Doku Mühendisliği ve Hastalık Soruşturma Kullanılmak Üzere Pediatrik İnsan Özofagus Epitel Hücreleri koşullu yeniden programlanması

Bu prosedürün genel amacı, özofagus hastalıklarını incelemek için endoskopik biyopsilerden hasta kaynaklı özofagus epitel hücrelerini genişletmek veya aşağı akış modellemesi veya özofagus dokusu replasmanı için bir 3D özofagus iskelesi oluşturmaktır. Bu yöntem, özofagus epitel hücrelerinin özofagus hastalığındaki rolünü daha iyi anlamak için kullanılabilir. Modelleme veya implantasyon için 3D iskeleleri görmek için de kullanılabilirler.

Bu tekniğin avantajı, herhangi bir genetik veya kalıcı modifikasyona ihtiyaç duymadan çok küçük bir doku parçasından hastaya özgü epitel hücreleri oluşturmamıza izin vermesidir. Bu tekniğin sonuçları, eozinofilik özofajitin patogenezini anlamanın yanı sıra özofagus atrezisi ve eozinofilik özofajit için tedaviler geliştirmeye kadar uzanır. Genel olarak, bu tekniğe yeni olan bireyler, saflığı korumak için insan özofagus epitel hücrelerini toplamadan önce besleyici hücreleri tamamen çıkarma yeteneği ile mücadele edeceklerdir.

Bu tekniği göstermek, laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Christopher Foster olacak. Hasta numuneleri alınmadan en az üç gün önce, 3T3 hücrelerini doku ile muamele edilmiş T75 şişelerinde 3T3 kültür ortamında kaplayın. Deney gününde, numuneleri almadan hemen önce, 3T3 hücrelerini şişe başına 5 mililitre% 0.25 Tripsin-EDTA ile 37 santigrat derecede yaklaşık beş dakika ayırın.

Hücrelerin çoğu yüzerken, reaksiyonu durdurmak için 5 mililitre 3T3 ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonunu santrifüjleme için 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Saymak için peleti ortamda yeniden askıya alın. Ardından, tohumlama için uygun sayıda hücreyi 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Daha sonra, 3000 rad'da ışınlama için hücrelere 25 mililitre taze 3T3 ortamı ekleyin. Daha sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti 100 milimetre plaka başına beş mililitrede koşullu programlama ortamında yeniden askıya alın. Endoskopi sırasında yaklaşık altı özofagus biyopsisi alındıktan sonra, ıslak buz üzerinde Primocin ile desteklenmiş, tam serum içermeyen keratinosit ortamı içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe altı biyopsi yerleştirin.

Islak buz üzerine beş mililitre tamponlu Formalin içine bir biyopsi yerleştirin ve bir biyopsiyi gömme ortamı içeren küçük bir biyopsi kriyokalıbına yerleştirin. Kalıbı hemen bir sıvı nitrojen kabının içindeki bir buz veya pentan kabına daldırın. Doku dondurulduktan sonra, kriyokalıbı polistiren köpük bir kap içinde kuru buz üzerinde bir numune torbasına yerleştirin.

Ardından, biyopsi tüplerini ıslak buz içeren biyolojik tehlike etiketli bir nakliye kutusunun içindeki sızdırmaz bir torbaya yerleştirin ve her iki kabı da laboratuvara taşınmak üzere bir biyolojik tehlike etiketi ile kapatın ve etiketleyin. Laboratuvara girdikten sonra, donmuş biyopsiyi hemen aşağı akış kesiti veya RNA ekstraksiyonu için eksi 80 santigrat derecelik bir depoya aktarın. Numuneyi, gece boyunca sabitlemek için dört santigrat derecelik bir buzdolabında Formalin'e yerleştirin ve kalan biyopsileri santrifüje yerleştirin.

Her tüpteki ortamı 10 mililitre dispas çözeltisi ile değiştirin ve tüpleri bir su banyosunda 37 santigrat derecede 15 dakikalık bir inkübasyon için kapatın. İnkübasyonun sonunda, biyopsileri tekrar döndürün ve numuneleri beş mililitre% 0.25 Tripsin-EDTA içinde yeniden süspanse edin. Biyopsileri 100 mililitrelik tek bir steril plakaya aktarın ve dokuları mümkün olduğunca ince bir şekilde kıymak için iki sterilize edilmiş tıraş bıçağı kullanın.

Dokunun tamamı kesildiğinde, doku parçalarını 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve plakayı beş mililitre% 0.05 Tripsin-EDTA ile iki kez durulayın. Yıkamaları tüpte toplayın ve numuneleri 37 santigrat derece su banyosuna geri koyun. 10 dakika sonra, sindirilmiş numune parçalarını ve besleyici hücreleri santrifüjleyin ve peletleri her biri beş mililitre koşullu yeniden programlama ortamında yeniden süspanse edin.

Daha sonra, besleyici ve özofagus biyopsi örneklerini tek bir tüpte birleştirin ve jelatin kaplı bir doku kültürü kabı üzerinde ko-kültürleri için hücrelere rho kinaz veya ROCK inhibitörü ekleyin. Yaklaşık beş gün sonra, orta ve kıyılmış biyopsi parçalarını aspirasyon ile çıkarın ve tabağı beş mililitre steril PBS ile iki ila üç kez durulayın. Son yıkamadan sonra, plakaya ROCK inhibitörü ile takviye edilmiş 10 mililitre taze ortam ekleyin ve hücreler% 70 birleşmeye ulaşana kadar ko-kültürü inkübatöre geri koyun.

Hücreleri genişletmek için, besleyicileri 37 santigrat derecede beş mililitre% 0.05 Tripsin-EDTA ile iki buçuk dakikadan fazla olmamak üzere çıkarın. Yüzer besleyici hücreleri çıkarmak için plakayı beş mililitre taze PBS ile durulayın ve biyopsi numune hücreleri plakanın altından gevşetilene kadar beş ila 10 dakikalık bir inkübasyon için beş mililitre% 0.25 Tripsin-EDTA ekleyin. Ardından, 10 mililitre taze ortamla reaksiyonu durdurun ve hücreleri santrifüjleme için 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Peletleri saymak için yeni koşullu yeniden programlama ortamında yeniden askıya alın ve şimdi, yeni bir konik tüpe altıncı insan özofagus hücresine 10 kere bir kez hesaplayın. Özofagus hücrelerine altıncı ışınlanmış 3T3 hücrelerine 1.2 kez 10 ekleyin ve tüpteki toplam hacmi taze koşullu yeniden programlama ortamı ile 15 mililitreye getirin. Daha sonra, hücrelere taze ROCK inhibitörü ekleyin ve ko-kültürü jelatin kaplı 150 milimetrelik bir tabağa yerleştirin.

Özofagus hücrelerini eksi 80 santigrat derece depolama için dondurmak için, besleyicileri çıkarın ve yemek borusu hücrelerini az önce gösterildiği gibi ayırın. Daha sonra, hücreleri santrifüjleme için yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın ve peleti iki mililitre donma ortamı konsantrasyonu başına bir kez 10 ila altıncı hücrede yeniden süspanse edin. Ardından, önceden etiketlenmiş her bir kriyoviyal içine iki mililitre hücre aktarın ve numuneleri uzun süreli sıvı nitrojen depolamasına taşımadan önce en az 24 saat eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Epitel hücre kolonileri yaklaşık dört ila beş gün içinde oluşacak ve fibroblast besleyici hücrelerle çevrili olacaktır. Bu koloniler genişledikçe, daha büyük koloniler oluşturmak için diğer kolonilerle birleşeceklerdir. Kültür% 70 birleşim haline geldiğinde, genişletilmeleri gerekir.

Besleyici hücreler çıkarıldıktan sonra, yapışık epitel hücreleri tripsonlaştırılabilir ve yeni ışınlanmış besleyici hücreler üzerine yeniden kaplanabilir. Bu hücrelerin qRT-PCR yoluyla fenotipik karakterizasyonu6on, ilk biyocasus örneğine kıyasla, birinci pasajın sonunda bir progenitör hücre belirteci olan P63'ün yukarı regülasyonunu ortaya çıkarır ve bu da hücrelerin daha progenitör kök benzeri bir duruma yeniden programlandığını gösterir. Bu hücreler normal doku kültürü plakalarına aktarıldığında, P63 ekspresyonu azalır ve sıkı bağlantı proteini bir veya TJP1 ve E-kaderin ekspresiyonları artar, bu da progenitör hücreden daha farklılaşmış bir epitel hücresine fenotip kaymasını gösterir.

Birinci geçişten sonra hücrelerin akış sitometrik analizi, hücrelerin %90'ından fazlasının da EpCAM için pozitif olduğunu gösterir. İmmünofloresan boyama, hücrelerin epitel belirteçlerini, progenitör belirteçlerini, proliferasyon belirteçlerini ve epitelyal sıkı bağlantı protein ekspresyonlarını koruduğunu gösterir. Hastalıklı olmayan bir hastadan özofagus hücrelerinin iki katına çıkma süresi yaklaşık 36 ila 40 saat olarak hesaplanmıştır, ancak hastalıklı hücrelerin iki katına çıkma süresinin daha yavaş olması muhtemeldir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık bir saat içinde tamamlanmalıdır. Bu prosedürü denerken, kontaminasyonu önlemek için steril teknik kullandığınızdan ve hücre canlılığını korumak için hızlı bir şekilde çalıştığınızdan emin olun. Bu prosedürü takiben, hangi antijenlerin özofagus iltihabına veya patogenezine neden olduğunu değerlendirmek için transwell kültürü gibi diğer testler yapılabilir.

Geliştirmeden sonra, bu tahlil, araştırmacıların eozinofilik özofajite neden olan tetikleyici antijenleri ve bu hastaları tedavi etmek için yeni tedavi seçeneklerini tanımlamalarının yolunu açacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, özofagus hastalıklarının incelenmesinde veya 3D modellerin oluşturulmasında kullanılmak üzere özofagus epitel hücrelerinin endoskopik biyopsilerden nasıl izole edileceğini ve genişletileceğini iyi anlamış olmalısınız. Keskin aletler ve biyolojik dokularla çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Keskin aletleri uygun şekilde attığınızdan ve iyi biyogüvenlik uygulamalarını kullandığınızdan emin olun.