Name: Doku Mühendisliği ve Hastalık Soruşturma Kullanılmak Üzere Pediatrik İnsan Özofagus Epitel Hücreleri koşullu yeniden programlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Öğrenin, endoskopik biyopsilerden koşullu yeniden programlama kullanarak hasta kaynaklı özofagus epitel hücrelerini izole etmeyi ve genişletmeyi. Bu yöntem, özofagus hastalıklarının modellenmesi ve doku mühendisliği uygulamaları için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışmayı desteklediği için Connecticut Çocuk Tıp Merkezi Stratejik Araştırma Fonu'na teşekkür ederiz.

bilgilendirilmiş onam pediatrik hastaların anne / veliler ve kurumsal inceleme kurulu (KİK # 13-094) ile uygun olarak elde edildikten sonra Özofagus biyopsiler alındı. 1. Sterilizasyon Cihazları ve Jelatin Çözümü <ol><li> Otoklav forseps, tıraş bıçakları ve kirlenmeyi önlemek için doku taşıma öncesinde makas. </li><li> % 0.1 jelatin çözeltisi, 200 ml yapmak için, jelatin, 0.2 g damıtılmış su, 200 mL birleştirir. Otoklav ve serin, kullanımdan önce. </li></ol> 2. Kaplama doku kültürü plakaları <ol><li> önce hücre izolasyonu yaklaşık 2 saat, bir doku kültürü çanağı (100 mm) kapak ve bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C&#39;de inkübe kadar% 0.1 jelatin ekleyin. NOT: Bu plakalar aynı zamanda önceden yapılmıştır ve kullanım öncesi inkübatör tutulabilir. </li></ol> 3. Ayrışma Enzim Çözüm yapma <ol><li> Yaklaşık hücre izolasyonu öncesinde 30 dakika dışarı tartmakşişesindeki miligram konsantrasyonu başına birimlere dayalı bir denge üzerine dispase 10 birim. 37 ° C su banyosu içinde, 10 ml Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) ve yer ile 15 ml konik bir tüp içinde bir toz yerleştirin. </li></ol> 4. yapma Hücre Kültürü Orta <ol><li> F12, 35 mL (Ham orta), DMEM 11.5 mL, L-glutamin, 0.5 mi, 100x penisilin / streptomisin, 0.5 mL, 2.5 mL: steril bir konik tüp içine, aşağıdaki terkip maddelerini karıştırın, koşullu yeniden programlama ortamı 50 ml yapmak için fetal sığır serumu (FBS), insan insülin, 250 ug, insan epidermal büyüme faktörü (EGF), 500 ng. </li><li> 3T3 ortamı 500 mL olmak FBS, 50 mL, 100 x penisilin / streptomisin ile 5 mL DMEM 500 mL L-glutamin, 5 ml karıştırın. </li><li> keratinosit serumsuz ortamda 500 ml yapmak için, EGF ve (ortam ile sağlanır), sığır hipofiz özütü (BPB) takviyesi eritin. taban ortamının 500 ml şişeye takviyeleri ekleyin ve 10 5 mL0 x penisilin / streptomisin </li></ol> bir besleme kaynağı 5. Kültüre ve ışınlanması 3T3 hücreleri, <ol><li> DMEM,% 10 FBS, 1 x penisilin / streptomisin ve 2 mM L-glutamin ihtiva eden 3T3 orta hazırlayın. </li><li> Kültür, en az 3 gün hasta numunelerinin gelmesinden önce doku tedavi, T-75 şişelerinde 3T3 hücreleri. <ol><li> 5 mL&#39;lik bir şişeye% 0.25 tripsin-EDTA kullanılarak 3T3 hücreleri, 5 dakika boyunca ya da pek çok hücre kadar 37 ° C&#39;de inkübe hasta numunelerinin varış trypsinize hemen önce yüzer </li></ol></li><li> Reaksiyonu durdurmak için 3T3 ortamın 5 mL ekleyin. hücre süspansiyonu aspire ve 15 ml konik tüp transfer. 300 x g, 5 dakika boyunca spin. </li><li> orta aspire ve hücre sayımı için tripan mavisi belirli bir hacim içinde tekrar süspansiyon hücreleri. ölü hücreleri hariç Tripan mavi 10 uL hücrelerin 10 uL birleştirin. hücre sayımı için bir hemasitometre Bu çözümün yük 10 mcL. NOT: Bu proto içincol, ışınlanmış 3T3 hücreleri için ekim yoğunluğu 100 mm plaka başına 600.000 hücrelere eşit cm2 başına 10.900 hücredir. </li><li> 50 ml konik bir tüp içinde 3T3 ortamı 25 mL hasta numunesi ve tekrar süspansiyon başına 100 mm plaka plaka 3000 rad ile ışına maruz bırakmak için gerekli olan hücre sayısını kısım. </li><li> Aşağıdaki ışınlama, aşağı 100 mm plaka başına 5 ml koşullu yeniden programlama ortamında 5 300 xg&#39;de dk ve tekrar süspansiyon spin hücreleri. </li><li> Hasta hücrelerin kaplama protokolünde sonra gerçekleşir kadar borunun yanına (adım 7.6 bakınız). </li></ol> 6. Pediatrik Özofagus Biyopsisi korunması ve taşınması, alınması <ol><li> 15 ml konik tüpe 100 ug / mL primocin tam keratinosit serumsuz ortamın 5 ml ilave edilir ve buz üzerinde tıbbi tesise getirin. Not: ortamın Bu tüpler kadar 2 ay boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Ti yaklaşık 8 özofagus biyopsi eldeBana şöyle endoskopi ve ayrı: <ol><li> ıslak buz üzerinde 100 mg / ml primocin ve yeri ile komple keratinosit serum serbest orta içeren 15 ml konik altı biyopsi yerleştirin. </li><li> ıslak buz üzerinde tamponlu formalin ve yer 5 mL biyopsi yerleştirin. </li><li> uygun kesme ısısı bileşiği ile cryomold küçük biyopsisinde biyopsi yerleştirin. <ol><li> Hemen sıvı azot içinde yerleştirilmiş izopentan, bir cam kaba bu kalıba bırakın. Bir kez donmuş, bir numune torbasına cryomold koyun ve bir polistren köpük kap içinde kuru buz üzerinde saklayın. </li></ol></li></ol></li><li> Bir yapışmalı torba içinde ve daha sonra ıslak buz içeren bir kargo kutusu içine orta veya formalin biyopsiye içeren tüpler yerleştirin. Mühür ve biyolojik tehlikeli etiketi kutuyu etiket ve laboratuvara taşıyın. NOT: kuru buz içeren konteyner ve dondurulmuş biyopsi de mühürlü ve biyolojik tehlikeli etiketi ile işaretlenmiştir. </li></ol> 7. İşlemeMansap Kültür ve Analiz Hasta Doku <ol><li> Laboratuvarda varışta, aşağı kesit veya RNA ekstraksiyonu için ° C derin dondurucuda -80 kuru buz üzerinde donmuş biyopsi aktarın. formalin örnek yerleştirin. 4 ° C buzdolabında saklayın ve bir gecede düzeltmek için izin verir. </li><li> 300 xg&#39;de kalan biyopsi aşağı Spin ve orta aspire. konik tüp, contaya dispaz çözeltisi 10 ml ilave edilir ve 15 dakika için bir su banyosu içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> inkübasyonu takiben, 300 x g biyopsi aşağı doğru döndürün. % 0.05 tripsin-EDTA, 5 mL, orta ve tekrar süspansiyon biyopsi aspire. </li><li> 100 mm steril plakaya biyopsileri içeren tripsin-EDTA 5 ml aktarın ve 2 sterilize Jilet mümkün olduğunca ince kullanarak biyopsi kıyma. </li><li> yeni bir 15 ml konik kıyılmış biyopsi içeren tripsin-EDTA 5 ml aktarın. % 0.05 tripsin-EDTA ilave bir 5 mL &#39;si ile iki kez plaka yıkayın ve konik ekletüp. 37 ° C su banyosu içinde 10 dakika için tüp inkübe edin. </li><li> inkübasyonu takiben, 5 dakika boyunca 300 xg (1.4 RPM) de biyopsi aşağı spin ve orta aspire. konik tüp gibi ışınlanmış besleyici hücreleri ihtiva eden şartlı yeniden programlama ortamı 5 mL koşullu yeniden programlama ortamı 5 mL (adım 5.7). </li><li> doku kültürü çanağı jelatinin aspire sonra hücre süspansiyonu ve plakanın 10 mL ROCK inhibitörü (1 ul / ml) eklenir. 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> 8. Kültüre ve Yaygınlaştırılması Hücreler <ol><li> kültür yaklaşık 5 gün sonra, kıyılmış biyopsi parçaları içeren ilk orta aspire ve 5 ml steril PBS ile çanak 2-3 kez yıkayın. 10 uM&#39;de ROCK inhibitörü içeren plakaya yeni orta ekleyin. </li><li> % 70 confluency ulaştıktan sonra, hücre genişletin. levhaya% 0.05 tripsin-EDTA, 5 ml ilave edin ve 37 ° C inkübatör th çıkarmak için en fazla 2.5 dakika kuluçkalayıne besleme hücreleri. Bu inkübasyonun ardından, tripsin-EDTA aspirat ve 5 ml PBS ile plaka yıkayın. </li><li> PBS aspire ve plaka% 0.25 tripsin-EDTA 5 ml ilave edilir ve 5-10 dakika için ya da hücrelerin plakasından gevşeyene kadar inkübe edilir. Reaksiyonu durdurmak ve 50 ml konik tüp sıvı nakledebilir ve 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de döndürülür ve plakaya ortamın eşit miktarda ekleyin. </li><li> Koşullu yeniden programlama ortamı belirli bir hacimde yeniden süspanse hücreleri ve tripan mavisi 10 uL süspansiyonu 10 uL karıştırın. toplam hücre sayısını belirlemek için bir hemasitometre güvenin. </li><li> Hücreleri genişletme 1.200.000, 15 mL bir toplam hacimde 3T3 hücreleri, ışınlanmış ile 150 mm plaka 1.000.000, insan yemek borusu hücreleri ekleyin. 10 um taze ROCK inhibitörü ekleyin ve bir jelatin kaplı 150 mm çanak hücre süspansiyonu ekleyin. </li></ol> 9. Freeze ve Mağaza İnsan Özofagus Hücrelerine <ol><li> orta dondurma yapmak için,% 10 ilaveKoşullu yeniden programlama ortamı DMSO. tripsinize ve sayma sonra, yeni bir 50 ml konik tüp içine dondurmak ve 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de aşağı spin hücreleri bölmeyin. </li><li> orta aspire ve cryovial başına 2 mL&#39;lik bir hacimde orta dondurma ekleyin. Hücre süspansiyonu, homojen olduğunda, önceden etiketlenmiş cyrovials 10 6 hücre kısım. Uzun süreli sıvı azot depolama şişeleri hareket önce en az 24 saat boyunca -80 ° C&#39;de bir dondurucu bir kap içine koyun. </li></ol>

<ol><li>Clark, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophageal+atresia+and+tracheoesophageal+fistula%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Fam+Physician%22%5BJournal%5D)">Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula.</a> Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).</li>
<li>Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+prevalence+of+eosinophilic+esophagitis+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Gastroenterol+Nutr%22%5BJournal%5D)">Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children.</a> J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57 (1), 72-80 (2013).</li>
<li>Sjöqvist, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+orthotopic+transplantation+of+a+tissue-engineered+oesophagus+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats.</a> Nat Commun. 5, 3562(2014).</li>
<li>Saxena, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophagus+tissue+engineering%3A+designing+and+crafting+the+components+for+the+%27hybrid+construct%27+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pediatr+Surg%22%5BJournal%5D)">Esophagus tissue engineering: designing and crafting the components for the 'hybrid construct' approach.</a> Eur J Pediatr Surg. 24 (3), 246-262 (2014).</li>
<li>Saxena, A. K., Ainoedhofer, H., Höllwarth, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+ovine+esophageal+epithelial+cells+and+in+vitro+esophagus+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Culture of ovine esophageal epithelial cells and in vitro esophagus tissue engineering.</a> Tissue Eng Part C Methods. 16 (1), 109-114 (2010).</li>
<li>Saxena, A. K., Kofler, K., Ainodhofer, H., Hollwarth, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophagus+tissue+engineering%3A+hybrid+approach+with+esophageal+epithelium+and+unidirectional+smooth+muscle+tissue+component+generation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastrointest+Surg%22%5BJournal%5D)">Esophagus tissue engineering: hybrid approach with esophageal epithelium and unidirectional smooth muscle tissue component generation in vitro.</a> J Gastrointest Surg. 13 (6), 1037-1043 (2009).</li>
<li>Macheiner, T., Kuess, A., Dye, J., Saxena, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+isolation+of+epithelial+cells+from+ovine+esophagus+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater+Eng%22%5BJournal%5D)">A novel method for isolation of epithelial cells from ovine esophagus for tissue engineering.</a> Biomed Mater Eng. 24 (2), 1457-1468 (2014).</li>
<li>Mishra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+Mouse+Models+in+Dissecting+the+Mechanism+of+Human+Eosinophilic+Gastrointestinal+Diseases+%28EGID%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol+Hepatol+Res%22%5BJournal%5D)">Significance of Mouse Models in Dissecting the Mechanism of Human Eosinophilic Gastrointestinal Diseases (EGID).</a> J Gastroenterol Hepatol Res. 2 (11), 845-853 (2013).</li>
<li>Medvedev, S. P., Shevchenko, A. I., Zakian, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Problems+and+Advantages+when+Applying+them+in+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells: Problems and Advantages when Applying them in Regenerative Medicine.</a> Acta Naturae. 2 (2), 18-28 (2010).</li>
<li>Metallo, C. M., Azarin, S. M., Ji, L., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+tissue+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Engineering tissue from human embryonic stem cells.</a> J Cell Mol Med. 12 (3), 709-729 (2008).</li>
<li>Lee, H., Park, J., Forget, B. G., Gaines, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+in+regenerative+medicine%3A+an+argument+for+continued+research+on+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells in regenerative medicine: an argument for continued research on human embryonic stem cells.</a> Regen Med. 4 (5), 759-769 (2009).</li>
<li>Ghaedi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-derived+alveolar+epithelium+repopulates+lung+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix.</a> J Clin Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).</li>
<li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. , (2013).</li>
<li>Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cost-effective+system+for+differentiation+of+intestinal+epithelium+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells.</a> Sci Rep. 5, 17297(2015).</li>
<li>Ehrhardt, C., Kim, K. J., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human alveolar epithelial cells.</a> Methods Mol Med. 107, 207-216 (2005).</li>
<li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+the+isolation+of+human+breast+epithelial+and+myoepithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 32(2015).</li>
<li>Spurrier, R. G., Speer, A. L., Hou, X., El-Nachef, W. N., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+and+human+tissue-engineered+esophagus+form+from+sufficient+stem%2Fprogenitor+cells+and+do+not+require+microdesigned+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Murine and human tissue-engineered esophagus form from sufficient stem/progenitor cells and do not require microdesigned biomaterials.</a> Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 906-915 (2015).</li>
<li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods Mol Med. 50, 15-20 (2001).</li>
<li>Southgate, J., Hutton, K. A., Thomas, D. F., Trejdosiewicz, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+urothelial+cells+in+vitro%3A+proliferation+and+induction+of+stratification%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Normal human urothelial cells in vitro: proliferation and induction of stratification.</a> Lab Invest. 71 (4), 583-594 (1994).</li>
<li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nat Protoc. 7 (2), 235-246 (2012).</li>
<li>Geraghty, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+of+cell+lines+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use of cell lines in biomedical research.</a> Br J Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).</li>
<li>Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLodish%2C+H+%22Molecular+Cell+Biology%22">Molecular Cell Biology</a>. , W.H. Freeman. New York. (2000).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li>
<li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li>
<li>Davis, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+that+retains+epithelial+characteristics+after+prolonged+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A human retinal pigment epithelial cell line that retains epithelial characteristics after prolonged culture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (5), 955-964 (1995).</li>
<li>Carro, O. M., Evans, S. A., Leone, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+inflammation+on+the+proliferation+of+human+gingival+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Effect of inflammation on the proliferation of human gingival epithelial cells in vitro.</a> J Periodontol. 68 (11), 1070-1075 (1997).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Hasta biyopsilerinden özofagus epitel hücreleri izole ve genişletmek için en önemli adımlar şunlardır: 1) yeterli minimal hücre ölümü ile biyopsi doku dissociating; 2) temin ROCK önleyicisi, her bir değiştirilen ortam hücre kültürü ortamına ilave edilir; 3) önerilenden daha fazla besleyici hücreler kullanmayın; 4) Temiz aseptik kültürünü korumak; ve 5) izdiham ulaşmadan hemen önce geçiş hücreleri. Nedeniyle şartlı yeniden programlama için elde edilen biyopsi örneklerinde hastaya bağlı farklı...

Özofagus doku mühendisliği ve eozinofilik özofajit (EÖ) son on yılda pek çok laboratuvarda araştırma odağı olmuştur. Böyle özofagus atrezisi gibi konjenital defektler, 1 yemek yetersizlik önde gelen yemek borusu eksik gelişmesi ile sonuçlanır yaklaşık 1 4,000 canlı doğumda, görülür. EÖ insidans ve prevalansının 1993 yılında hastalık varlığın kimlik EÖ insidansı 10 kişi-yıl başına / 100,000 0.7 arasında değiştiği ve yaygınlık 43 / 100,000 2 0.2 arasında değişmektedir beri artış olmuştur. çok uzun aralıklı özefagus atrezisi tedavisi için yeni bir çekici cerrahi yaklaşım hastanın kendi hücrelerini kullanarak implantasyon için doku yapıları üreten oluşur. Sentetik iskele ile bağlantılı olarak bu hücreler bağışıklık bastırma gerektirmeyen bir otolog yapı oluşturur. Bazı gruplar zaten bizi araştırmaya başlamışlardır7 - özofagus doku mühendisliği 3 yanı sıra yerli özofagus epitel hücrelerinin kullanımı için kök benzeri hücreler e mukozasında 4 yeniden doldurmak için. pediatrik hastaların yemek borusunda mevcut hastalıklar sıklıkla teşhis ya da müdahale olmadan çalışmaya zordur. Ayrıca, kullanan hayvan modelleri ya da in vitro tam hastalık patogenezi veya hasta belirli farklılıklar 8 kapsayacak yok EÖ gibi pediatrik hastalıklar için hücre hattı modelleri ölümsüzleştirdi. Bu nedenle, sırayla in vitro bir hastanın hastalık sürecini incelemek için yetenek, spesifik hastalık tetikleme antijenleri tespit yatan mekanizmaları değerlendirmek ve roman ve hasta tedavisinde yardımcı olabilecek bilgiler klinisyenlere sağlayacak ilaç tedavileri araştırmak için. Tissu&#39;nun kullanılmak için önerilmiştir, birçok otolog veya hasta açısından spesifik hücre tipleri olmuşture mühendisliği ve insan hastalık patogenezini okuyan. Bununla birlikte, bu hücre tiplerinin, bazı büyük iskele tohum ya da in vitro çalışmalarda yüksek verim gerçekleştirmek için belirli bir fenotip yeterli hücre oluşturmak için kendi yeteneği sınırlıdır. Pluripotent veya multipotent kök hücrelerin kullanımı çok araştırma tartışma konusu olmuştur, ancak bu hücrelerin kullanımı için sınırlamalar ve eksiklikleri de 9 tarif edilmiştir. İnsan embriyonik kök hücrelerin kullanımı çok tartışılan ve birçok etik sorunlar karşımıza çıkar. En önemlisi, bu hücrelerin kendi pluripotent devletten önce yaşayan bir ev sahibi 10 içine sunmaya ayırt değilse, bir tümöre benzer teratom oluştururlar. Ayrıca, embriyonik kök hücrelerin kullanımı hastaya özgü olmaz ve bir allojenik tepki ve bağışıklık baskılanması 10 ihtiyacını ortaya olabilir. Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) o can pluripotent hücrelerdirhastanın kendi hücreleri elde edilebilir. örneğin deri hücreleri gibi somatik hücreler, birleştirici ve bütünleştirici olmayan çeşitli teknikler kullanılarak pluripotent duruma indüklenebilir. Bu hücreler daha sonra, doku mühendisliği ya da hastalık inceleme için hastaya özel hücre kaynakları olarak görev yapar. Bu hücrelerin içine istenmeyen genetik materyalin entegrasyonu birçok tarif var ve diziler bile tamamen kaldırıldı iPSCs onlar 11 türetildikleri hücre tipine karşı bir epigenetik &quot;hafıza&quot; korumak için görünen bir husustur. Transplantasyon 11 öncesinde farklılaşmış takdirde Bu hücreler, aynı zamanda in vivo olarak teratomlar oluşturacaktır. Bir çok farklılaşma protokolleri ancak, farklılaşma sonunda elde edilen hücre tipi homojen ve O değildir dikkat etmek önemlidir, epitel soy, 12, 13, 14 odaklanan incelenmiştirnly ilgi hücre tipinin bir bölümünü sahiptirler. Bu düşük verim ve istenen hücre türü arındırmak için ihtiyacı ile sonuçlanır. iPSCs potansiyel hastaya özgü hücre kaynağı olsa da, proses doku mühendisliği veya hastalık araştırma biri için ilgi konusu bir hücre tipi çok yetersiz elde edildi. Akciğer 15, meme 16, ince bağırsak, 17 kolon 18, mesane 19 ve yemek borusu 20: insan epitelyum hücrelerinin başarılı dahil olmak üzere insan vücudunda hastalıklı olmayan hastalıklı doku hem de çeşitli izole edilmiştir. İnsan birincil hücreler fenotipik 21, 22 muhafaza edildiği geçitlerin sonlu sayıda olduğunu not etmek önemlidir. Ne yazık ki, bu demektir ki bir hastalık inceleme ya da bir mühendislik iskele tohumlama için gereken hücre sayısıimplantasyon için elde edilemez. Bu nedenle, yeni teknikler de epitel fenotipi muhafaza ederken, hastanın hücreleri genişletmek için ihtiyaç vardır. Besleyici hücreler ve kaya inhibitörü yararlanarak normal ve kanserli epitel hücrelerinin koşullu yeniden programlama Liu ve arkadaşları tarafından, 2012 de tarif edilmiştir. 2 3. Bu teknik, ışınlanmış besleyici hücreler, ROCK önleyicisi ve koşullu yeniden programlama ortamı kullanılarak prostat ve meme kanseri biyopsilerinden elde edilen kanser epitelyal hücreleri genişletmek için kullanılmıştır. Hedefi, ilaç taraması gibi, in vitro tahliller için yeterli hücre elde etmek olmuştur. Bu teknik, yüksek proliferatif bir kök veya projenitör gibi devlet için &quot;yeniden programlama&quot;, bu hücreler tarafından süresiz epitel hücreleri kadar esneme kabiliyetine sahiptir. Hücreler olmayan tümörijenik ve teratom 23, 24 oluşturmak için yeteneğine sahip olmadıklarını ortaya konmuştur. Bundan başka, herhangi birkromozomal anomali veya genetik manipülasyonlar bu tekniği 23, 24 kullanılarak kültürde bu hücrelerin Pasajlanması sonra hazır bulundu. En önemlisi, bu hücreler sadece ilgi yerli hücre tipine içine ayırt edebiliyoruz. Bu nedenle, bu teknik ölümsüzleşme gerek kalmadan hastalığı soruşturma ve doku mühendisliği için hastaya özgü epitel hücrelerinin büyük bir hazne bulunmaktadır. hastalık süreçlerini araştırmak için özel bir organdan epitel dokusu elde nedeniyle hasta riskten kaynaklanabilecek olası genellikle sınırlı değil her zaman. özofagus hastalığı veya kusurları muzdarip hastalar için, endoskopik biyopsi alma ayrışmış ve şartlı o hastanın yemek borusu mukozasında özgü belirsiz bir hücre kaynağı sağlamak için yeniden olabilir epitel doku elde etmek için minimal invaziv bir yaklaşımdır. Bu, daha sonra, in vitro çalışmalar için izin verirepitel hücrelerinin potansiyel tedavi için hastalık süreçlerini ve ekrana değerlendirmek. Büyük ölçüde bu yaklaşımdan fayda olabilir Bir hastalık süreci yemek borusu 8 alerjik hastalık olarak tarif edilmiştir Eozinofilik Özofajit vardır. Alerji testleri yanı sıra tedavi yaklaşımları hastanın kendi epitel hücreleri kullanılarak in vitro değerlendirilebilir ve bu veriler daha sonra bireyselleştirilmiş tedavi planı geliştirmek için tedavi eden hekimin üzerine geçirilebilir. pediatrik hastalarda gelen endoskopik biyopsilerin ile birlikte koşullu yeniden programlama tekniği herhangi hastadan süresiz normal yemek borusu epitel hücreleri genişletmek için yeteneği sunar. Bu hücre kaynağı, bu nedenle kusur, hastalık ya da travma nedeniyle bir hastaya özgü cerrahi seçenek sunmakta doğal veya sentetik iskele ile birlikte takım olabilir. belirsiz hücre sayısına sahip olan tamamen reseeded sahip özofagus yapıları mühendisi yardımcı olacaksırayla özofagus epitel hücreleri ile lümen kalan hücre tipleri yenilenmesini kolaylaştırmak için.

<table><tbody><tr><td>Primocin</td><td>InVivogen</td><td>ant-pm2</td><td></td></tr><tr><td>İzopentan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>277258-1L</td><td></td></tr><tr><td>Domuz Derisinden Jelatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>TissueTek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>Kriyomatris OCT</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td>6769006</tr><tr><td>15 mL Konik Tüpler</td><td>Denville Scientific</td><td>C1017-p</td><td></td></tr><tr><td>Komple Keratinosit Serumu Serbest Orta</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10724011</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Çözeltisi Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ml</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Epidermal Büyüme Faktörü (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>ROCK İnhibitörü (Y-27632)</td><td>Fisher Scientific</td><td>125410</td><td></td></tr><tr><td>F-12 Medium&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Denville Scientific</td><td>FB5001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>%0,05 Tripsin-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>%0,25 Tripsin-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Tabaklar</td><td>Denville Scientific</td><td>T1110-20</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Tabaklar</td><td>Denville Scientific</td><td>T1115</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konik</td><td>Denville Scientific</td><td>&nbsp; C1062-9&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Tabletler</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipetler</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipetler</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pipetler</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811</td><td></td></tr><tr><td>9" Pasteur Pipetleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3 Hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL1658</td><td></td></tr></tbody></table>

doku mühendisliği ve hastalık soruşturma kullanılmak Üzere pediatrik İnsan Özofagus epitel hücreleri koşullu yeniden programlanması

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

Doku mühendisliği ve hastalık araştırmasında kullanılmak üzere kültürde hastaya özgü hücrelerin tanımlanması ve genişletilmesi çok zor olabilir. İlgilenilen hücre tiplerini elde etmek için çeşitli kök hücre türlerini kullanmak genellikle maliyetli, zaman alıcı ve oldukça verimsizdir. Ayrıca, bu hücre kaynağını kullanmadan önce istenmeyen hücre tiplerinin kaldırılması gerekir, bu da süreçte başka bir adım gerektirir. Bir özofagus yapısının lümenini tasarlamak veya özofagus hastalığını tedavi etmek için terapötik yaklaşımları taramak için yeterli özofagus epitel hücresi elde etmek için, doğal özofagus epitel hücreleri, gen ekspresyonlarını veya fenotiplerini değiştirmeden genişletilmelidir. Özofagus epitel dokusunun koşullu olarak yeniden programlanması, hastaya özgü özofagus epitel hücrelerinin genişletilmesi için umut verici bir yaklaşım sunar. Ayrıca, bu hücrelerin sıralanmasına veya saflaştırılmasına gerek yoktur ve koşullu yeniden programlama kültüründen çıkarıldıktan sonra olgun bir epitel durumuna geri dönecektir. Bu teknik, birçok kanser tarama çalışmasında tanımlanmıştır ve bu hücrelerin birden fazla geçiş boyunca belirsiz bir şekilde genişlemesine izin verir. Özofagus tarama tahlillerinin gerçekleştirilebilmesi, hastanın semptomlarına neden olan tetik mekanizmayı belirleyerek eozinofilik özofajit gibi pediatrik özofagus hastalıklarının tedavisinde devrim yaratmaya yardımcı olacaktır. Yemek borusunun konjenital kusuru, hastalığı veya yaralanmasından muzdarip hastalar için, bu hücre kaynağı, etkilenen bölgeyi onarmak veya değiştirmek için implantasyon için sentetik bir yapı oluşturmak için bir araç olarak kullanılabilir.

Hasta biyopsilerinden özofagus epitel hücreleri izole kilit adımların bir özeti Şekil 1&#39;de özetlenmiştir. Epitel hücrelerinin kolonileri yaklaşık 4-5 gün içinde oluşturacak ve fibroblast besleyici hücreler (Şekil 2A) çevrili olacak. Bu koloniler genişletmek olarak daha büyük koloniler (Şekil 2B) oluşturmak için diğer koloniler ile birleştirilecek. Kültürler% 70 konfluent hale sonra, (Şekil 2C) genişletilmesi gerekmek...

koşullu yeniden programlamayı kullanarak insan pediatrik özofagus epitel hücrelerinin genişlemesi kusurları veya yaralanma tedavi ve tedavi amaçlı testler için bir rezervuar olarak hizmet otolog implantasyon için özofagus yapıları mühendislik için kullanılabilir hücrelerin hastaya özgü nüfusa sahip araştırmacılar sağlar.

Doku Mühendisliği ve Hastalık Soruşturma Kullanılmak Üzere Pediatrik İnsan Özofagus Epitel Hücreleri koşullu yeniden programlanması

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

Bu prosedürün genel amacı, özofageal hastalıkları incelemek veya sonraki modelleme çalışmaları ya da özofageal doku değişimi için 3D bir özofageal iskele oluşturmak amacıyla, endoskopik biyopsilerden elde edilen hastaya özgü özofageal epitelyal hücreleri çoğaltmaktır. Bu yöntem, özofageal epitelyal hücrelerin özofageal hastalıklardaki rolünün daha iyi anlaşılması için kullanılabilir. Ayrıca, modelleme veya implantasyon için 3D iskelelerin oluşturulmasında da kullanılabilirler.Bu tekniğin avantajı, herhangi bir genetik veya kalıcı modifikasyona ihtiyaç duymadan, çok küçük bir doku parçasından hastaya özgü epitel hücreler üretmemize olanak tanımasıdır. Bu tekniğin etkileri, eozinofilik özofajitlerin patogenezini anlamanın yanı sıra özofagus atrezisi ve eozinofilik özofajit için tedaviler geliştirilmesine kadar uzanmaktadır. Genel olarak, bu tekniği yeni öğrenen kişiler, saflığı korumak amacıyla insan özofagus epitel hücrelerini hasat etmeden önce besleyici hücreleri tamamen uzaklaştırma konusunda zorluk yaşayacaklardır.Bu tekniği laboratuvarımızdan teknisyen Christopher Fosterle göstereceğiz. Hasta örnekleri alınmadan en az üç gün önce, 3T3 hücrelerini doku işlemeli T75 flasklarda 3T

conditional-reprogramming-pediatric-human-esophageal-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

İnce bağırsak kriptlerinden insan enteroidlerini ve hem cerrahi dokudan hem de biyopsilerden toplanan kolon kriptlerinden kolonoidleri oluşturmak için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu metodolojik makalede, insan enteroidlerinin ve kolonoidlerinin başarılı bir şekilde büyümesi ve sürdürülmesi için gerekli olan kültür modalitelerini sunuyoruz.

Tüm Doku ve Biyopsi İnsan Epitelyal Enteroids ve Colonoids kurulması

Bu yazının üretimi, karakterizasyonu ve normal birincil insan özofagus fibroblast ve de-cellularized domuz iskele içinde ekilmiş skuamöz epitel hücrelerinden hazırlanan bir dokuya işlenmiş 3D özofagus yapı potansiyel kullanımlarını açıklar. Sonuçlar normal insan yemek borusunda benzer olgun tabakalı epitel oluşumunu göstermektedir.

3D Doku mühendisliği İnsan Özofagus Mukozal Modeli Üretimi, Karakterizasyonu ve Potansiyel Kullanımları

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devlet ve zahmetli yeniden farklılaşma yoluyla ilerleme hala klinik çeviri engellemektedir. Burada erişkin insan fibroblast türetme ve uyarılmış nöral progenitör hücrelerin içine doğrudan dönüşüm ve nöral soy içine sonradan farklılaşmayı açıklar.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

Bu el yazması, yüzey işaretleyici ekspresyonu ve hücre sıralaması kullanılarak tanımlanmış tasarlanmış kardiyak dokuların oluşturulmasını açıklar. Tanımlanan dokular daha sonra insan kalbinin işlevsel, ancak kontrollü bir model sistemini sağlamak için kardiyak hücre tedavisi mekanizmalarını araştırmak için çok dokulu bir biyoreaktörde kullanılabilir.

Tanımlı İnsan Engineered Kalp Dokuların inşaatı Kardiyak Hücre Tedavisinin Mekanizmaları Eğitim için

Bu yayın, çocuklardan nazal epitel mukozasının başarılı bir şekilde örneklenmesi ve kültürlenmesi ve bu hücrelerin indüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelere (iPSC'ler) yeniden programlanması için yöntemleri göstermektedir.

Çocuklar Primary Burun Epitel Hücreleri yetiştirmek ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine programlayın

Özofagus rekonstrüksiyonu zorlu bir işlemdir ve özofagus mukozası ve kasının yenilenmesini sağlayan ve yapay greft olarak implante edilebilen doku mühendisliğiöz bir özofagusun geliştirilmesi gereklidir. Burada, iskele imalatı, biyoreaktör ekimi ve çeşitli cerrahi teknikler de dahil olmak üzere yapay bir özofagus oluşturmak için protokolümüzü saklı yız.

Sıçanlarda Çevresel Özofagus Rekonstrüksiyonu için Doku-Mühendislik Greft

Protokol, endojen epitelin sıçan trakeasından seçici olarak çıkarılmasına ve lümen yüzeyindeki eksojen hücrelerin homojen dağılımına izin veren, ardından hücre dokusu yapısının uzun süreli in vitro kültürüne izin veren görüntüleme özellikli bir biyoreaktörü tanımlar.

Biyomühendislik hava yolu dokusu üretmek için görüntüleme kılavuzlu biyoreaktör

Bu protokol, Primer dokuların (deri, alveolus, hava yolu ve bağırsak) tam kalınlıkta çip üstü organ kültürlerinin başarılı bir şekilde kurulması ve olgunlaşması için Open-Top Organ-Chip'in yeteneklerini ve temel kültür modalitelerini açıklamakta ve insan epitelyal/mezenkimal ve vasküler niş arayüzünün farklı fonksiyonel yönlerini in vitro olarak araştırma fırsatı sunmaktadır.

İnsan Epitel Dokularının Üstü Açık Bir Organ Çipi Üzerindeki Sitomimarisinin ve İşlevinin Yeniden Yapılandırılması

Organoid-fibroblast ko-kültürleri, in vivo kök hücre nişini incelemek için bir model sağlar. Burada, özofagus organoid-fibroblast ko-kültürleri için bir protokol tanımlanmıştır. Ek olarak, fibroblast-organoid etkileşimini görselleştirmek için tüm montaj görüntülemesi kullanılır.

Özofagus Fibroblastlarının Organoid Ko-Kültürler Kullanılarak Fonksiyonel Karakterizasyonu ve Görüntülenmesi

Burada, insan özofagus organoidlerinin kültürü ve hava-sıvı arayüz kültürü için bir protokol sağlanmıştır. Özofagus organoidlerinin hava-sıvı arayüz kültürü, sitokinlerin özofagus epitel bariyeri üzerindeki etkisini incelemek için kullanılabilir.

Eozinofilik Özofajitte Epitel Bariyerini Araştırmak İçin Üç Boyutlu Hücre Kültürü Modelleri 

Bu protokol, tümör ilerlemesinin farklı aşamalarını temsil eden özofagus organoid modellerinin oluşturulmasını ve histolojik analizini açıklamaktadır. Bu yöntem, araştırmacıların normalden kanserli dokulara geçiş sırasında hücresel morfoloji, mekansal organizasyon ve moleküler belirteç ekspresyon modellerindeki değişiklikleri incelemelerini sağlar.

Özofagus Organoidlerinin Kurulması ve Histolojik Analizi: Normal Dokulardan Kanserli Dokulara İlerlemenin Modellenmesi

Öğrenin, endoskopik biyopsilerden koşullu yeniden programlama kullanarak hasta kaynaklı özofagus epitel hücrelerini izole etmeyi ve genişletmeyi. Bu yöntem, özofagus hastalıklarının modellenmesi ve doku mühendisliği uygulamaları için değerli bir araç sunar.

Doku Mühendisliği ve Hastalık Soruşturma Kullanılmak Üzere Pediatrik İnsan Özofagus Epitel Hücreleri koşullu yeniden programlanması (Video) | JoVE Journal

Doku Mühendisliği ve Hastalık Soruşturma Kullanılmak Üzere Pediatrik İnsan Özofagus Epitel Hücreleri koşullu yeniden programlanması

Daha fazla video keşfet