Name: RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Öğrenin, SPLASH yöntemiyle biyotinlenmiş psoralen kullanarak RNA-RNA etkileşimlerini genom çapında nasıl haritalayacağınızı. Bu teknik maya, bakteri ve insan hücrelerinde yüksek verimli in vivo etkileşim analizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bilgilendirici tartışmalar için Wan laboratuvarının üyeleri ve Nagarajan laboratuvarına teşekkür ediyoruz. N.Nagarajan, A * STAR&#39;ın finansmanı ile desteklenmektedir. Y.Wan, A * STAR ve Society of Science-Branco Weiss Kardeşliği fonlarından desteklenmektedir.

<ol><li>Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+transcriptome+through+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">Understanding the transcriptome through RNA structure.</a> Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).</li>
<li>Kertesz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+measurement+of+RNA+secondary+structure+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast.</a> Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Measurement+of+RNA+Folding+Energies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies.</a> Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).</li>
<li>Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+RNA+structure+using+nuclease+digestion+and+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing.</a> Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).</li>
<li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).</li>
<li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li>
<li>Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking%2C+ligation%2C+and+sequencing+of+hybrids+reveals+RNA-RNA+interactions+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).</li>
<li>Sugimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hiCLIP+reveals+the+in+vivo+atlas+of+mRNA+secondary+structures+recognized+by+Staufen+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1.</a> Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).</li>
<li>Engreitz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-RNA+interactions+enable+specific+targeting+of+noncoding+RNAs+to+nascent+Pre-mRNAs+and+chromatin+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites.</a> Cell. 159 (1), 188-199 (2014).</li>
<li>Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+determination+of+RNA+structure+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation.</a> Nat.Biotechnol. , (2015).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Duplex+Map+in+Living+Cells+Reveals+Higher-Order+Transcriptome+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure.</a> Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).</li>
<li>Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Mapping+of+Human+RNA-RNA+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions.</a> Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).</li>
<li>Aw, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Mapping+of+Eukaryotic+RNA+Interactomes+Reveals+Principles+of+Higher-Order+Organization+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation.</a> Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).</li>
</ol>

Yazarların rekabet eden finansal çıkarları yok.

Burada, çift-bilge RNA etkileşimlerini genom çapında tanımlamamızı sağlayan bir yöntem olan SPLASH için deneysel ve hesaplamalı iş akışını detaylı olarak açıklıyoruz. Bakteri, maya ve insan kültürlerinde SPLASH&#39;ı başarıyla kullandık ve stratejinin farklı hücresel koşullar altında çeşitli organizmalara yaygın olarak uygulanabileceğini öngörüyoruz. Protokoldeki kritik adımlardan biri, aşağı akış süreçleri için yeterli materyali elde etmek için en az 20 μg çapraz bağlanmış RNA ile başlamaktır. RNA, daha sonra 100 baza ...

Makromoleküllerin birbirleriyle nasıl katlandığını ve etkileşim kurduğunu incelemek, hücredeki gen düzenlenişini anlamak için anahtardır. DNA ve proteinlerin gen regülasyonuna nasıl katkıda bulunduğunu anlama konusunda son on yılda çok fazla çaba sarf edilmesine rağmen, gen ifadesinin transkripsiyon sonrası regülasyonu hakkında nispeten daha az şey bilinmektedir. RNA hem doğrusal sekansında hem de sekonder ve tersiyer yapıda bilgi taşır 1 . Kendisi ve başkaları ile çiftleşebilme kabiliyeti , in vivo fonksiyonu için önemlidir. Yüksek verimli RNA ikincil yapı taramasındaki son gelişmeler, transkriptomda 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howe&#39;deki çift ve tek sarmal bölgelerin yerlerine değerli bilgiler sağlamıştırEşleştirme etkileşimi ortakları hakkındaki ver bilgileri hala büyük ölçüde eksiktir. Hangi RNA sekansının transkriptomdaki başka bir RNA bölgesi ile etkileşime girdiğini belirlemek için küresel çaplı bilgiye ihtiyacımız var. Çift-bazlı RNA etkileşimlerini küresel, tarafsız bir şekilde haritalamak geleneksel olarak büyük bir mücadele olmuştur. CLASH 9 , hiCLIP 10 ve RAP 11 gibi daha önceki yaklaşımlar RNA etkileşimlerini büyük ölçekte tanımlamak için kullanılırken, bu teknikler tipik olarak belirli bir protein veya RNA türü ile etkileşime giren bir RNA alt kümesi için RNA baz eşleştirmesini eşleştirir. Küresel RNA etkileşimlerinin incelenmesindeki son gelişmeler, RNA etkileşimlerini in vivo olarak stabilize etmeyen ve dolayısıyla sadece in vivo etkileşimlerin bir alt kümesini yakalayabilen RPL 12 yöntemini içerir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için biz ve diğerleri genom çapında, tarafsız stratejiler geliştirdiler.P RNA , in vivo olarak, çapraz bağlayıcı psoralen 13 , 14 , 15&#39;in değiştirilmiş versiyonları kullanılarak etkileşir. Bu protokolde, baz eşleştirme RNA&#39;larını in vivo çapraz bağlamak için biyotinlenmiş psooren kullanan P soralen çapraz bağlanmış, L ve s seçilmiş H zincirlerinin (SPLASH) eşitliğinin gerçekleştirilmesine ilişkin ayrıntıları, ardından proximity ligasyonu ve yüksek işleme sıralamasını RNA baz eşleştirme ortaklarını genom çapında tanımlayın ( Şekil 1 ) 15 . Bu yazıda, kültürlü adherent hücreleri (bu durumda HeLa hücreleri) kullanarak SPLASH&#39;ı gerçekleştirmek için gerekli adımları anlatacağız. Aynı protokol süspansiyon memeli hücrelerine ve maya ve bakteri hücrelerine kolaylıkla uyarlanabilir. Kısaca, HeLa hücreleri biotinile psoralen ile muamele edilir ve in vivo etkileşen RNA baz çiftlerini çapraz bağlamak için 365 nm&#39;de ışınlanır. RNA&#39;lar daha sonra hücrelerden çıkarılır, parçalanır ve streptavidin boncukları kullanılarak çapraz bağlanma bölgesi için zenginleştirilir. Etkileşen RNA parçaları daha sonra yakınlık ligasyonu kullanılarak bağlanır ve derin sekanslama için bir cDNA kütüphanesine dönüştürülür. Sıralamada, kimerik RNA&#39;lar, birbirlerine eşleştirilen RNA etkileşimli bölgelerin tanımlanması için transkriptom / genom üzerine eşlenir. Yapısal organizasyon ve etkileşim kalıplarına göz atmak için snoRNA&#39;lar, lncRNA&#39;lar ve mRNA&#39;lar gibi farklı RNA sınıflarında intramoleküler ve moleküller arası RNA baz eşleştirmesi de dahil olmak üzere , mayada ve farklı insan hücrelerinde in vivo olarak binlerce RNA etkileşimini tanımlamak için SPLASH&#39;ı başarıyla kullandık. Hücredeki RNA&#39;ların

<table><tbody><tr><td>1 kb Plus DNA Merdiveni</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10787026</td><td>DNA merdiveni</td></tr><tr><td>10 bp DNA merdiveni</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10821-015</td><td>DNA merdiveni</td></tr><tr><td>%20 SDS çözümü</td><td>İlk BAZ</td><td>BUF-2052-1L&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Birinci TABAN</td><td>BUF-3050-20X1L</td><td></td></tr><tr><td>3.0 M Sodyum Asetat Çözeltisi</td><td>Birinci BAZ</td><td>BUF-1151-1L-pH5.2&nbsp; &nbsp;</td><td>Nükleik asit çökeltmesi için gereklidir</td></tr><tr><td>% 40 Akrilamid / Bis Çözeltisi, 19: 1</td><td>Bio-Rad</td><td>1610145</td><td>TBE Üre jel bileşeni</td></tr><tr><td>Ambion Tampon Kiti</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Persülfat, Moleküler Sınıf&nbsp; &nbsp;</td><td>Promega</td><td>V3131&nbsp;</td><td>TBE Üre jel bileşeni</td></tr><tr><td>Bromofenol Mavi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Merck</td><td>1.02445.1000</td><td>RNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>Tek iplikli DNA ligaz</td><td>Merkez üssü</td><td>CL9025K</td><td>CircLigase II ssDNA Ligaz</td></tr><tr><td>Santrifüj tüp filtreleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8160-96EA</td><td>Costar Spin-X santrifüj tüpü filtreleri</td></tr><tr><td>D5628-1G DIGITONIN KRİSTAL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628-1G</td><td>Hücre tedavisi için</td></tr><tr><td>Karanlık Okuyucu Transilluminator&nbsp;</td><td>Clare Kimyasal Araştırma</td><td>Karanlık Okuyucu DR89X Transilluminator</td><td>Mavi ışık transilluminatör</td></tr><tr><td>DNA Jel Yükleme Boyası (6x)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>R0611</td><td>Agaroz jel elektroporasyonu için gerekli</td></tr><tr><td>Hela hücre kültürü</td>için<td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Orta</td><td>Pan</td><td>BioTech P04-03500</td></tr><tr><td>Streptavidin manyetik boncukları</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>65002</td><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1&nbsp;</td></tr><tr><td>15 & için manyetik stand; mL tüpler</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>12301D</td><td>DynaMag-15 15</td></tr><tr><td>& nbsp için manyetik stand; mL tüpler</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382 000.015</td><td>Eppendorf ThermoMixer&nbsp; C</td></tr><tr><td>Biyotinillenmiş psoralen</td><td>Yaşam Teknolojileri Holdings Pte Ltd</td><td>29986</td><td>EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin</td></tr><tr><td>F8T5 / BL & nbsp;</td><td>Hitachi</td><td>F8T5 / BL&nbsp;</td><td>365 nm UV ampul</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Yaşam Teknolojileri Holdings Pte Ltd</td><td>10270106&nbsp; &nbsp;</td><td>Hela ortamının bileşenleri</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Promega</td><td>H5052&nbsp; &nbsp;</td><td>Hibridizasyon tamponundaki bileşen</td></tr><tr><td>G8T5</td><td>Sankyo-Denki</td><td>G8T5</td><td>254 nm UV ampul</td></tr><tr><td>Glikojen</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10814010</td><td>Nükleik asit çökeltmesi için gerekli</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>Nükleik asit miktar tayini için</td><td>Nanodrop 2000</td> Spektrofotometre</tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su&nbsp;</td><td>BİRİNCİ BAZ</td><td>BUF-1180-500ml & &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin&nbsp; &nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri Holding Ticaret A.Ş</td><td>. 15140122&nbsp; &nbsp;</td><td>Hela ortamının bileşenleri</td></tr><tr><td>Yüksek Kaliteli DNA polimeraz (2x)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>F531L&nbsp;</td><td>Phusion HF Tamponlu Yüksek Kaliteli PCR Master Karışımı (2x)</td></tr><tr><td>Astar Seti 1</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335L&nbsp;</td><td>PCR primerleri</td></tr><tr><td>DNA Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>QIAgen</td><td>28106</td><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon</td></tr><tr><td>Kiti Florometrik Miktar Tayin kiti</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>Q32854</td><td>Qubit dsDNA HS Test Kiti</td></tr><tr><td>RNA temizleme kiti</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>RNeasy Mini Kit Silika membran sütunu</td></tr><tr><td>Rnase İnhibitörü</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>AM2696</td><td>SUPERase In</td></tr><tr><td>Ters transkriptaz</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>18080400</td><td>SuperScript III Birinci İplikli Sentez SuperMix</td></tr><tr><td>Nükleik Asit Jel Leke</td><td>Yaşam Teknolojileri Holdings Pte Ltd</td><td>S11494</td><td>SYBR ALTIN NÜKLEIK ASIT 500 UL</td></tr><tr><td>T4 Polinükleotid Kinaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>Son onarım enzimi</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligaz 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td>Enzim için yakınlık ligasyonu</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligaz 2, kesilmiş KQ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0373L</td><td>Adaptör ligasyonu için enzim</td></tr><tr><td>Temed</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td>TBE Üre jel bileşeni</td></tr><tr><td>Guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>15596018</td><td>TRIzol&reg; RNA ekstraksiyonu için reaktif</td></tr><tr><td>Urea</td><td>First BASE</td><td>BIO-2070-5kg&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>UV çapraz bağlayıcı</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>UV Stratalinker 1800</td></tr><tr><td>UV Transilluminator</td><td>UVP</td><td>95-0417-01</td><td>Bantların görselleştirilmesi için</td></tr><tr><td>Xylene Cyanol FF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr><tr><td>DNA temizleme</td><td>Zymo Research&nbsp;</td><td>D4004</td><td>Zymo DNA yoğunlaştırıcı-5&nbsp;</td></tr><tr><td>Gerekli yazılımların listesi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastQC yazılımı</td><td>0.11.4</td><td>http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td><td></td></tr> <tr><td>SeqPrep yazılımı</td><td>1.0.7</td><td>https://github.com/jstjohn/SeqPrep</td><td></td></tr><tr><td>BWA yazılımı</td><td>0.7.12</td><td>http://bio-bwa.sourceforge.net/</td><td></td></tr> <tr><td>SAMTOOLS yazılımı</td><td>1.2.1</td><td>http://www.htslib.org/</td><td></td></tr> <tr><td>PULLSEQ yazılımı</td><td>1.0.2</td><td>https://github.com/bcthomas/pullseq</td><td></td></tr><tr><td>STAR yazılımı</td><td>2.5.0c</td><td>https://github.com/alexdobin/STAR</td><td></td></tr><tr><td>rem_dups.py PYTHON komut dosyası</td><td>PYTHON 2.7.11</td><td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</td><td></td></tr><tr><td>find_chimeras.py PYTHON komut dosyası</td><td>PYTHON 2.7.11</td><td></td><td></td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</tr><tr><td>pickJunctionReads.awk AWK komut dosyası</td><td>AWK GNU 4.1.2</td><td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Tampon bileşimi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elution tamponu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.3 M sodyum asetat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>< güçlü>Lizis Tamponu</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 7.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%1 SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boncukları</td><td></td><td></td><td></td> yıkarken hariç<kullanmadan önce daima taze Superase-in</tr> <tr><td>ekleyingüçlü>Proteinaz K Tamponu&nbsp; </güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-Cl pH 7.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%0.5 SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Hibridizasyon Tamponu</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>750 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%1 SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 7.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%15 formamid (karanlıkta 4 ° C'de saklayın; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Kullanmadan</td><td></td><td></td><td></td> önce daima taze Superase-in ekleyin</tr><tr><td><güçlü>2x SSC Yıkama Tamponu< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x NaCl ve Sodyum sitrat (SSC) (20x SSC Invitrogen stoğundan seyreltilmiş)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>% 0.5 SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>2x RNA parçalanma tamponu< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mM MgCl<alt>2</alt></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>450 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 mM Tris-Cl pH 8.3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>2x RNA yükleme Boya</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% Formamid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%0.02 SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%0.02 bromofenol mavisi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>% 0.01 Ksilen Siyanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">3' RNA adaptör dizisi: 
5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC</td></tr><tr><td colspan="4">RT astar sırası: 
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAGTGTAGATCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG</td></tr></tbody></table>

rna-rna etkileşmelerini biyotinlenmiş psooren kullanarak küresel olarak haritalama

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

RNA&#39;ların kendileriyle ve diğerleriyle nasıl etkileşime girdiğini bilmek, hücredeki RNA esaslı gen düzenlenişini anlamanın anahtarıdır. MikroRNA-mRNA etkileşimleri gibi RNA-RNA etkileşimlerinin örneklerinin gen ekspresyonunu düzenlediği gösterilmiş olsa da, RNA etkileşimlerinin hücrede oluştuğu tam olarak bilinmemektedir. RNA etkileşimlerini incelemek için önceki yöntemler, öncelikle belirli bir protein veya RNA türü ile etkileşime giren RNA altkümelerine odaklanmıştır. Burada, RNA etkileşimlerini in vivo olarak tarafsız bir şekilde yakalamaya yarayan P soralen çapraz bağlanmış, L ve S seçilmiş H zincirlerine (SPLASH) denk gelen bir yöntem ayrıntılı. SPLASH, intramoleküler ve moleküller arası RNA baz eşleştirme partnerlerini küresel olarak tanımlamak için, in vivo çapraz bağlama, yakınlık ligasyonu ve yüksek verimli sıralama kullanmaktadır. SPLASH bakteri, maya ve insan hücreleri de dahil olmak üzere farklı organizmalara uygulanabilir.Farklı hücresel bağlamlarda RNA organizasyon dinamikleri anlayışını kolaylaştırmak için çeşitli hücresel koşullar. Tüm deneysel SPLASH protokolünün tamamlanması yaklaşık 5 gün sürer ve hesaplama iş akışının tamamlanması yaklaşık 7 gün sürer.

Şekil 1 SPLASH iş akışının şemasını göstermektedir. % 0.01&#39;lik digitonin varlığında biotinile psoralen ilavesi üzerine ve UV çapraz bağlama, toplam RNA hücrelerden çıkarılır ve RNA&#39;ya biotinlenmiş çapraz bağlanmanın etkin bir şekilde gerçekleştiğinden emin olmak için bir nokta blot yapılır ( Şekil 2 ). Hücrelere eklenecek biyotinile psoralen miktarını titre etmek için pozitif kontroller olarak biyotinlenmiş 20 baz oligol...

Burada, intramoleküler ve molekül içi RNA-RNA etkileşimlerinin in vivo genom geneli haritalamasını mümkün kılan P soralen çapraz bağlanmış, L ve s seçilmiş H zincirlerinin (SPLASH) eşitliğinin yöntemini ayrıntılı olarak açıklıyoruz. SPLASH maya, bakteri ve insanlar dahil olmak üzere organizmaların RNA etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir.

RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Bu videonun genel amacı, çiftli in vivo RNA-RNA etkileşimlerinin genom genelinde haritalandırıldığı psoralen çapraz bağlı ligasyonlu ve seçilmiş hibritlerin dizilenmesi (SPLASH) yöntemini açıklamaktır. Bu teknik, in vivo RNA etkileşimlerini haritalandırmak için basit ve yüksek kapasiteli bir yöntemdir. Bu yöntem, tek bir RNA zinciri boyunca veya farklı RNA zincirleri arasındaki farklı bölgelerin birbirleriyle nasıl etkileşime girdiği gibi RNA genomikleri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu yöntem maya ve insan hücreleri hakkında bilgiler sağlayabilse de, bakteriler ve hücre içi membranlar da dahil olmak üzere diğer modern organizmalarla yapılan çalışmalara da uygulanabilir. Bu yöntemle ilgili fikri ilk kez moleküler etkileşimleri haritalamanın bir yolunu bulmak istediğimizde geliştirdik. Aşağıdaki prosedürün birkaç durdurma noktası içerdiğini unutmayın.Bu aşamalarda, deney kısa süreliğine veya süresiz olarak durdurulabilir. Ayrıntılar ek metinde bulunabilir. Bu prosedüre, HeLa hücrelerini beş mililitre PBS ile iki kez yıkayarak başlayın.Fazla PBS'nin tamamen süzülmesi için kabı bir dakika boyunca dikey konumda tutun. Ardından, hücre geçirgenliğini artıran 200 micromolar biyotinli psoralen ve %0,01 digitonin içeren bir mililitre PBS ekleyin. Çözeltiyi hücre yüzeyine eşit şekilde eklemeye özen gösterin.37 °C'de beş dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, kabın kapağını çıkarın ve UV Crosslinker içerisinde, UV lambasından üç santimetre uzağa, buz üzerine yerleştirin. 365 nanometre UV ile 20 dakika boyunca ışınlayın.20 dakika sonra, kabı Crosslinker'dan çıkarın; ardından ekteki belgedeki talimatlara uygun olarak HeLa hücrelerinden fragman izolasyonu yapın ve RNA'yı çöktürün. Denatüre edilmiş marker ve RNA örneklerini 8,6 cm kare boyutundaki %6 TBE-üre jeline yükleyin. 180 volt değerinde 40 dakika boyunca elektroforez yaparak boyut fraksiyonlaması gerçekleştirin.Jeli, 1:10.000 oranında seyreltilmiş nükleik asit jel boyası içeren 10 mililitre TBE tamponu içerisinde, karanlıkta beş dakika boyunca boyayın. Jel boyanırken, temiz bir 0,6 mililitre mikrosantrifüj tüpünün alt kısmını 24 gauge bir iğne ile delin. Bunu iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünün içine yerleştirin.Bir transilüminatör kullanarak, boyama sonrası jeldeki bantları görselleştirin ve 90 ila 110 nükleotide karşılık gelen bir jel dilimi kesin. Jel dilimini, iki mililitrelik mikrosantrifüj tüpü içindeki delikli 0,6 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Boyut seçimi, kimera fragmanlar için minimum uzunluğu belirlememize ve daha sonra ligasyon ürünleri ile ligasyon gerçekleşmemiş ürünleri birbirinden ayırt etmemize olanak tanır.Jel dilimini parçalamak ve 2 mL'lik mikrofüj tüpünde toplamak için oda sıcaklığında, 12,000 ×g hızında iki dakika boyunca santrifüjleyin. Döndürme işleminden sonra, boş 0,6 mL'lik mikrofüj tüpünü atın. Parçalanmış jel dilimine 700 µL elüsyon tamponu ekleyin.Numunelerin tampona difüzyonunu sağlamak için sürekli rotasyonla dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Jel dilimlerini ve elüsyon tamponunu bir santrifüj tüpü filtresine aktarın ve 20.000 ×g hızında 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, jel dilimleri filtrenin üst bölmesinde kalacaktır ve bu bölme atılabilir.Eşlik eden belgede açıklandığı şekilde RNA'yı çöktürün ve miktarını belirleyin. RNA'yı, kullanılana kadar sıvı azot içinde minus 80 degrees Celsius'ta hızlıca dondurun ve saklayın. RNA çapraz bağlama bölgelerini zenginleştirmek için, bir mikrofüj tüpündeki streptavidin kaplı manyetik boncukları yıkamak amacıyla, RNase inhibitörü içeren 100 microliters lizis tamponu ekleyerek başlayın.15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne, iki mililitre taze hazırlanmış hibridizasyon tamponu, bir mililitre takviye edilmiş lizis tamponu, 1,5 mikrogram boyut fraksiyone RNA ve 100 mikrolitre resüspande boncuk ekleyin. Tüpü hafifçe vorteksleyin. Uçtan uca rotasyon ile 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.İnkübasyonun ardından, boncukları önceden ısıtılmış yıkama tamponu ile beş kez yıkayın. Beşinci yıkamanın sonunda, boncukları içeren mikrofüj tüpünü bir dakika boyunca mıknatıslı standa yerleştirin ve ardından yıkama tamponunu uzaklaştırın. Yıkanmış boncuklara bir mililitre soğuk T4 polinükleotid kinaz tamponu ekleyin.Boncukları dört °C'de beş dakika boyunca uçtan uca rotasyonla inkübe edin. Boncukları içeren mikrofüj tüpünü manyetik şeridin üzerine yerleştirin. Bir dakika sonra, tamponu nazikçe uzaklaştırın.Bu adımı toplam iki yıkama olacak şekilde tekrarlayın ve son yıkamadan sonra tamponu uzaklaştırın. Ardından, 5' ve 3' uçlarını ligasyonla uyumlu hale getirmek için beraberindeki belgede yer alan talimatları izleyin ve yakınlık ligasyonunu gerçekleştirin. Bir yıkamanın ardından, boncuklara 100 µL RNA PK tamponu ekleyin ve pipetle yukarı aşağı çekerek yeniden süspande edin.Numuneleri bir ısıtma bloğunda 95 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın. Ardından, numuneyi buz üzerinde bir dakika boyunca soğutun. Numuneye 500 µL guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform ekleyin.10 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde vorteksleyerek karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, küçük RNA'ların bile tutulduğundan emin olarak RNA'yı çöktürmek, temizlemek ve geri kazanmak için bir kit kullanın.RNA'yı 100 µL nükleaz içermeyen su ile elüe edin. Elüe edilen örneklerden 100 µL'yi buz üzerindeki bir 24 kuyucuklu plakadaki kuyucuğa aktarın. Örneği buz üzerinde tutarak, 254 nm dalga boyunda beş dakika boyunca UV ışınlamasına tabi tutun.Ters çapraz bağlanan örneği temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 10 µL sodyum asetat, 1 µL glikojen ve 300 µL %100 etanol ekleyin. RNA'yı -20 °C'de en az bir saat boyunca çöktürün.RNA'yı geri kazanmak için, çöktürülmüş RNA'yı 4 °C'de 30 dakika boyunca 20,000 ×g'de santrifüjleyin. Döngünün ardından süpernatantı uzaklaştırın ve RNA peletini yıkamak için 1 mL %70 soğuk etanol ekleyin. Yıkanmış peleti 4 °C'de 15 dakika boyunca 20,000 ×g'de santrifüjleyin.Yıkama tamponunu uzaklaştırın ve RNA'yı yeniden süspande etmek için 4,25 µL nükleaz içermeyen su ekleyin. RNA'yı 0,2 mL'lik bir PCR tüpüne aktarın. Son olarak, ekteki belgede yer alan talimatlara uygun olarak cDNA'yı ters transkripsiyonla sentezleyin, daireselleştirin ve amplifiye edin.Bu şema SPLASH iş akışını göstermektedir. %0,01 digitonin varlığında biyotinlenmiş psoralen eklenmesi ve UV çapraz bağlama işleminin ardından, hücrelerden toplam RNA ekstrakte edilir ve çapraz bağlamanın verimli olduğunu doğrulamak için dot blot uygulanır. Ardından, yaklaşık her 150 bazdan birinin çapraz bağlandığı şekilde, hücrelere eklenecek biyotinlenmiş psoralen miktarını titre etmek için biyotinlenmiş 20 bazlık oligolar pozitif kontrol olarak kullanılır.Ardından, derin sekanslama için gereken minimum döngü sayısını belirlemek amacıyla, artan sayıda PCR döngüsü kullanılarak küçük ölçekli PCR amplifikasyonu gerçekleştirilir. Verimli bir kütüphane hazırlama sürecinde, bir cDNA sekanslama kütüphanesi, 1.5 µg boyut seçimli RNA girdisinden 15 PCR amplifikasyon döngüsünden daha azında amplifiye edilebilir. Kütüphane daha sonra, yüksek kapasiteli bir sekanslama cihazında iki adet 150 baz çiftlik okuma (read) kullanılarak sekanslanır.Ardından dizileme okumaları, hesaplama hattına göre işlenir. Nihai sonuç, transkriptomdaki hem intramoleküler hem de intermoleküler RNA-RNA etkileşimlerini içeren filtrelenmiş kimera etkileşimlerin bir listesidir. Bu prosedür uygulanırken, SPLASH yöntemi yeni organizmalar üzerinde kullanıldığında biyotinlenmiş psoralen inklüzyonunun kontrol edilmesinin önemli olduğu unutulmamalıdır.Geliştirilmesinin ardından bu teknik, RNA biyolojisi alanındaki araştırmacıların farklı organizmalardaki RNA etkileşimlerini incelemesinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, hücredeki çiftli RNA etkileşimlerini küresel olarak yakalayan bir sekanslama kütüphanesinin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

mapping-rna-rna-interactions-globally-using-biotinylated-psoralen

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

RNA transkript trans etkili RNA bağlayıcı proteinler (RBPs) çok sayıda aracılığı ile geniş posttranskripsiyonel düzenlemeye tabidir. Burada hassas ve transcriptome geniş bir ölçekte RBPs, RNA bağlayıcı siteleri tanımlamak için genellenememektedir bir yöntem mevcut.

PAR-Klip - RNA Cilt Proteinler Transcriptome geniş Cilt Siteleri Belirlemek Amacıyla Bir Yöntem

RNA-protein etkileşimleri birçok hücresel sürecin merkezinde yer alır. Burada, spesifik RNA'yı izole etmek ve onunla ilişkili yeni proteinleri tanımlamak için in vivo bir yöntemi açıklıyoruz. Bu, RNA'ların hücrede nasıl düzenlendiğine yeni bir ışık tutabilir.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

Lazerler sıklıkla DNA hasarına hücre tepkisinin çalışmada kullanılır. Bununla birlikte, normal koşullar altında, aralık, sıklık, ve çarpışmalar çoğaltma çatal nadiren karakterize lezyonlar üretir. Burada, lazer lokalize kol içi çapraz bağlar ile bu parametrelerin belirlenmesini sağlayan bir yaklaşım açıklar.

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

Biz RNA bağlanıcı proteinler tanımlamak ve kendi RNA bağlayıcı bölgeleri UV-aracılı photocrosslinking ve kütle spektrometresi kullanılarak canlı hücrelerdeki eşlemek için bir protokol tanımlamak.

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA'ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Her iki kodlama ve kodlamayan bağlayıcı proteinler tanımlamak için tıklatın Kimya destekli RNA-interactome yakalama (CARIC) strateji uygulamak için detaylı bir protokol RNA'ların sunulur.

Yakalama ve tıklama Kimya destekli RNA-interactome kullanarak RNA bağlanıcı proteinler tanımlaması (CARIC) strateji yakalama

RNA/protein kompleksleri Botin-streptavidin strateji kullanarak saf ve daha fazla fonksiyonel analiz için uygun olmayan bir biçimde denaturing koşullarda çözüm için eluted. Burada, yerel ve tamamen işlevsel RNA/protein kompleksleri verimli bir fotoğraf yarilabilir bağlayıcı RNA ve nazik bir UV-elüsyon adım kullanır bu stratejinin bir değişiklik açıklar.

Tek adım arıtma RNA bağlı Biotin ve fotoğraf yarilabilir bir bağlayıcı kullanarak makromoleküllerin kompleksleri

Burada, sadece kısa sentetik DNA ve RNA oligonükleotides ve arıtılmış pol II gerektiren RNA polimeraz II (pol II) uzama kompleklerinin montajını tarif ediyoruz. Bu kompleksleri, Pol II uzama kompleksi ile ilişkili transkriptlerin Co-transcriptional işleme temel mekanizmaları eğitim için yararlıdır.

Diseksiyon eş transkripsiyon RNA Işleme etkinlikleri için suni RNA polimeraz II uzama kompleksler

Burada sunulan, protein-nüklik asit etkileşimlerini incelemek için yaygın olarak uygulanabilir olan biotin etiketlerini kullanarak in vitro biyokimyasal kurallara yönelik protokollerdir.

Protein-Nüklik asit etkileşimlerini Incelemek için biotin etiketlerini kullanarak In vitro biyokimyasal asder

Burada, insan hücrelerinden toplam protein ekstraktını, biyotinile RNA ile kaplanmış streptavidin boncuklarını ve kütle spektrometri analizini kullanarak, spesifik RNA dizilerinin protein interaktörlerini ortaya çıkarmak, ölçmek ve doğrulamak için optimize edilmiş bir in vitro yöntem sunuyoruz.

Kısa Biyotinile RNA Kullanan RNA Bağlayıcı Proteinlerin Optimize Edilmiş Kantitatif Aşağı Çekme Analizi

Öğrenin, SPLASH yöntemiyle biyotinlenmiş psoralen kullanarak RNA-RNA etkileşimlerini genom çapında nasıl haritalayacağınızı. Bu teknik maya, bakteri ve insan hücrelerinde yüksek verimli in vivo etkileşim analizi sağlar.

RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Daha fazla video keşfet