Yüksek çözünürlüklü Solunum Ölçümleri için Diferansiyel Santrifüj tarafından İskelet Kası Bozulmamış Mitokondri izolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, diferansiyel santrifüjasyon yoluyla iskelet kası mitokondrilerini izole etmek ve mitokondriyal solunum zinciri kompleks I, II ve IV'ün solunum hızlarını belirlemektir. Bu yöntem, çeşitli nörolojik hastalıklar, sepsis ve yaşa bağlı bozukluklar gibi mitokondriyal disfonksiyonla ilişkili hastalıklar ve sendromlar gibi mitokondriyal biyoenerjetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, izole edilen mitokondriyal preparatta, mitokondri fonksiyonlarının analizini etkileyebilecek sitolojik faktörlerin çoğunun bulunmamasıdır. Prosedürü, laboratuvarımdaki teknisyen Sandra Nansoz uygulamalı olarak gösterecektir.

Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği şekilde iskelet kası örneklerinin bulunduğu bir beher temin edin. Beheri bir buz kovasının üzerine yerleştirin. İnce uçlu makas kullanarak, kası bir ila iki milimetre boyutunda parçalar halinde kıyın.

Ardından, kıyılmış dokuyu her yıkama için 20 mililitre kullanarak buz gibi soğuk izolasyon tamponu ile iki kez durulayın. Yıkanmış dokuyu gram başına 10 mililitre izolasyon tamponunda süspande edin ve ardından beş miligram protease-G doku ekleyin. Daha sonra beheri manyetik karıştırıcılı bir buz banyosuna yerleştirin ve 10 dakika boyunca karıştırın.

Ardından, süspansiyonu doku gramı başına 0,2% yağsız BSA eklenmiş 10 mililitre daha izolasyon tamponu ile seyreltin. Sonra, beherdeki izolasyon tamponunun tamamını dökün. Dokuyu, her yıkama için 20 mililitre kullanacak şekilde 0,2% BSA eklenmiş buz gibi soğuk izolasyon tamponu ile iki kez yıkayın.

Ardından, dokuyu gram başına 10 mililitre BSA destekli izolasyon tamponu içerisinde yeniden süspande edin. Dokuyu homojenize etmek için gevşek uçlu bir havan içeren yarı otomatik cam homojenizatör kullanın. Daha sonra, homojenatı bir santrifüj tüpüne aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 10.000 xg hızında santrifüjleyin.

Serolojik bir pipet kullanarak süpernatantı uzaklaştırın. Peleti, doku gramı başına 10 mililitre buz gibi soğuk BSA destekli izolasyon ortamı ile yeniden süspande edin. Süspansiyonu dört santigrat derecede, 350 g kuvvetinde 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Bundan sonra, bir serolojik pipet kullanarak süpernatantı ayırın ve peleti atın. Süpernatantı, iki kat gazlı bez aracılığıyla buz üzerinde tutulan bir behere filtreleyin. Filtrelenen süspansiyonu bir santrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 7,000 ×g hızında santrifüjleyin.

Ardından süpernatantı atın. Ham mitokondri pelletini, doku gramı başına beş mililitre BSA destekli izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Bu süspansiyonu 4 °C'de 10 dakika boyunca 7.000 ×g kuvvetinde santrifüjleyin.

Ardından, süpernatantı atın ve peleti 20 milliliters yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. 4 °C'de 10 dakika boyunca 7,000 ×g hızda santrifüjleyin. Bu yeniden süspansiyon ve santrifüj işlemini bir kez daha tekrarlayın.

Bunun ardından, süpernatantı atın ve peleti bir mililitre yıkama tamponunda yeniden süspande edin. Herhangi bir standart yöntem kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. Daha sonra, konsantre mitokondriyal süspansiyonu, respirometri analizlerini gerçekleştirmeye hazır olana kadar buz üzerinde muhafaza edin.

Başlamak için, mitokondriyal konsantreyi, nihai konsantrasyonu 0.4 mg/mL mitokondriyal protein olacak şekilde respirasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından, hava kalibreli oksigraf odasındaki respirasyon ortamını aspire edin. 2.1 mL izole mitokondri süspansiyonu ekleyin.

Oksigraf haznesini kapatmak için bir tıpa yerleştirin. Ardından, mitokondriyal süspansiyonu 37 °C'de 700 RPM hızında sürekli olarak karıştırın. Stabil bir oksijen akış sinyali elde edilene kadar bazal hücresel solunumu üç ila beş dakika boyunca kaydedin.

Kompleks I'e bağımlı solunumu başlatmak için, izole mitokondriyal süspansiyon ile hazırlanmış bir oksigraf odasına, tıpanın titanyum enjeksiyon portu aracılığıyla 12.5 µL 0.8 M malat enjekte edin. Ardından, 10 µL 2 M glutamat enjekte edin. Kararlı bir oksijen akış sinyali elde edilene kadar hücresel solunumu üç ila beş dakika boyunca kaydedin.

Bundan sonra, enjeksiyon portu aracılığıyla hazneye 10 µL 0,05 M ADP enjekte edin. Oksijen akış sinyali artıp ardından azalarak stabilize olana kadar hücresel respirasyonu kaydedin. Kompleks II'ye bağımlı respirasyon için, izole mitokondriyal süspansiyon ile hazırlanmış bir oksigraf haznesine 2 µL 0,2 mM rotenon enjekte edin.

Stabil bir oksijen akısı sinyali elde edilene kadar hücresel solunumu kaydedin. Ardından, 20 µL bir molar süksinat enjekte edin. Stabil bir oksijen akısı sinyali elde edilene kadar hücresel solunumu kaydedin.

Bundan sonra, enjeksiyon portu aracılığıyla kamraya 10 µL 0.05 M ADP enjekte edin. Oksijen akış sinyali artıp ardından azalana ve stabilize olana kadar hücresel solunumu kaydedin. Kompleks IV'e bağımlı solunum için, izole mitokondriyal süspansiyon ile hazırlanmış bir oksigraf kamrasına 2.5 µL 0.8 mM askorbat enjekte edin.

Ardından, derhal 2,5 µL 0,2 molar TMPD ve 10 µL 0,05 molar ADP enjekte edin. Kararlı bir oksijen akış sinyali elde edilene kadar hücresel solunumu kaydedin. Daha sonra, 10 µL bir molar sodyum azit enjekte edin.

Oksijen akısı sinyali azalana ve ardından stabilize olana kadar hücresel solunumu kaydedin. Bu çalışmada, iskelet kasından sağlam mitokondriler izole edilir. Daha sonra, yüksek çözünürlüklü respirometri aracılığıyla Kompleks I bağımlı solunum hızları ölçülür.

Görüldüğü üzere, ADP eklenmesinin hemen ardından mitokondriyal solunum hızı artmaktadır. ADP tükenmesinden sonra solunum hızı, ADP eklenmesinden önce gözlemlenen seviyelere benzer düzeylere gerilemektedir. Bu durum, solunum kontrol oranı veya RCR olarak bilinen durum 3 ve durum 4 oranının yüksek olduğunu ve izolasyon prosedürü sırasında mitokondriyal bütünlüğün iyi korunduğunu göstermektedir.

Ardından, rotenon ile kompleks I solunumu inhibe edilip kompleks II substratı süksinat enjekte edilerek kompleks II'ye bağımlı solunum hızları gözlemlenir. Daha sonra ADP eklenir ve bu durum solunumda ani bir artışla sonuçlanır. ADP tükendiğinde, solunum ADP eklenmeden önce gözlemlenen seviyelere benzer şekilde azalır; bu durum, izolasyon sırasında mitokondriyal bütünlüğün iyi korunduğunu gösteren yüksek bir RCR'ye işaret eder.

Kompleks IV bağımlı solunum hızları, askorbat, TMPD ve ADP eklenerek gözlemlenir. Ardından, kompleks IV'ü inhibe etmek için sodyum azid eklenir. Sodyum azid eklenmesinden önceki ve sonraki oksijen tüketimi arasındaki fark, gerçek kompleks IV solunumu olarak yorumlanır. Durum 3'te gözlemlenen yüksek kompleks IV bağımlı solunum hızı, izolasyon prosedürü sırasında mitokondriyal bütünlüğün iyi korunduğunu gösterir.

Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem doğru şekilde yürütülürse bir buçuk saatten kısa sürede tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, homojenizasyon öncesinde oksijen sensörlerinin kalibrasyonunun önceden yapılmasının önemli olduğu unutulmamalıdır. Solunum hızlarındaki değişikliklerin mitokondriyal substrat eksikliğinden mi, membran potansiyelinden mi yoksa azalmış ATP sentaz enzimatik aktivitesinden mi kaynaklandığı gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, bu prosedürü takiben hücresel ADP içeriği, mitokondriyal membran potansiyeli ve substrat seviyeleri olarak ATP sentaz enzimatik aktivitesi ölçümleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, diferansiyel santrifügasyon yoluyla iskelet kasından mitokondri izolasyonunu ve yüksek çözünürlüklü respirometri kullanarak mitokondriyal kompleks I, II ve IV'ün solunum hızlarının nasıl ölçüleceğini iyi bir şekilde kavramış olmalısınız. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, mitokondriyal enerji metabolizması alanındaki araştırmacıların; genetik mitokondriyal hastalıklar, miyopatiler ve izole mitokondrilerde iskemi reperfüzyon hasarı gibi alanlarda mitokondriyal enerji fonksiyonunu incelemelerine olanak sağlamıştır. Antimycin A, rotenone, sodyum azid ve FCCP ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu prosedür uygulanırken eldiven ve laboratuvar önlüğü giymek gibi önlemler her zaman alınmalıdır.