Name: Yüksek çözünürlüklü Solunum Ölçümleri için Diferansiyel Santrifüj tarafından İskelet Kası Bozulmamış Mitokondri izolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Öğrenin, diferansiyel santrifüjasyonla iskelet kası mitokondrisini izole etmeyi ve yüksek çözünürlüklü respirometriyle solunum zinciri komplekslerinin hızlarını ölçmeyi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (Grant 32003B_127619) tarafından desteklenmiştir.

kuadriseps kas biyopsisi mitokondri diferansiyel santrifüjleme ile izole edilen bir anestezi domuz, alınır. Domuz başka deney için sonradan kullanılır. Çalışma Deney hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Sağlık kılavuzların National Institutes uyarınca ve Kanton Bern, İsviçre Hayvan Bakım Komitesi onayı ile yapılır. 1. İskelet Kası Homojenizasyon ve Mitokondrial İzolasyon <ol><li> Tüketim bir anestezi domuz 5-10 gr kuadriseps kas örneği. Bu deneyde, domuz iskelet kası kullanımı. Bu protokol, aynı zamanda, diğer türlerden mitokondri izole etmek için kullanılabilir (örneğin, sıçan, fare, insan, vb.). NOT: Bu adım cerrahisi konusunda uzman bir tıp uzmanı tarafından yapılır. <ol><li> kas içine ketamin (20 mg / kg) ve ksilazin (2 mg / kg) ile oturaklı domuz anestezi içi ile indüklenen önceVenöz midazolam (0.5 mg / kg, artı atropin, 0.02 mg / kg). Ameliyat sırasında sürekli intravenöz propofol infüzyonu (h başına 4-8 mg / kg) ve fentanil (h 30 ug / kg) ile anestezi bakımı. </li></ol></li><li> Hemen buz soğukluğunda mitokondriyal yalıtım tamponu 20 mL (Tablo 1) ihtiva eden bir beher içinde doku örneği bırakın. Not: Tamponlar homojenleştirme sırasında ve santrüfüj soğuk buz olabilir ve sitosol ile uyumlu iyonik ve ozmotik kuvveti olan bir fizyolojik olarak ilgili pH sahip olmalıdır. </li><li> Bir analitik daralı dengesine beher doku örneği tartılır. yalıtım tamponu 20 mL beher dengesini dara. </li><li> bir buz kovası behere koyun. NOT: buz kovası sıcaklığında homojenizasyon işlemi için bir sonraki tüm adımları uygulayın ve buz kovası tüm tamponları tutun. </li><li> beher iskelet kası Kıyma ince SCISS kullanılarak 3-4 dakika boyunca 1-2 mm&#39;lik küçük parçalar halinde (buz üzerinde tutulur)ors. </li><li> buz gibi soğuk izolasyon tamponu (20 mL her yıkama basamağı) ile iki kez beher kıyılmış doku durulayın. </li><li> 5 mg proteaz / g doku ihtiva eden doku ağırlığı (g) başına yalıtım tamponu 10 hacim doku süspanse edin. </li><li> Manyetik karıştırıcı ile bir buz banyosu içinde beher yerleştirin ve 10 dakika süre ile karıştırıldı. </li><li> % 0.2 (ağırlık / hacim) yağsız büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ile desteklenmiş doku ağırlığı (g) başına yalıtım tamponu ilave 10 hacim beherde süspansiyon seyreltilir. </li><li> % 0.2 BSA ile takviye edilmiş yalıtım tamponu her süzün ve% 0.2 BSA (her biri 20 mL yıkama adımı) ile desteklenmiş buz soğuğu yalıtım tamponu ile iki kez beher doku yıkayın. </li><li> yağı alınmış BSA, 0.2% ile takviye edilmiş doku ağırlığı (g) başına yalıtım tamponu 10 hacim doku yeniden süspanse edin. </li><li> Bir gevşek havan eli (10 vuruş) ile (buz üzerinde tutulur), bir yarı-otomatik cam homojenleştirici ile doku homojenize edilir. NOT: HomogenizAynı şekilde, her zaman doku (vuruş aynı sayıda, örneğin, 10 vuruş) e. vuruş daha yüksek sayıda hasar ve mitokondri ayrılmalıdır olabilir. Tercihen, otomatik bir homojenleştirici kullanılarak doku homojen hale getirilir. El ile (ve sübjektif) cam homojenizatör içinde homojenize doku örnekleri izole mitokondri farklı kalitelerde üretebilir. </li><li> Santrifüj 10,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de homojenize dokusudur. Not: Tüm santrifüj adımları sabit açılı rotor ile santrifüj yapılmaktadır. </li><li> serolojik pipeti kullanarak süpernatant atılır ve BSA ile desteklenmiş buz soğukluğunda yalıtım ortamı içinde pelet (10 ml / g doku) tekrar süspansiyon. </li><li> Santrifüj 350 x g&#39;de 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de süspansiyon. </li><li> serolojik pipet kullanarak süpernatant rezerv ve pelet (hücresel enkaz) atın. </li><li> (17 iplik / cm2), hücre Debr kaldırmak için gazlı iki katmanı boyunca (buz üzerinde tutulur) bir beher içine süpernatant Filtreolduğunu. </li><li> Santrifüj 7,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca 4 ° C de süzüldü süspansiyon. </li><li> Süpernatant atılır ve 7,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de% 0.2 (ağırlık / hacim) BSA ve santrifüj süspansiyonu ile takviye yalıtım tamponu (5 ml / g doku) ham mitokondriyal pelletini. </li><li> Süpernatantı atın ve yıkama tamponu (Tablo 1) ham mitokondriyal pelletini. Santrifüj 7,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de tekrar süspansiyon. </li><li> g Süpernatant atılır ve yıkama tamponu içinde ham mitokondriyal pelletini ve x, 7,000, 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de tekrar süspansiyon santrifüj. </li><li> Süpernatantı atın ve yıkama tamponu 1.0 ml ham mitokondriyal pelletini. </li><li> mitokondriyal süspansiyonunun protein konsantrasyonu belirlemek ve buz üzerinde konsantre mitokondriyal süspansiyon tutun. Not: Protein konsantrasyonu, standart bir yöntem kullanılarak ölçülebilir. </li><li> hemen öncetahlilleri Solunum için, 0.4 mg / ml mitokondriyal protein içeren bir son konsantrasyona kadar solunum tamponu içinde mitokondriyal süspansiyon tekrar süspansiyon. </li></ol> 2. Yüksek çözünürlüklü Solunum <ol><li> Yüksek çözünürlüklü Oksigraf odası içine solunum tamponu (Tablo 1) 16 Pipet 2.1 mL sürekli kararlı bir oksijen akışının sinyaline kadar 1 saat boyunca 37 ° C &#39;de hazne (700 rpm) içinde mevcut bir manyetik karıştırma çubuğu kullanılarak tampon karışmaya polarografik oksijen sensörü elde edilir. NOT: Her Oksigraf odasının içinde Polarografik oksijen elektrotları, oksijen konsantrasyonu ölçmek ve her odasının içinde oksijen tüketimini (akı) hesaplayın. oksijen konsantrasyonu ve oksijen tüketim oranları (akı) veri toplama ve analiz yazılımı kullanarak bir bilgisayarda çevrimiçi gerçek zamanlı gösterilir. Buna ek olarak, doğru ve güvenilir sonuçlar elde etmek amacıyla, enstrümantal oksijen arka plan düzeltme olmalıüreticinin talimatlarına göre gerçekleştirilmiştir. Not: solunum tamponu Doğru 2.1 mL durdurucuların kapatılmasından sonra 2.0 mL&#39;lik nihai bir hücre hacmine kalibrasyonu için hazneye ilave edilir. </li><li> Üreticinin protokollerine 17 göre polarografik oksijen sensörünün bir hava kalibrasyonunu gerçekleştirin. NOT: Hava Kalibrasyon sırasında, bir gaz fazı varken, medya oksijen konsantrasyonu 15-20 dk sırasına dengelenmeye olacaktır. sıcaklık, hava basıncı, ve medya -Oksijen konsantrasyon çözünürlüğüne bağlı olarak hesaplanabilir. </li><li> Hava kalibrasyon sonra Oksigraf odasından solunum orta aspire ve Oksigraf bir bölmeye adım 1.24 izole mitokondriyal süspansiyonu (0.4 mg / ml mitokondriyal protein) 2.1 ml. NOT: solunum tampon hacmi kurmak alet ve üreticisine bağlıdır. yüksek çözünürlüklü Respirometrik için, solunum met 2.1 mLffer durdurucuların kapatılmasından sonra 2.0 mL&#39;lik nihai bir hücre hacmine kalibrasyonu için hazneye ilave edilir. </li><li> durdurucunun sokulmasıyla Oksigraf odası kapatın. </li><li> sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar sürekli bir 3-5 dakika boyunca başlangıçtaki 37 ° C &#39;de hazne (700 rpm) içinde mevcut bir manyetik karıştırma çubuğu ve kayıt hücresel solunum ile mitokondriyal süspansiyon karıştırılır. NOT: oksijen konsantrasyonu ve oksijen akı sinyal veri toplama ve analiz 17 için yazılım kullanan bir bilgisayarda çevrimiçi gerçek zamanlı gösterilir. </li><li> Daha sonra, aşağıdaki standart protokoller kullanılarak stoper titanyum enjeksiyon portu üzerinden mitokondriyal solunum için alt tabakaların ve inhibitörlerin enjekte edin. </li></ol> 3. Karmaşık I-bağımlı solunum <ol><li> adımda 2.1-2.5 ve tarif edilen prosedür takip edilerek izole mitokondriyal süspansiyonu (0.4 mg / ml) ihtiva eden bir Oksigraf odası hazırlamakistikrarlı bir sinyal beklemek. </li><li> (0.4 mg / ml), odacık durdurucu titanyum enjeksiyon ağzı vasıtası ile ve izole mitokondriyal süspansiyonu içeren Oksigraf odası içine 0.8 M malat 12.5 uL (5 mM nihai konsantrasyon) ve 2 M glutamat 10 uL (10 mM son konsantrasyon) enjekte sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar 3-5 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin. NOT: Aşağıdaki adımlarda tüm enjeksiyonlar şırıngalar kullanılarak stoper titanyum enjeksiyon portları aracılığıyla yapılmaktadır. </li><li> Daha sonra azalır ve (3-5 dk) stabilize, oda stoper titanyum enjeksiyon portu aracılığıyla Oksigraf odasına 0.05 M ADP (0.25 mM) 10 mcL enjekte edilir ve oksijen akı sinyal artar kadar mitokondriyal solunum kaydedin. NOT: ADP ilavesinden sonra solunum plato ADP konsantrasyonu yüksek ve doyurucu olduğunu gösterir. solunum sırasında kullanılan mitokondri miktarına bağlı olarak, ADP konsantrasyonu titre edilmelidiristikrarlı bir devlet 3 oksijen tüketimi (maksimum solunum) için. mitokondriyal süspansiyon ADP eklenmesi (devlet 3 solunum) artacak oksijen tüketiminde bir artış ve oksijen akı sinyalini neden olacaktır. ADP tükendikten sonra, oksijen akı sinyali (devlet 4 solunum) azalacak. </li></ol> 4. Kompleks II bağımlı solunum <ol><li> adımda 2.1-2.5 açıklanmıştır ve istikrarlı bir sinyal bekleyin prosedür takip izole mitokondriyal süspansiyonu (0.4 mg / ml) ihtiva eden bir Oksigraf gözü hazırlayın. </li><li> bir şırınga kullanılarak odası stoper titanyum enjeksiyon portu aracılığıyla Oksigraf odasına 0.2 mM rotenone (0.2 uM) &#39;DİKKAT&#39; 2 mcL enjekte edilir ve istikrarlı bir oksijen akı sinyali elde edilene kadar 3-5 dakika hücresel solunum kaydedin. NOT: Rotenon tehlikeli bir zehir olduğunu ve insan sağlığı üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. </li><li> Oksigraf ch olarak 1 M süksinat (10 mM) 20 uL enjektekehribar ve istikrarlı bir oksijen akı sinyali kadar 3-5 dakika rekor mitokondriyal solunum elde edilir. </li><li> Daha sonra azalır ve (3-5 dk) stabilize, stabilize, oda stoper titanyum enjeksiyon portu aracılığıyla Oksigraf odasına 0.05 M ADP (0.25 mM) 10 mcL enjekte edilir ve oksijen akı sinyal artar kadar hücresel solunum kaydedin. NOT: mitokondriyal süspansiyon ADP eklenmesi (devlet 3 solunum) artacak oksijen tüketiminde bir artış ve oksijen akı sinyalini neden olacaktır. ADP tükendikten sonra, oksijen akı sinyali (devlet 4 solunum) azalacak. </li></ol> 5. Karmaşık IV-bağımlı solunum <ol><li> adımları protokol 2.5&#39;e 2.1 ve sabit bir sinyal bekleyin tarif edilen prosedür izlenerek izole mitokondriyal süspansiyonu ihtiva eden bir Oksigraf odası (0.4 mg / ml) hazırlayın. </li><li> Daha sonra 0.8 mM askorbat 2.5 uL (1 mM) enjekte edilir. Hemen ardından 0.2 2.5 uL enjekteM TMPD (0.25 mM) ve oksijen akı sinyal artar kadar Oksigraf odası ve kayıt hücresel solunum içine 0.05 M ADP (0.25 mM) 10 uL ve (3-5 dk) stabilize eder. </li><li> Son olarak Oksigraf odası içine 1 M sodyum azit (5 mM) &#39;DİKKAT&#39; 10 uL enjekte oksijen akı sinyali düşene kadar hücresel solunum kayıt ve stabilize eder. NOT: Sodyum azid tehlikeli bir zehir olduğunu ve insan sağlığı üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. </li></ol> 6. Sitokrom C Testi <ol><li> adımları protokol 2.5&#39;e 2.1 ve sabit bir sinyal bekleyin tarif edilen prosedür izlenerek izole mitokondriyal süspansiyonu ihtiva eden bir Oksigraf odası (0.4 mg / ml) hazırlayın. </li><li> (0.4 mg / ml), odacık durdurucu titanyum enjeksiyon ağzı vasıtası ile izole mitokondriyal süspansiyonu içeren Oksigraf odası içine 0.8 M malat 12.5 uL (5 mM nihai konsantrasyon) ve 2 M glutamat 10 uL (10 mM son konsantrasyon) enjektesabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar 3-5 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin. </li><li> Daha sonra azalır ve (3-5 dk) stabilize, oksijen akı sinyal artar kadar bölme stoper ve kayıt mitokondriyal solunum titanyum enjeksiyon portu aracılığıyla Oksigraf odasına 0.5 M ADP (2.5 mM) 10 mcL enjekte edilir. </li><li> Son olarak, Oksigraf odası içine, 4 mM sitokrom c (10 uM) ve 5 uL enjekte etmek ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar 5 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin. </li></ol>

<ol><li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues.+I.+Isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver%3B+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).</li>
<li>Sims, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+metabolically+active+mitochondria+from+rat+brain+and+subregions+using+Percoll+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation.</a> J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).</li>
<li>Hartwig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+comparison+between+two+classical+and+a+kit-based+method+for+mitochondria+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation.</a> Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li>
<li>Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+permeabilization+for+the+high-throughput+measurement+of+compartmented+enzyme+activities+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells.</a> Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).</li>
<li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle%3A+new+perspectives+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li>
<li>Vuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+catecholamines+on+hepatic+and+skeletal+muscle+mitochondrial+respiration+after+prolonged+exposure+to+faecal+peritonitis+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs.</a> Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).</li>
<li>Corrêa, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+in+septic+shock%3A+effects+on+tissue+perfusion%2C+organ+function%2C+and+mitochondrial+respiration+in+a+porcine+model+of+fecal+peritonitis%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis.</a> Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).</li>
<li>Jeger, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+response+of+endotoxin+on+hepatocyte+and+muscle+mitochondrial+respiration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro.</a> Biomed Res Int. 2015, 353074(2015).</li>
<li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicholls%2C+DG+%22Bioenergetics%22">Bioenergetics</a>. 3, Academic Press. San Diego. (2002).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Enzymol.+Relat.+Subj.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3076726/">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+phosphorylation+efficiency+and+depression+of+uncoupled+respiration+in+mitochondria+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PLoS One. 6 (3), e18317(2011).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+functional+impairment+with+aging+is+exaggerated+in+isolated+mitochondria+compared+to+permeabilized+myofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers.</a> Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).</li>
<li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+crude+mitochondrial+fraction+by+density-gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell.+Biol.+Chapter+3%22%5BJournal%5D)">Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation.</a> Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).</li>
<li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PLoS One. 8 (12), 382392(2013).</li>
<li>Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+basic+mitochondrial+functions+using+rat+tissue+homogenates%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates.</a> Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).</li>
<li>Lombardi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+oxidative+phosphorylation+in+skeletal+muscle+mitochondria+subpopulations+in+pig%3A+a+study+using+top-down+elasticity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis.</a> FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu çalışmada, yüksek kaliteli, sağlam ve yüksek çözünürlüklü Respirometrik gibi fonksiyonel çalışmalar için kullanılabilecek diferansiyel santrifüj sıkıca bağlanmış iskelet kası mitokondri izole etmek için bir protokol açıklar. sağlam ve sıkı birleştiğinde mitokondri izole etmek amacıyla, mevcut protokolü kapsamında dikkate alınması gereken bazı kritik noktalar vardır. iskelet dokusu hasat sonra, hemen buz gibi soğuk mitokondriyal izolasyon tampon dalmış olmalıdır. Bütün santrifüjleme aşamal...

Mitokondrial biyoenerji ve solunum kapasiteleri permeabilize hücrelerin veya liflerin değil, aynı zamanda izole edilmiş mitokondride sadece incelenebilir. Bu çalışmada, yüksek çözünürlüklü Solunum ölçümleri için diferansiyel santrifüj kullanılarak sağlam iskelet kası mitokondri izole etmek için bir protokol açıklar. Respirometrik bozulmadan mitokondri izole etmek için, doku homojen hale getirilir ve mitokondri bilinen bir diferansiyel santrifügasyon yöntemi ile izole edilir. Diferansiyel santrifüj yöntemi sıralı santrifüj ilk Pallade tarafından tanıtıldı doku homojenatlarında ve işçiler neredeyse 70 yıl önce 1 (artan bir hızla bir dizi) dayanır. Doku ilk makas kullanılarak kıyılmış ve gevşek tokmak bir cam homojenizatör mekanik olarak homojenize edilir. Daha sonra Homojenat düşük hız ve kesintisiz doku içeren ortaya çıkan pelet, hücresel santrifüj edilirenkaz ve çekirdekler atılır. Daha sonra, üst faz, yüksek hızda birkaç kez santrifüj uygulanır ve mitokondriyal zenginleştirilmiş fraksiyon toplanır. diferansiyel santrifüj yöntemin avantajları mitokondrinin yönündedir izole etmek için: i) yöntemi hızlı ve mitokondri (solunum deneyler mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır) 1-1.5 saat içinde izole edilebilir; ii) ucuzdur; ve iii) çok verimli ve diferansiyel santrifüjleme ile elde edilen mitokondri Solunum tahlilleri için yeterince saf olan. diferansiyel santrifüj yöntemin dezavantajları mitokondrinin olan izole etmek i) mitokondri hasarlı ve homojenizasyon sırasında uncoupled alabilirsiniz; ii) diğer hücresel bileşenleri ile mitokondri (kirlenmesi daha yıkama ek santrifüj adımları ile mitokondriyal pelet) tarafından çözülebilir; iii) diferansiyel santrüfüj adımları sırasında, örneğin farklı mitokondriyal alt popülasyonlar, seçme imkanı, mitAlt Yoğun ile ochondria 7 alınmayabilir; ve iv) mitokondriyal hücresel çevre eksik sadece teorik maksimum solunum ölçülebilir. Solunum deneyleri için mitokondri izole edilmesi için bir başka yöntem, yoğunluk gradyanlı santrifüj 2&#39;dir. göre diğer hücresel bileşenleri izole edilmesi mitokondri neden Bu teknikte, doku ekstraktı sakaroz veya (santrifüj tüpünün dibinde daha yüksek bir yoğunluğa sahip), bir Percoll gradyanı eden bir çözeltiye üzerine yayıldı ve belli bir hızda santrifüj onların yoğunlukları. Bu yöntem genellikle sinaptozomlarda çok düşük kirlenme beyin mitokondri izole etmek için kullanılır. Bununla birlikte, yoğunluk gradyan santrifüjü ile izole edilmiş sıçan karaciğeri mitokondri yüksek diğer hücresel organellerin 3 kirlenir. Bu yöntemin sınırlamaları biri santrifüj tüpünde sukroz gradient mevcut bu yüzden kopma olabilir kiBana mitokondri (ozmotik şok). doku tipine bağlı olarak; diferansiyel santrifüj ile sağlam mitokondri izolasyonu için dikkat etmeniz gereken bazı önemli faktörler vardır. İlk gerekliliği hassas bir şekilde doku homojenize etmek. böbrek, beyin ve karaciğer gibi yumuşak dokuların homojenleştirme sırasında uygulanan hafif bir mekanik kuvvetleri gerektirir. Bu tür çok daha güçlü mekanik kuvvetler gerektiren kalp ve iskelet kası gibi sert dokularda ile çelişmektedir. Kıyılmış doku önce genelde doku yumuşatmak için homojenizasyona proteinaz ile işlenir. Homojenizasyon ve santrifüj esnasında kullanılan bütün tampon soğuk buz olabilir ve sitozol 4, 5 ile uyumlu iyonik ve ozmotik kuvveti olan bir fizyolojik olarak ilgili pH sahip olmalıdır. izole mitokondriyal biyoenerjitiklerinin okuyan avantajlarından biri, hücresel plazma zarları permeabi olması gerekmez olmasıdırmitokondrial dış membran bütünlüğünü tehlikeye düşürecek gibi digitonin veya saponin 4, 6 gibi deterjanlar ile lized. İzole mitokondri bir başka avantajı, örneğin, oksijen tüketimi mitokondriyal işlev analizi ile müdahale diğer sitosolik faktörlere bulunmamasıdır. İzole mitokondri ile dezavantajları santrifüj adımları sırasında belirli mitokondriyal popülasyonlarının olası seçimi, homojenleştirme sırasında mitokondriye zarar ve izole mitokondri 7, 8, iyi bir verim elde etmek için biyolojik örnekler, yüksek miktarlarda şartı vardır. İzolasyon işleminden sonra, mitokondriyal komplekslerinin solunum hızları I, II ve IV-bağımlı (Devletleri 2, 3 ve 4) Yüksek çözünürlüklü Solunum kullanılarak tespit edilir. kompleks I-odaklı solunum, glutamatve malat adenozin difosfat (ADP) eklendi edilmektedir. Kompleks II odaklı solunum için, süksinat ADP ardından eklenir. Kompleks IV odaklı solunum, askorbat ve tetramethylphenylendiamine (TMPD) ADP 9, 10, 11, 12, ardından ilave edilir. Durum 2, tek başına alt-tabakaların mevcudiyetinde oksijen tüketimi anlamına gelir. Durum 3 substratları ve ADP mevcudiyetinde oksijen tüketimi anlamına gelir. Devlet 4 ADP tükenmesi sonra oksijen tüketimi anlamına gelir. Solunum kontrol oranı (RCR) oksijen tüketimi ATP üretimi kuplajın bir dizin ve durum 3 ve durum 4 13, 15 arasındaki oran olarak hesaplanmıştır. Özetle, biz diferansiyel santrifüj ile fonksiyonel ve sağlam iskelet kası mitokondri izole etmek ve bu izole mitochon kullanmak için bir protokol tarifyüksek çözünürlüklü Respirometrik gibi işlevsel ve biyoenerjik çalışmalar için Dria.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A 4386</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Antimisin A</td><td>Sigma</td><td>A 8674</td><td>Kimyasal, etanol içinde çözün</td></tr><tr><td>Askorbat</td><td>Merck</td><td>1.00127</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A 7699</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A 6003</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>fluka</td><td>3779</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Glutamat</td><td>Sigma,</td> <td>G 1626</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H 7523</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>1.04873</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>K-laktobiyonat</td><td>Sigma</td><td>L 2398</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>MgCl 2</td><td>Sigma</td><td>M 9272</td><td></td></tr><tr><td>Kimyasal Morfolinopropan sülfonik asit (MOPS)</td> <td>Merck</td><td>1.06129</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>O2k-Çekirdek: Oksigraf-2k&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>Yüksek çözünürlüklü respirometri cihazı</td></tr><tr><td>Proteinaz, bakteriyel</td><td>Sigma</td><td>P 8038</td><td></td></tr><tr><td>Kimyasal Sodyum azid</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R 8875</td><td>Kimyasal, etanol içinde çözün</td></tr><tr><td>Süksinat</td><td>Sigma</td><td>S 2378</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Schuett homojen-artı yarı otomatik homojenizatör&nbsp;</td><td>schuett-biotec GmbH</td><td>3.201 011</td><td>Doku homojenleştirici</td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma</td><td>T 8691</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma</td><td>T 3134</td><td>Kimyasal</td></tr></tbody></table>

yüksek çözünürlüklü solunum Ölçümleri için diferansiyel santrifüj tarafından İskelet kası bozulmamış mitokondri izolasyonu

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitokondri, hücresel enerji metabolizmasında yer alır ve adenozin trifosfat (ATP) formunda enerji üretmek için oksijeni kullanır. Düşük ve yüksek hızda diferansiyel santrifüjleme, mitokondriyi dokulardan ve kültürlenmiş hücrelerden izole etmek için yaygın olarak kullanılır. Diferansiyel santrifüjleme ile elde edilen ham mitokondriyal fraksiyonlar, respirometri ölçümleri için kullanılır. Diferansiyel santrifüjleme tekniği, organellerin boyutlarına ve sedimantasyon hızlarına göre ayrılmasına dayanır. Mitokondri izolasyonu, doku alımından hemen sonra gerçekleştirilir. Doku, buz gibi soğuk bir homojenizasyon ortamına daldırılır, makas kullanılarak kıyılır ve gevşek oturan bir havaneli ile bir cam homojenizatörde homojenize edilir. Diferansiyel santrifüjleme tekniği verimli, hızlı ve ucuzdur ve diferansiyel santrifüjleme ile elde edilen mitokondri, respirometri testleri için yeterince saftır. Diferansiyel santrifüjlemeye dayanan izole mitokondrinin bazı sınırlamaları ve dezavantajları, homojenizasyon ve izolasyon prosedürü sırasında mitokondrinin zarar görebilmesi ve mitokondriyal izolasyon için büyük miktarlarda doku biyopsisi veya kültürlenmiş hücrelerin gerekli olmasıdır.

Kompleks I bağımlı solunum İzole mitokondriyal kompleks I-bağımlı solunum hızları (devletler 2, 3 ve 4) yüksek çözünürlüklü Solunum (Şekil 1, temsili bir diyagram) kullanılarak belirlenmiştir. Mitokondrial kompleks I alt-tabakalar, glutamat ve malat, ADP ilave edildi ilave edilir. Durum 2, tek başına alt-tabakaların mevcudiyetinde oksijen tüketimi anlamına gelir. Durum 3 substratları ve ADP me...

Burada, anestezi uygulanmış bir domuzdan kuadriseps kas örneği alınır ve mitokondri diferansiyel santrifüjleme ile izole edilir. Daha sonra, mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri I, II ve IV'ün solunum hızları, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanılarak belirlenir.

Yüksek çözünürlüklü Solunum Ölçümleri için Diferansiyel Santrifüj tarafından İskelet Kası Bozulmamış Mitokondri izolasyonu

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Bu prosedürün genel amacı, diferansiyel santrifüjasyon yoluyla iskelet kası mitokondrilerini izole etmek ve mitokondriyal solunum zinciri kompleks I, II ve IV'ün solunum hızlarını belirlemektir. Bu yöntem, çeşitli nörolojik hastalıklar, sepsis ve yaşa bağlı bozukluklar gibi mitokondriyal disfonksiyonla ilişkili hastalıklar ve sendromlar gibi mitokondriyal biyoenerjetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, izole edilen mitokondriyal preparatta, mitokondri fonksiyonlarının analizini etkileyebilecek sitolojik faktörlerin çoğunun bulunmamasıdır. Prosedürü, laboratuvarımdaki teknisyen Sandra Nansoz uygulamalı olarak gösterecektir.Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği şekilde iskelet kası örneklerinin bulunduğu bir beher temin edin. Beheri bir buz kovasının üzerine yerleştirin. İnce uçlu makas kullanarak, kası bir ila iki milimetre boyutunda parçalar halinde kıyın.Ardından, kıyılmış dokuyu her yıkama için 20 mililitre kullanarak buz gibi soğuk izolasyon tamponu ile iki kez durulayın. Yıkanmış dokuyu gram başına 10 mililitre izolasyon tamponunda süspande edin ve ardından beş miligram protease-G doku ekleyin. Daha so

isolation-intact-mitochondria-from-skeletal-muscle-differential

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, iskelet kaslarının izole edilen mitokondri solunum çalışması için bir prosedür açıklanmıştır. Bu yöntem Scorrano...

İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Memeli Doku biyopsilerinden mitokondri hızlı izole edilmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Sıçan karaciğer, iskelet kası ya da preparat, ticari ayrıştırıcı doku homojenize edildi ve mitokondri naylon gözenekli filtrelerden geçerek, süzme ile izole edilmiştir. Seçenek yöntemler kullanılarak da 100 dakika - Mitokondriyal izolasyon süresi 60 kıyasla &lt;30 dk.

Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma

Vastus lateralis biyopsi saflaştırılmış mitokondrinin preparasyonu ve respirometrik profil için yöntemler tarif edilmiştir. Küçük kas hacminin kullanımı klinik araştırma uygulamaları için bu teknik uygundur.

Perkütan İğne Biyopsisi ile Elde Edilen İskelet Kası Doku İzole Mitokondri hazırlanması ve Respirometrik Değerlendirmesi

Burada, daha küçük miktarlarda fare iskelet kasından yüksek kaliteli ve saflaştırılmış mitokondrinin izolasyonuna izin veren daha önce bildirilen bir yöntemin bir modifikasyonunu sunuyoruz. Bu prosedür, mikroplaka bazlı respirometirk testleri sırasında yüksek işlevle solunum yapan yüksek oranda bağlanmış mitokondri ile sonuçlanır.

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Mitokondri, iskelet kasında yüksek düzeyde fenotipik plastisite gösteren anahtar metabolik organellerdir. Sitozolden protein ithalatı, retikülün genişlemesi ve mitokondriyal fonksiyonun sürdürülmesi için gerekli olan organel biyogenez için kritik bir yoldur.  Bu nedenle, protein ithalatı hücresel sağlığın barometresi olarak hizmet eder.

İskelet Kas Mitokondrilerinin Protein İthalat Kapasitesinin Ölçümü

Burada, fare iskelet kasından mitokondri izolasyonu için ayrıntılı bir yöntem ve ardından mikroplaka tabanlı respirometrik testler kullanılarak Oksijen Tüketim Hızı (OCR) ile solunum analizi için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu boru hattı, çoklu çevresel veya genetik müdahalelerin mitokondriyal metabolizma üzerindeki etkilerini incelemek için uygulanabilir.

Respirometrik Testler için Fare İskelet Kasından Mitokondri İzolasyonu

Atlar olağanüstü bir aerobik egzersiz kapasitesine sahiptir, bu da at iskelet kasını hem at egzersiz fizyolojisi hem de memeli mitokondriyal fizyolojisi çalışmaları için önemli bir doku haline getirir. Bu makalede, at iskelet kasında mitokondriyal fonksiyonun kapsamlı değerlendirilmesi için teknikler açıklanmaktadır.

At İskelet Kasının Yüksek Çözünürlüklü Floro-Respirometrisi

Mitokondri ile ilgili biyoenerjetik ve metabolomik çalışmalar, mitokondrilerin birçok hastalıkta çok yönlü rolünü ortaya koymuştur, ancak bu organeller için izolasyon yöntemleri farklılık göstermektedir. Burada ayrıntılı olarak açıklanan yöntem, yüksek kaliteli mitokondriyi birden fazla doku kaynağından saflaştırma yeteneğine sahiptir. Kalite, solunum kontrol oranları ve yüksek çözünürlüklü respirometri ile değerlendirilen diğer metriklerle belirlenir.

Kemirgen Kalp Dokusundan Sağlam Mitokondriyal İzolasyon 

Mikro-disseke eksplantlar tekniği, iskelet kas kök hücre kaynağı olarak çocuk, yetişkin ya da embriyonik kasları proliferatif iskelet kas hücreleri izole için sağlam ve güvenilir bir yöntemdir. Benzersiz, bu hücrelerin klonal in vivo nakli için kullanılan iskelet kas kök hücre hatları üretmek için türetilmiştir.

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Doğrudan kalsiyum kıvılcım ölçülmesi için bir yöntem aşağıda tarif edilmiştir, Ca2 + elementer birim sağlam iskelet kas lifleri Sarkoplazmik retikulumdan bırakın. Bu yöntem, izole kas lifleri riyanodin reseptörü, Ca2 + serbest ozmotik stres-kaynaklı tetikleme kullanır. Dinamikleri ve hücre içi Ca 2 + sinyalizasyon homeostatik kapasitesi sağlığı ve hastalıkları, kas fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilir.

Kalsiyum değerlendirilmesi Bozulmamış İskelet kas liflerinin içinde Sparks

Öğrenin, diferansiyel santrifüjasyonla iskelet kası mitokondrisini izole etmeyi ve yüksek çözünürlüklü respirometriyle solunum zinciri komplekslerinin hızlarını ölçmeyi.

Yüksek çözünürlüklü Solunum Ölçümleri için Diferansiyel Santrifüj tarafından İskelet Kası Bozulmamış Mitokondri izolasyonu

Daha fazla video keşfet