynı köşeye yerleştirin. Örtüşme (aliasing) ile ilişkili hatalardan kaçınmak için örnekleme frekansını, motorun dönüş frekansının iki katından daha yüksek tutun. Bu çalışmada, 50 hertz hızında dönen bir motoru gözlemlemek için 10 kat daha yüksek örnekleme frekansları kullanılmıştır.Sabitleme işleminden sonra, boncuklar boncuk yarıçapının bir ila iki katından daha büyük bir eksantriklik ile yalpalıyor gibi görünüyorsa, hücrelerin daha fazla sayıda kesme kuvvetine maruz bırakılması önerilir. Burada, uygun şekilde sabitlenmiş bir boncuk ile sabitlenmemiş bir boncuk arasındaki görsel karşılaştırma gösterilmiştir. 500 hertz hızında örneklenen iki fotomultiplier'dan gelen çıktılar, ölçümün kısa bir süresi boyunca temsil edilmiştir.PMT'lerden gelen filtrelenmiş çıktılar, merkezleme ve ölçeklendirme işlemlerinin ardından, burada gösterildiği gibi dönen boncuğun dairesel yörüngelerini yeniden oluşturmak için kullanılmıştır. İdeal boncuk yörüngesi yaklaşık olarak daireseldir ancak eliptik yörüngeler de kabul edilebilir. Tek bir motor için boncuk yörüngelerinden hesaplanan açısal hızlar, üç saniyelik bir pencere üzerinden temsil edilmiştir.Motorun saat yönü tersi ve saat yönündeki dönüş yönleri arasındaki tekrarlanan geçişler, pozitif ve negatif değerler arasındaki değişimlerle belirtilir. Bu videoyu izledikten sonra, burada sunulan fotomultiplier tabanlı teknikleri kullanarak, tekil kamçı motorlarına bağlanmış boncukların yüksek doğrulukla nasıl takip edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bakteri kamçı motoru, birkaç yüz hertz hızlarda dönebilme kapasitesine sahip olduğu için kendine özgü bir dizi zorluk sunar.Moleküler motorlara bağlanan prob boncuklarının yüksek doğrulukla izlenmesi, kinesinler, miyozinler ve F1-ATPase dahil olmak üzere çeşitli motor türlerinin karakterizasyonunu kolaylaştırmıştır. Boncuk bağlama tekniğinin kamçı motorlarına genişletilmesi, araştırmacıların motor mekaniğini benzeri görülmemiş bir doğrulukla incelemelerine olanak sağlamıştır. Bu yöntemin görsel gösterimi, bu tekniği kullanmak isteyen araştırmacıların, tekil motorlara uygun şekilde bağlanmış boncukların konumlandırılması gibi zorlukların üstesinden gelmelerine yardımcı olacaktır.Burada gösterilen yöntemlerin, bu nanomakinelerin çeşitli bakteri türlerindeki adaptasyon yeteneğine dair yeni içgörüler geliştirilmesine olanak sağlaması beklenmektedir.

biophysical-characterization-of-flagellar-motor-functions

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Veziküller veya organeller gibi yüklerin hücre içi taşınması, polarize mikrotübüller üzerinde izlenen moleküler motor proteinler tarafından gerçekleştirilir. Bu protokol, nöronların içinde hareket eden bireysel kargo parçacıklarının taşınma yönlülüğünün, ilişkili motor proteinlerin nispi miktarı ve türü ile korelasyonunu tanımlar.

Kullanımı Akson Kargo Hareketli Moleküler Motors Kompozisyon karakterize &quot;Kargo Haritalama&quot; Analizi

Bu protokolün amacı, DNA origami nanoyapılar üzerinde moleküler motor toplulukları oluşturmak ve toplam iç yansıma floresan mikroskopisi kullanarak topluluk hareketliliğini gözlemlemektir.

Tek Molekülgözlem için DNA Origami Nanoyapılar üzerinde Dynein ve Kinesin Motor Toplulukları üretimi

Birçok bakteri, çevrelerinde gezinmek ve hem bireysel hem de kolektif olarak elverişli çevreyi kolonileştirmek için flagella tahrikli hareketliliği kullanır. Burada, yüzmeye ve kaynayan hareketliliklere katkıda bulunan bileşenleri / yolları tanımlamak için hareketliliği bir seçim aracı olarak kullanan üç yerleşik yöntemin kullanılması gösterilmiştir.

Bir Seride Üç Yerleşik Teknik Uygulayarak Escherichia coli'de Flagella Odaklı Hareketliliği Araştırmak

Burada sunulan miyosin 5a'yı ifade etmek ve arındırmak için bir prosedür ve ardından hem topluluk hem de tek moleküllü in vitro floresan mikroskopi bazlı tahliller kullanılarak karakterizasyonu ve bu yöntemlerin nonmuscle miyosin 2b'nin karakterizasyonu için nasıl değiştirilebileceği tartışılmıştır.

İn vitro Floresan Mikroskopi Bazlı Hareketlilik Testlerinin Miyosin'e Özgü Uyarlamaları

Burada, prosesif miyosin-5 motorları üzerinde ultra hızlı kuvvet kelepçesi deneyleri gerçekleştirmek için kapsamlı bir protokol sunulmaktadır ve bu, diğer proses motor sınıflarının çalışmasına kolayca genişletilebilir. Protokol, deney cihazının kurulumundan numune hazırlama, veri toplama ve analize kadar gerekli tüm adımları detaylandırır.

İşlemsel Miyosinlerin Mekanoenzimatik Özelliklerinin Ultra Hızlı Kuvvet-Kelepçe Spektroskopisi ile Diseksiyonu

Burada, Aeromonas'ın boş mutantlarının spesifik glikoziltransferazlarda veya glikoziltransferazlar içeren bölgelerde yapımını, motilitesi testlerini ve flagella saflaştırmasını, kodlanmış enzimlerinin bir glikanın biyosentezindeki katılımını ve işlevini ve bu glikanın bakteriyel patogenezdeki rolünü tanımlamaktayız.

Bakteriyel Glikoziltransferazların Bakteriyel Motilitedeki Rolünü Aydınlatmak için Boş Mutantların Üretilmesi

Çift yönlü mitotik kinesin-5 Cin8, hareketlilikleri sırasında bölünen ve birleşen kümelerde birikir. Kümelerdeki birikim ayrıca Cin8'in hızını ve yönlülüğünü de değiştirir. Burada, saflaştırılmış Cin8-GFP ile motilitesi tahlilleri ve tek moleküllerin ve Cin8 kümelerinin hareketli özelliklerinin analizi için bir protokol açıklanmaktadır.

Tek Moleküllerin Motilitesi ve S. cerevisiae Hücrelerinden Saflaştırılmış Çift Yönlü Kinesin-5 Cin8 Kümeleri

Aktomiyozin demetlerinin in vitro oluşumu ve optik cımbız kullanılarak miyozin topluluk kuvveti oluşumunun ölçülmesi sunulmuş ve tartışılmıştır.

Optik Cımbız Kullanarak Aktin Filament Demetlerinde Myosin Topluluk Mekaniğinin İncelenmesi

Burada, mikrotübül demetlerini in vitro olarak yeniden yapılandırmak ve eşzamanlı optik yakalama ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak içlerinde uygulanan kuvvetleri doğrudan ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, aktif mikrotübül ağları içindeki protein toplulukları tarafından üretilen kuvvetlerin ve yer değiştirmelerin nano ölçekte ölçülmesine izin verir.

Yeniden yapılandırılmış aktif mikrotübül demetleri içindeki kuvvetleri doğrudan ölçme

Bu çalışma, kinezin-3 ailesinin bir üyesi olan KIF1A'nın (1-393LZ) Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak saflaştırılmasını detaylandırmaktadır. Bu saflaştırılmış motorların in vitro tek moleküllü ve çok motorlu kayma analizi, memeli hücre lizatından elde edilen motorlarla karşılaştırılabilir sağlam hareketlilik özellikleri sergilemiştir. Bu nedenle, Sf9-bakülovirüs sistemi, ilgilenilen motor proteini ifade etmek ve saflaştırmak için uygundur.

Sf9 Saflaştırılmış Süperprosesif Kinesin-3 Ailesi Motorlarının Tek Moleküllü Analizi

Bu protokol, MultiBac Baculovirus sistemini kullanarak insan miyozin-7a holoenziminin rekombinant olarak üretilmesi ve özel bir in vitro filament kayma testi kullanılarak motilitesinin incelenmesi prosedürlerini detaylandırır.

İnsan Miyozin-7a'nın MultiBac Sistem Tabanlı Saflaştırılması ve Biyofiziksel Karakterizasyonu

Keşfedin bakteri kamçı motorlarının biyofiziksel karakterizasyonunu prob boncukları ve gerçek zamanlı izleme kullanarak. Bu yöntem E. coli'de mekanobiyoloji ve moleküler motor davranışlarını anlamak için uygulanabilir.

Kuyruktaki Motor fonksiyonların Biyofiziksel Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet