Yüksek çözünürlüklü Solunum Ölçümleri için Diferansiyel Santrifüj tarafından İskelet Kası Bozulmamış Mitokondri izolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, iskelet kası mitokondrisini diferansiyel santrifüjleme ile izole etmek ve mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri I, II ve IV'ün solunum hızlarını belirlemektir.Bu yöntem, çeşitli nörolojik hastalıklar, sepsis ve yaşa bağlı bozukluklar gibi mitokondriyal disfonksiyon ile ilişkili hastalıklar ve sendromlar gibi mitokondriyal biyoenerjetik alandaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, izole mitokondriyal preparatta sitolojik faktörlerin çoğunun bulunmamasıdır, bu da mitokondri fonksiyonlarının analizine müdahale edebilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdaki teknisyen Sandra Nansoz olacak.

Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi iskelet kası örneklerinden oluşan bir beher alın. Beheri bir buz kovasının üzerine yerleştirin. İnce makas kullanarak kasları bir ila iki milimetre büyüklüğünde parçalar halinde kıyın.

Daha sonra, kıyma dokusunu her yıkama için 20 mililitre kullanarak buz gibi soğuk izolasyon tamponu ile iki kez durulayın. Yıkanmış dokuyu doku gramı başına 10 mililitre izolasyon tamponunda askıya alın ve ardından beş miligram proteaz-G dokusu ekleyin. Daha sonra kabı manyetik karıştırıcılı bir buz banyosuna yerleştirin ve 10 dakika karıştırın.

Bundan sonra, süspansiyonu, doku gramı başına% 0.2 yağsız BSA ile desteklenmiş ek bir 10 mililitre izolasyon tamponu ile seyreltin. Ardından, tüm izolasyon tamponunu beherden boşaltın. Her yıkama için 20 mililitre kullanarak% 0.2 BSA ile desteklenmiş buz gibi soğuk izolasyon tamponu ile dokuyu iki kez yıkayın.

Daha sonra, dokuyu gram doku başına 10 mililitre BSA takviyeli izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Dokuyu homojenize etmek için gevşek oturan bir tokmağı olan yarı otomatik bir cam homojenizatör kullanın. Daha sonra, homojenatı bir santrifüj tüpüne aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüjleyin.

Serolojik bir pipet kullanarak, süpernatanı atın. Peletleri, doku gramı başına 10 mililitre buz gibi BSA takviyeli izolasyon ortamı ile yeniden süspanse edin. Süspansiyonu dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 350 kez G'de santrifüjleyin.

Bundan sonra, süpernatanı ayırmak için serolojik bir pipet kullanın ve peleti atın. Süpernatanı, iki kat gazlı bez ile buz üzerinde tutulan bir behere süzün. Filtrelenmiş süspansiyonu bir santrifüj tüpüne aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 7.000 kez G santrifüjleyin.

Sonra süpernatanı atın. Ham mitokondriyal peleti, doku gramı başına beş mililitre BSA takviyeli izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Bu süspansiyonu dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 7.000 kez G santrifüjleyin.

Ardından, süpernatanı atın ve peleti 20 mililitre yıkama tamponunda tekrar askıya alın. Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 7.000 kez G'de santrifüjleyin. Bu yeniden süspansiyon ve santrifüjleme işlemini bir kez daha tekrarlayın.

Bundan sonra, süpernatanı atın ve peleti bir mililitre yıkama tamponunda tekrar askıya alın. Herhangi bir standart yöntem kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. Ardından, konsantre mitokondriyal süspansiyonu respirometri tahlilleri yapmaya hazır olana kadar buz üzerinde tutun.

Başlamak için, solunum tamponundaki mitokondriyal konsantreyi mililitre mitokondriyal protein başına 0.4 miligramlık bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edin. Ardından, solunum ortamını hava kalibrasyonlu oksigraf odasından aspire edin. 2.1 mililitre izole mitokondriyal süspansiyon ekleyin.

Oksigraf odasını kapatmak için bir durdurucu yerleştirin. Ardından, mitokondriyal süspansiyonu 37 santigrat derecede 700 RPM'de sürekli olarak karıştırın. Hücresel solunumu, kararlı bir oksijen akısı sinyali elde edilene kadar başlangıçta üç ila beş dakika boyunca kaydedin.

Karmaşık I'e bağlı solunuma başlamak için, durdurucunun titanyum enjeksiyon portundan izole edilmiş mitokondriyal süspansiyon ile hazırlanan bir oksigraf odasına 12.5 mikrolitre 0.8 molar malat enjekte edin. Ardından, 10 mikrolitre iki molar glutamat enjekte edin. Kararlı bir oksijen akısı sinyali elde edilene kadar hücresel solunumu üç ila beş dakika boyunca kaydedin.

Bundan sonra, enjeksiyon portundan hazneye 10 mikrolitre 0.05 molar ADP enjekte edin. Oksijen akısı sinyali artana, ardından azalana ve stabilize olana kadar hücresel solunumu kaydedin. Kompleks II'ye bağlı solunum için, izole mitokondriyal süspansiyon ile hazırlanan bir oksigraf odasına iki mikrolitre 0.2 milimolar rotenon enjekte edin.

Kararlı bir oksijen akışı sinyali elde edilene kadar hücresel solunumu kaydedin. Ardından, 20 mikrolitre bir molar süksinat enjekte edin. Kararlı bir oksijen akışı sinyali elde edilene kadar hücresel solunumu kaydedin.

Bundan sonra, enjeksiyon portundan hazneye 10 mikrolitre 0.05 molar ADP enjekte edin. Oksijen akısı sinyali artana, ardından azalana ve stabilize olana kadar hücresel solunumu kaydedin. Kompleks IV'e bağlı solunum için, izole mitokondriyal süspansiyon ile hazırlanan bir oksigraf odasına 2.5 mikrolitre 0.8 milimolar askorbat enjekte edin.

Daha sonra, hemen 2.5 mikrolitre 0.2 molar TMPD ve 10 mikrolitre 0.05 molar ADP enjekte edin. Kararlı bir oksijen akışı sinyali elde edilene kadar hücresel solunumu kaydedin. Ardından, 10 mikrolitre bir molar sodyum azid enjekte edin.

Oksijen akısı sinyali azalana kadar hücresel solunumu kaydedin, ardından stabilize olun. Bu çalışmada iskelet kasından sağlam mitokondri izole edilmiştir. Kompleks I'e bağlı solunum hızları daha sonra yüksek çözünürlüklü respirometri ile ölçülür.

Görülebileceği gibi, mitokondriyal solunum hızı ADP ilavesiyle hemen artar. ADP'nin tükenmesinden sonra solunum hızı, ADP ilavesinden önce gözlemlenenlere benzer seviyelere düşer. Bu, solunum kontrol oranı veya RCR olarak bilinen durum 3 ve durum 4'ün oranının yüksek olduğunu ve izolasyon prosedürü sırasında mitokondriyal bütünlüğün iyi korunduğunu gösterir.

Kompleks II'ye bağlı solunum hızları daha sonra rotenon ile kompleks I-solunumun inhibe edilmesi ve kompleks II-substrat süksinatın enjekte edilmesiyle gözlenir. Daha sonra ADP eklenir ve bu da solunumda ani bir artışa neden olur. ADP tükendiğinde, solunum, ADP'nin eklenmesinden önce gözlemlenenlere benzer seviyelere düşer, bu da yüksek bir RCR'ye işaret eder, çünkü mitokondriyal bütünlük izolasyon sırasında iyi korunur.

Askorbat, TMPD ve ADP eklenerek kompleks IV'e bağlı solunum hızları gözlenir. Sodyum azid ilavesinden önce ve sonra oksijen tüketimindeki fark, gerçek kompleks IV solunumu olarak yorumlanır. Durum 3'te gözlenen yüksek kompleks IV'e bağlı solunum hızı, izolasyon prosedürü sırasında mitokondriyal bütünlüğün korunduğunu gösterir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa bir buçuk saatten daha kısa sürede yapılabilir. Bu prosedürü denerken, homojenizasyondan önce oksijen sensörlerinin kalibrasyonunu önceden yapmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, solunum hızlarındaki değişikliklerin mitokondriyal substrat eksikliğinden kaynaklanıp kaynaklanmadığı, membran potansiyeli veya azalmış ATP sentaz enzimatik aktivitesinden kaynaklanıp kaynaklanmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için hücresel ADP içeriği, mitokondriyal membran potansiyeli, substrat seviyeleri olarak ATP sentaz enzimatik aktivitesi ölçümleri gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, diferansiyel santrifüjleme ile mitokondrinin bir iskelet kasından nasıl izole edileceğini ve yüksek çözünürlüklü respirometri kullanılarak mitokondriyal kompleks I, II ve IV'ün solunum hızlarının nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra mitokondriyal enerji metabolizması alanındaki araştırmacıların, izole mitokondriyal hastalıklar, miyopatiler, iskemi reperfüzyon hasarı gibi alanlarda mitokondri enerji fonksiyonunu keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Antimisin A, rotenon, sodyum azid ve FCCP ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Ve bu işlem yapılırken eldiven ve laboratuvar önlüğü giymek gibi önlemler her zaman alınmalıdır.