MitoCeption: Glioblastoma Kök Hücreleri için İzole İnsan MSC kondriyayı aktarma

Bu prosedürün genel amacı, mezenkimal kök hücreler gibi donör hücrelerden daha önce izole edilmiş mitokondriyi glioblastoma kök hücreleri gibi hedef hücrelere aktarmaktır. Bu prosedür, nanotüplerin veya mikro-parçacıkların tünellenmesi gibi işlemlerle hücreler arasında kendiliğinden aktarılan mitokondrinin metabolik ve biyolojik etkileri gibi metabolizma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mitokondrinin etkilerinin, sitokinler veya metabolitler gibi mikro ortamda bulunan diğer faktörlerden ve ayrıca tünelleme nanotüplerinde kaçakçılığı olabilecek diğer bileşiklerden bağımsız olarak değerlendirilebilmesidir.

Görüntüleme amacıyla, MSC mitokondri ve GSC, MitoCeption ile mitokondri transferinden önce hayati boyalarla etiketlenebilir. Başlamak için, GSC'leri metin protokolüne göre hayati boyalarla önceden etiketledikten sonra, GSC nörokürelerini beş dakika boyunca 20 santigrat derecede 270 kez g'de santrifüjleme ile 50 mililitrelik bir tüpte toplayın. Hücreleri yıkamak ve tüpü tekrar döndürmek için beş mililitre HBSS kullanın.

Süpernatanı aspire edin ve 100 mikrolitre% 0.25 Tripsin-EDTA ile GSC peletini nazikçe yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri 37 santigrat derecede üç dakika inkübe edin. Daha sonra, tüpe mililitre DNaz I başına 10 miligramda iki mikrolitrede 10 mikrolitre 20 milimolar kalsiyum klorür ekleyin.

Kabarcık oluşumunu önlemek için 30 ila 50 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetlemek için bir P200 pipeti kullanarak nörosferleri ayırın. Hücrelere 10 mililitre HBSS'de 10 mikrolitre% 5 Tripsin inhibitörü ekleyin ve GSC'leri yedi dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı ve 10 mililitre GSC Bazal Ortamını numuneye atın.

Şimdi, bir Thoma sayma odası kullanarak, tekrar döndürmeden önce hücreleri sayın. Mililitre başına 10 ila altıncı GSC'lik bir hücresel konsantreye ulaşmak için uygun hacimde GSC proliferasyon ortamı ekleyin. Daha sonra, 96 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 10 ila beşinci GSC'ye tohum atın.

Plakayı, GSC'ler kuyuların dibine yerleşecek şekilde santrifüjleyin. Hücreleri mikroskop altında kontrol edin. Ardından plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin.

MSC mitokondri izolasyonunu gerçekleştirmek için, mikrosantrifüj sıcaklığını dört santigrat dereceye ayarlayarak başlayın. Mitokondri ekstraksiyonu için reaktifler içeren A ve C etiketli iki adet 1.5 mililitrelik tüp hazırlayın. MSC ve MiTo etiketli iki ek tüp hazırlayın.

Tüpleri buz üzerinde tutun. Ayrıca mitokondri preparatı ile kurulacak mitokondri seri dilüsyonları için tüpler hazırlayın. MSC'leri yıkamak için 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış 10 mililitre PBS kullanın.

Daha sonra iki mililitre EDTA içermeyen Tripsin ile hücreleri 10 saniye yıkayın ve hücreleri 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika inkübe etmeden önce bir mililitre daha Tripsin ekleyin. EDTA kullanımından, özellikle MSC Tripsinizasyonu ve mitokondri preparatında kullanılan proteaz inhibitörü için protokole göre kaçınılmalıdır. 10 mililitre Alpha MEM %10 FBS ekleyerek MSC'leri geri kazanın ve süspansiyonu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Sonra hücreleri santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletine 10 mililitre Alpha MEM% 10 FBS ekleyin. Ardından, dört ila beş çarpı 10'dan beşinci hücrelere dönmeden önce MSC'leri saymak için bir Malassez sayma odası kullanın.

Süpernatanı atın, hücre peletine bir mililitre buz gibi Alpha MEM %10 FBS ekleyin ve hücreleri buz üzerinde tutmaya devam ederken önceden hazırlanmış MSC etiketli tüpe aktarın. Daha sonra MSC tüpünü beş dakika boyunca dört santigrat derecede 900 kez g santrifüjleyin ve kalan tüm ortamı tüpten çıkarın. Daha sonra, MSC'lere EDTA içermeyen proteaz inhibitörleri içeren 200 mikrolitre mitokondri izolasyon reaktifi A ekleyin ve beş saniye boyunca orta hızda girdaplayın.

Ardından tüpleri tam olarak iki dakika buz üzerinde bırakın. 2.5 mikrolitre mitokondri izolasyon reaktifi B ekleyin ve tüpleri tekrar buza yerleştirmeden önce hücreleri 10 saniye boyunca maksimum hızda girdaplayın. Girdabı beş dakika boyunca her 30 saniyede bir tekrarlayın.

Şimdi, tüpe EDTA içermeyen proteaz inhibitörleri içeren 200 mikrolitre mitokondri izolasyon reaktifi C ekleyin ve tüpü yaklaşık 30 kez eğerek içeriği karıştırın. Tüpleri 700 kez g'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. MSC mitokondri içeren süpernatanı önceden hazırlanmış MiTo tüpüne aktarın.

Numuneyi 15 dakika boyunca dört santigrat derecede 3.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, mitokondriyal peleti durulamak için 200 mikrolitre reaktif C kullanın. Daha sonra organelleri peletlemek için süspansiyonu beş dakika boyunca dört santigrat derecede 12.000 kez g döndürün.

İzole MSC mitokondrisini GSC'lere aktarmak için, mitokondriyal pelete 200 mikrolitre önceden soğutulmuş GSC proliferasyon ortamı ekleyin. GSC'lere 20 mikrolitre mitokondriyal süspansiyonun eklenmesine tutarlı bir şekilde izin vermek için mitokondriyal preparasyonu GSC proliferasyon ortamında seyreltin. Ardından, mitokondriyi yavaşça kuyunun dibine yakın bir yere ekleyin.

MSC mitokondri hayati boya sızıntısını kontrol etmek için, yalnızca GSC proliferasyon ortamı içeren 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına aynı miktarda mitokondri preparatı ekleyin. Plakaları 15 dakika boyunca dört santigrat derecede 1.500 kez g'de santrifüjleyin. Sonra kültürleri hemen 37 santigrat dereceye yerleştirin.

Ertesi gün, hayati boya sızıntısı için kontrol kuyularını analiz etmek için, daha önce tarif edildiği gibi GSC hücrelerini tohumlayın, plakayı santrifüjleyin ve ardından kültürleri bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Sadece mitokondri içeren 96 oyuklu plakayı santrifüjleyin. Daha sonra ortamı GSC 96 kuyu plakasından aspire edin ve mitokondri süpernatanı ile değiştirin.

GSC'leri mitokondri süpernatanı ile 37 santigrat derecede iki saat boyunca inkübe edin. Son olarak, metin protokolüne göre mitokondri transferi, FACS analizi ve konfokal görüntüleme analizini gerçekleştirin. GSC'ler, kök hücre özelliklerini korumak için nöroküre olarak büyütülen kanser kök hücreleridir.

Mitokondriyal transferden hemen önce, yüksek bir mitokondri transfer verimliliğine izin vermek için tek hücreler halinde tohumlanırlar ve ertesi gün burada gösterildiği gibi, hücrelerin tekrar nöroküreler oluşturduğu gözlemlenir. Bu şekilde, floresan etiketli MSC mitokondri, Gb4 GSC'lerin içinde lokalize olarak görülebilir. MSC mitokondrisi, GSC mitokondrisine benzer şekilde GSC'ler boyunca görülür.

MSC mitokondri transferi, GSC konfokal görüntülerinden 3D rekonstrüksiyonda çoğu GSC için gözlemlenebilir, transfer edilen MSC mitokondrisinin hücreler arası lokalizasyonunu doğrular. GSC'lerin hem mavi hücresel hem de kırmızı mitokondriyal hayati boyalarla önceden etiketlenmesi, endojen GSC mitokondrisine göre yeşil renkte görülen transfer edilen MSC mitokondrisinin lokalizasyonunun görselleştirilmesine izin verdi. Burada gösterildiği gibi, artan miktarlarda floresan MSC mitokondri ile MitoCeption, FACS sinyallerinin artmasına ve kontrol sinyalinden birkaç kat daha yüksek mertebelere yol açmıştır.

Burada sunulan tek hücreli GSC'ler üzerinde gerçekleştirilen mitokondri transfer protokolü, doza bağlı bir yanıt ve nispi ortalama floresan yoğunluğu gösterdi. Son olarak, MSC mitokondri transferi GSC nörosferleri üzerinde de sağlanmış olsa da, bu koşullar altında GSC'lere transferin etkinliği, ilk olarak tek hücreler olarak tohumlanan GSC'lere transfer edilen mitokondriyal ile karşılaştırıldığında daha düşüktü. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa üç saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, mitokondri preparatını her zaman buz üzerinde tutmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürleri takiben, hedef hücrelere MSC mitokondriyal transferini görselleştirmek ve ölçmek için FACS, konfokal mikroskopi, mitokondriyal DNA üzerinde QPCR gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Aktarılan mitokondrinin biyolojik etkilerini belirlemek için fonksiyonel çalışmalar da yapılabilir.

Bu çalışmaların genellikle mitokondri transferini görselleştirmek için kullanılanlardan daha düşük miktarda mitokondri ile gerçekleştirileceğini unutmayın. Bu teknik, normal fizyolojik veya patolojik durumlarda hücreler arasında kendiliğinden transfer edilen mitokondrinin sonuçlarını ve biyolojik etkilerini keşfetmeye olanak sağlayacak ve böylece yeni terapötik tedavilerin geliştirilmesine katkıda bulunacaktır.