RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Bu videonun genel amacı, çift olarak in vivo RNA-RNA etkileşimlerinin genom çapında bir şekilde haritalandığı psoralen, çapraz bağlı, bağlanmış ve seçilmiş hibritlerin veya SPLASH'ın dizileme yöntemini tanımlamaktır. Bu teknik, RNA etkileşimini in vivo olarak haritalamak için basit, yüksek verimli bir yöntemdir. Bu yöntem, tek bir RNA ipliği boyunca veya farklı RNA iplikleri arasındaki farklı bölgelerin birbirleriyle nasıl etkileşime girdiği gibi RNA genomiği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu yöntem maya ve insan hücreleri hakkında bilgi sağlayabilse de, hücrelerdeki bakteri ve zar dahil olmak üzere diğer modern organizmalarda yapılan çalışmalara da uygulanabilir. Bu yöntem için ilk olarak, etkileşimi moleküler olarak haritalamanın bir yolunu bulmak istediğimizde aklımıza geldi. Aşağıdaki yordamın birkaç durma noktası içerdiğini unutmayın.

Bu zamanlarda, deney kısa veya süresiz olarak duraklatılabilir. Ayrıntılar ekteki metinde bulunabilir. HeLa hücrelerini beş mililitre PBS ile iki kez yıkayarak bu işleme başlayın.

Fazla PBS'yi tamamen boşaltmak için tabağı bir dakika dikey olarak yerleştirin. Daha sonra, hücre geçirgenliğini artıran 200 mikromolar biyotinile psoralen ve% 0.01 digitonin içeren bir mililitre PBS ekleyin. Çözeltiyi hücrelerin yüzeyine eşit şekilde eklemeye özen gösterin.

37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tabağın kapağını çıkarın ve UV ampulünden üç santimetre uzakta bir UV Çapraz Bağlayıcı içindeki buzun üzerine yerleştirin. 365 nanometre UV ile 20 dakika ışınlayın.

20 dakika sonra, çanağı Çapraz Bağlayıcıdan çıkarın ve ardından parçayı izole edin ve RNA'yı ekteki belgedeki talimatlara göre HeLa hücrelerinden çökeltin. Denatüre merdiven ve RNA örneklerini 8,6 santimetre karelik% 6 TBE-üre jeline yükleyin. Boyut 40 dakika boyunca 180 voltta elektroforez ile fraksiyonel.

Jeli, karanlıkta beş dakika boyunca 1: 10, 000 seyreltilmiş nükleik asit jel lekesi içeren 10 mililitre TBE tamponunda boyayın. Jel boyanırken, altta 0,6 mililitrelik temiz bir mikrofüj tüpünü delmek için 24 gauge bir iğne kullanın. İki mililitrelik bir mikrofüj tüpüne yerleştirin.

Bir transilluminatör kullanarak, lekelenme sonrası jel üzerindeki bantları görselleştirin ve 90 ila 110 nükleotidlere karşılık gelen bir jel dilimi kesin. Jel dilimini iki mililitrelik mikrofüj tüpündeki delinmiş 0.6 mililitrelik mikrofüj tüpüne aktarın. Boyut seçimi, kimerik fragmanlar için minimum uzunluğu ayarlamamıza ve daha sonra bağlanmış ürünler ile bağlanmamış ürünler arasında ayrım yapmamıza olanak tanır.

Jel dilimlerini parçalamak ve iki mililitrelik mikrofüj tüpünde toplamak için jel dilimlerini oda sıcaklığında 12.000 kez g sıcaklıkta iki dakika santrifüjleyin. Sıkma işleminden sonra boş 0,6 mililitrelik mikrofüj tüpünü atın. Rendelenmiş jel dilimine 700 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin.

Numunelerin tampona difüzyonuna izin vermek için sabit dönüşle gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Jel dilimlerini ve elüsyon tamponunu bir santrifüj tüpü filtresine aktarın ve 20 dakika boyunca 20.000 kez g'de santrifüjleyin. Sıkma işleminden sonra, jel dilimleri filtrenin üst bölmesinde sıkışacak ve atılabilecektir.

RNA'yı ekteki belgede açıklandığı gibi çökeltin ve nicelleştirin. RNA'yı flaş dondurun ve eksi 80 santigrat derecede kullanılana kadar sıvı nitrojen içinde saklayın. RNA çapraz bağlama bölgelerini zenginleştirmek için, streptavidin kaplı manyetik boncukları bir mikrofüj tüpünde yıkamak için RNase inhibitörü içeren 100 mikrolitre lizis tamponu ekleyerek başlayın.

15 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne, iki mililitre taze hazırlanmış hibridizasyon tamponu, bir mililitre takviye edilmiş lizis tamponu, 1.5 mikrogram boyutta fraksiyonlu RNA ve 100 mikrolitre yeniden askıya alınmış boncuk ekleyin. Tüpü nazikçe girdaplayın. Uçtan uca rotasyon ile 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, boncukları önceden ısıtılmış yıkama tamponu ile beş kez yıkayın. Beşinci yıkamanın sonunda, boncukları içeren mikrofüj tüpünü bir dakika boyunca mıknatıs standına yerleştirin ve ardından yıkama tamponunu çıkarın. Yıkanmış boncuklara bir mililitre soğuk T4 polinükleotid kinaz tamponu ekleyin.

Boncukları uçtan uca döndürme ile dört santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Boncukları içeren mikrofüj tüpünü manyetik şerit üzerine yerleştirin. Bir dakika sonra tamponu yavaşça çıkarın.

Bu adımı toplam iki yıkama için tekrarlayın ve son yıkamadan sonra tamponu çıkarın. Ardından, beş asal ve üç asal ucu ligasyonla uyumlu hale getirmek ve yakınlık ligasyonunu gerçekleştirmek için ekteki belgedeki talimatları izleyin. Yıkamadan sonra, boncuklara 100 mikrolitre RNA PK tamponu ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.

Numuneleri bir ısı bloğu üzerinde 95 santigrat derecede 10 dakika ısıtın. Ardından, numuneyi bir dakika buz üzerinde soğutun. Numuneye 500 mikrolitre guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform ekleyin.

10 saniye kuvvetlice girdap yaparak karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, RNA'yı çökeltmek, temizlemek ve geri kazanmak için bir kit kullanın, küçük RNA'ların bile tutulduğundan emin olun.

RNA'yı 100 mikrolitre nükleaz içermeyen suda elute edin. Ayrıştırılan numunelerin 100 mikrolitresini güzel bir şekilde 24 oyuklu bir plakanın kuyusuna aktarın. Numuneyi buz üzerinde tutarak, beş dakika boyunca 254 nanometrede UV ışınlayın.

Ters çapraz bağlı numuneyi temiz bir mikrofüj tüpüne aktarın. 10 mikrolitre sodyum asetat, bir mikrolitre glikojen ve 300 mikrolitre %100 etanol ekleyin. RNA'yı eksi 20 santigrat derecede en az bir saat çökeltin.

RNA'yı geri kazanmak için, çökeltilmiş RNA'yı dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 20.000 kez g'de santrifüjleyin. Döndürmeden sonra, süpernatanı çıkarın ve RNA peletini yıkamak için bir mililitre% 70 soğuk etanol ekleyin. Yıkanmış peleti dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 20.000 kez g'de santrifüjleyin.

Yıkama tamponunu çıkarın ve RNA'yı yeniden süspanse etmek için 4.25 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. RNA'yı 0.2 mililitrelik bir PCR tüpüne aktarın. Son olarak, cDNA'yı ekteki belgedeki talimatlara göre ters yazıya dökün, dairesel hale getirin ve çoğaltın.

Bu şema SPLASH iş akışını gösterir. % 0.01 digitonin ve UV çapraz bağlama varlığında biyotinile psoralen ilavesi üzerine, hücrelerden toplam RNA ekstrakte edilir ve çapraz bağlamanın verimli olmasını sağlamak için bir nokta lekesi gerçekleştirilir. Biyotinile edilmiş 20 baz oligoları daha sonra hücrelere eklenecek biyotinile psoralen miktarını titre etmek için pozitif kontroller olarak kullanılır, böylece her 150 bazdan biri çapraz bağlanır.

Küçük ölçekli PCR amplifikasyonu daha sonra derin dizileme için gereken minimum döngü sayısını belirlemek için artan sayıda PCR döngüsü kullanılarak gerçekleştirilir. Verimli bir kütüphane hazırlama sürecinde, bir cDNA dizileme kütüphanesi, 15 döngüden daha az PCR amplifikasyonunda 1.5 mikrogram boyutunda seçilen bir RNA girişinden amplifiye edilebilir. Kitaplık daha sonra yüksek bir sıralama makinesinde iki adet 150 baz çifti okuması kullanılarak sıralanır.

Sıralama okumaları daha sonra hesaplama ardışık düzenine göre işlenir. Sonuç, transkriptomda hem molekül içi hem de moleküller arası RNA-RNA etkileşimlerini içeren filtrelenmiş kimerik etkileşimlerin bir listesidir. Bu prosedürü denerken, yeni organizmalarda SPLASH kullanırken biyotinile psoralen katılımını kontrol etmeyi unutmamak önemlidir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, RNA biyolojisi alanındaki araştırmacıların çeşitli organizmalardaki RNA etkileşimlerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, hücrede küresel olarak çift RNA etkileşimlerini yakalayan bir dizileme kitaplığının nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.