Name: Rutin İmmünositokimyasal Karakterizasyonu için serum serbest şartlar İnsan iPSCs küçük ölçekli Yayılım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Öğrenin, insan iPSCs'lerinin küçük ölçekli yayılımını ve immünositokimyasal karakterizasyonunu. Bu yöntem, kök hücre araştırmalarında zaman ve maliyet tasarrufu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansman Kaynakları: Arizona Üniversitesi, Jim Himelic Vakfı ve Arizona Karmaşık Hastalıkların Biyolojisi Merkezi.

hiPSCs 4 mm deri delici biyopsilerinden izole edilmiş ve Sendai virüsü aracılı yeniden programlama 11 üzerinden ev yeniden programlanabilir, insan dermal fibroblastlarında elde edilmiştir. Arizona Kurumsal Değerlendirme Kurulu Üniversitesi konusu işe alınması ve biyopsi toplanması için tüm prosedürleri onayladı. iPSC Kültür Ekstraselüler Matriks Kaplı Yüzey 1. Hazırlık <ol><li> Bir gün önce iMEFs üzerinde büyüyen hiPSC kültürlerin izdiham, hücre dışı matriks (Matrigel) kaplı plakaları hazırlamak. </li><li> Yavaş çözülme ekstraselüler matriksin bir kısım 2 saat boyunca 4 ° C buz üzerinde (bağımlı sürü özellikler sayfasında talimatları izleyin). </li><li> Bir biyo-güvenlik kaput, soğuk pipet uçları kullanılarak (DMEM / F12 / HEPES) çok özel bir seyreltme faktörüne göre, soğuk Dulbecco Modifiye Eagle ortamı / besin karışımı F-12 hücre dışı matrisin 1 kısım ekleyin (-20 ° C&#39;de saklanan) . </li><li> Dağıtın ~ 60081; her bir yeni hücre kültürü oyuk başına hücre dışı matrisin L 12-çukurlu plaka gerekli işlemden geçirildi. </li><li> Birkaç saat süreyle oda sıcaklığında inkübe plakası. Burada, 3H inkübasyon süresi kullanın. Not: Plakalar hemen kullanılabilir veya iki haftaya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> Yayma Ekstraselüler Matrix üzerine IMEF Besleyici Hücreleri Yetiştirilen hiPSCs 2. Transferi <ol><li> pasajlarının günde, 4 ° C ila matris kaplı plaka kaldırmak ve plaka, doku kültürü kaputu 1 saat boyunca oda sıcaklığına gelmesini sağlar. </li><li> iMEFs büyüyen hiPSC kültür 6 oyuklu plaka 1 kuyusundan orta aspire 500 uL kolajenaz ayrılma maddesi ile yerine (1 mg / bazal kültür ortamı içinde ml). </li><li> iPSC koloni kenarları hafif asansör görünene kadar 30 dakika - ~ 10 boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. NOT: İnkübasyon süresi çizgisi bağlıdır ve değişecektir. Bir mikroskop altında ayrışmasını izleyin. </li><li> arabaefully ayrılma reaktif aspire ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS, pH 7.4) ile yavaşça 2 kez yıkayın. </li><li> de 10 ng / ml Rho-ilişkili protein kinaz önleyicisi (Y-27632 ROCK inhibitörü) ile oda sıcaklığı mTeSR1 tam orta 1 ml. Not: Bu, ilk geçişi sırasında IMEF durumunu orta ve mTeSR1 50:50 karışımı kullanılarak önerilmektedir, bu ortam geçiş sırasında hiPSCs devamı için yararlı olabilir. </li><li> El skor ve 1 pick kaput içinde kısmen yerleştirilen küçük bir faz kontrast mikroskop kullanarak - 2 hiPSC koloniler (~ 700 - çapı 1.000 mm) bir şırınga ve iğne (25 G, 1½ içinde) ile. P200 pipet ucu ile ortama koloni attı adet kapalı itin. </li><li> Aspire kaplama rahatsız etmemek için dikkatli olmak, yeni plakadan matris imha ve. </li><li> Eski iyi iyi kaplı yeni matris içine attı iPSCs içeren hücre süspansiyonu transferi 1 ml. </li><li> Pla37 ° C&#39;de inkübatör içinde plaka Ce,% 5 CO2. birkaç hızlı geri ve ileri-plaka Kaya ve yan-yan hareketleri eşit hücreleri yaymak için. 24 saat süreyle plaka rahatsız etmeyin. </li><li> mTeSR1 tam ortam (Y-27632 ROCK-önleyici maddesinin ilave adım 2.5 sonra ilk kaplama gerekli değildir) günlük tam ortam değişiklikleri gerçekleştirme. </li></ol> Matris kaplanmış plakalar üzerinde hiPSCs 3. Küçük ölçekli pasaj Not: Genellikle kaplanmış plakalar matris hiPSCs ilk transferinden sonra, hücreler her iMEFs elimine edilmiştir ve hücreler koşulları içermeyen besleyici adapte emin olmak için, benzer bir şekilde bir kez daha geçirilmiştir edilmelidir. <ol><li> 1. bölümde tartışıldığı gibi önce iPSC confluency Bir gün taze matris plakaları kaplı hazırlamak. </li><li> geçidin günde, 4 ° C inkübasyon matris kaplı plaka kaldırmak ve plaka, doku, Cul, 1 saat boyunca oda sıcaklığına gelmesini sağlarTure kukuleta. </li><li> (Orjinal matris besleyiciden geçiş) hiPSCs bir 6-yuvalı plaka 1 kuyusundan orta aspire ve 500 uL hücre ayrışma tamponu ile değiştirin. Not: Burada kullanılan ticari bir hücre ayırma tamponu (Malzeme Tablo) kolajenaz ile karşılaştırıldığında mTeSR1 ortamı ile kullanım için daha uygundur. </li><li> iPSC koloni kenarları hafif asansör görünene kadar, 7 dakika - 3, oda sıcaklığında inkübe edilir. Daha önce belirtildiği gibi, kuluçkalama süresi hattı bağımlı ve değişkendir. Bu nedenle, optimal zamanı belirlemek için bir mikroskop altında hücre ayrışma izler. </li><li> Dikkatle ayrışma tampon aspire ve PBS ile hafifçe 2 kez yıkayın. </li><li> de 10 ng / ml-Y-27632 ROCK önleyicisi ile oda sıcaklığı mTeSR1 tam orta 500 uL ekleyin. </li><li> Bunun yerine Adım 2.6 gibi puanlama kolonilerinin, P200 ucunu kullanarak ortama kolonilerin istenilen sayıda itin ve yavaşça hücre süspansiyonu 2 kez ag çiğnemekboyutunda 200 mikron - Kuyunun bir köşesi ~ 50 kümeleri içine hiPSC kolonileri kırmak için ainst. Her 1 yeni kuyunun içine aktarmak için 2 koloni - örneğin, bir 12 plaka için, 1 seçin. de 12 oyuklu bir plakanın yeni tek bir kuyuya eski hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Birkaç hızlı geri ve ileri-plaka Kaya ve yan-yan hareketleri eşit hücreleri yaymak için, ve 37 ° C,% 5 CO 2 inkübatör 24 saat süreyle plaka dinlendirin. </li><li> mTeSR1 tam orta günlük tam bir medya değişiklikleri gerçekleştirmek. Daha önce de belirtildiği gibi, ilk kaplama sonrası Y-27632 ROCK İnhibitörü eklemek gerekli değildir. NOT: Adım 3.7 Kullanılmayan iPSC kolonileri bu noktada kolaylıkla donduruldu olabilir. </li></ol> Immünsitokimya hiPSCs ve Yayımlamak için Odası Slaytlar ve lameller 4. hazırlanması NOT: Aşağıdaki protokol 4-iyi plastik hazne slaytlar ve appropriat ile 12 mm cam lamelleri kullanırÇoklu kuyularda medya e hacimleri düşük maliyetli immünsitokimya desteklemek. daha iyi ve kapak boyutları istenensonuçları Ancak, ortam hacmi arttırılabilir. <ol><li> Bir gün hiPSC izdiham önce, yeterli matris çözümü bölüm 1&#39;de tartışıldığı gibi taze ekstrasellüler matriks ile kaplı odası slaytlar hazırlamak ekle (~ 300 - 4-iyi bir oda slayt oyuk başına 500 uL) herhangi bir kaygı olmadan iyi tam kat, her buharlaşma. Seçenek olarak ise, 500 uL, her bir 24 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu, kat halinde hücre dışı matrisi 1 temizlenmesi ve sterilize lamel yerleştirilmesi ve örtücü cam, çözelti üstünde yüzen olmadığından emin olun sonra. </li><li> geçidin günde, 4 ° C ila kaplanmış bölmeli lamlar / lamelleri çıkarın ve doku kültürü kaputu 1 saat oda sıcaklığında aklimasyonundan sağlar. </li><li> hiPSCs bir 12 oyuklu plaka 1 kuyusundan orta aspire 500 uL ayrılma tamponu ile değiştirin. </li><li> Oda tempe inkübe~ 3 rature - 7 dakika iPSC kolonilerinin kenarları hafifçe kaldırın görünene kadar. </li><li> Dikkatle ayrılma tampon aspire ve de 10 ng / ml-Y-27632 ROCK önleyici ile oda sıcaklığı mTeSR1 tam orta 1 ml. </li><li> elle 4-iyi odasının slayt ya da 1 yeni lamel 1 koloni / Yeni bir kuyu pick doku kültürü kaputu içine yerleştirilen küçük bir faz kontrast mikroskop kullanarak kaplama için (~ 1000 - çapı 1.500 mm) iterek P200 pipet ucu kullanılarak kapalı ortama plaka yüzeyi. </li><li> kaplama rahatsız etmemek için dikkatli olmak, yeni bölme slayt / lamel matrisi aspire. </li><li> boyutunda 200 mikron - Yavaşça ~ 50 kümeleri içine hücre süspansiyonu hiPSC koloniler kırmak için kuyunun bir köşesinde karşı 2 kez çiğnemek. iyi bir 4-iyi odasının slayt / lamel her yeni kuyunun içine eski hücre süspansiyonu 250 mcL aktarın. </li><li> iyi mTeSR1 cont ile 500 mcL kadar her yeni ses getirmek10 ng / ml-Y-27632 ROCK İnhibitörü Tahliye. </li><li> 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübatörde odası dia / lamelleri yerleştirin. </li><li> 24 saat sonra, tam bir ortamda mTeSR1 günlük tam ortam değişimleri gerçekleştirmek. Daha önce belirtildiği gibi, yine, Y-27632 ROCK-önleyici maddesinin ilave sonra ilk kaplama gerekli değildir. </li></ol> İmmünositokimya için iPSCs 5. hazırlanması <ol><li> Birleşmiş sonra, önceden ısıtılmış DİKKAT% 4 paraformaldehid kuyu ortamı çıkarılması ve eklenerek tespit ile hiPSC koloniler muhafaza (~ 300 uL / oyuk, 4 oyuklu oda slayt / lamel). 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> uygun kurumsal biohazard ve kimyasal güvenlik yönergelerine göre paraformaldehid atın. </li><li> PBS ile bir tezgah üstü bir karıştırıcı üzerinde her biri 5 dakika için hücreler 3 kez yıkayın. NOT: oda slaytlar üzerinde hücreler / lamelleri bu aşamada belirsiz 4 ° C&#39;de geniş bir PBS ile saklanabilir.Seçenek olarak ise, hemen ICC için kullanılabilir. </li></ol> Pluripotency belirteçlerinin ile hiPSCs 6. immün NOT: Standart Pluripotency antikorları ile immunostain hiPSCs. Bir örnek olarak, burada hücreler çift lekelenmiş aşağıda antikorlar, bir 1 yüzeye ve sıralı bir şekilde 1, hücre içi antijen hedefleme şunlardır: Anti-safha spesifik Embriyonik Antijen 4 (SSEA4) protein 4 (okt anti Oktamer bağlayıcı 4) ve anti-Tra-1-60 Anti-SRY HMG kutu genidir 2 (Sox2) ile () antikoru ayrıntılar için Materyaller Tablo bakınız. <ol><li> Kuyulardan PBS aspire ve Triton-X-100 olmadan 500 uL / ​​kuyu Engelleme Çözüm ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> Triton X-100 olmadan bloke etme çözeltisi içinde seyreltilmesi ile yüzey antikorların, SSEA4 ya TRA-1-60 ya: önceden belirlenmiş bir konsantrasyonda hazırlanması (200, burada 1 kullanın). <ol><li> oda slaytlar, bir 4-çukurlu oda slayt 300 uL / ​​oyuk hazırlanmasıYukarıdaki solüsyon ve anti-SSEA4 Tra-1-60 birincil antikor 1.5 ul Bloklama 298.5 uL karıştırılarak. </li><li> lamelleri için, Çözüm ve anti-SSEA4 veya Tra-1-60 birincil antikor 1 mcL Engelleme 199 uL karıştırılarak 40 mL / lamel hazırlar. </li></ol></li><li> kamara slayt Engelleme Çözüm aspire ve uygun kuyulara primer antikor dağıtmak. lamelleri için sıkıca bir Petri kabı içinde parafilm bir parça koyun ve bir damlacık olarak üst birincil antikor 40 mcL dağıtın. bükülmüş bir şırınga iğnesi ve forseps kullanarak, dikkatli bir şekilde iyi kültürün dışına lamel kaldırın ve parafilm üzerindeki antikor damla üzerine aşağıya doğru hücre tarafı yerleştirin. 4 ° C&#39;de bir gece boyunca inkübe edilir. </li><li> odası slayt antikorun uzaklaştırılması ve PBS içinde eklenerek 10 dakika her biri, - Ertesi sabah, hücreler 3 kez, 5 yıkayın. lamelleri için parafilm kapalı her biri kaldırın ve 24-plaka, hücre tarafı üste gelecek bir kuyuda geri koyun. Dikkatle P eklemekBS. </li><li> 1 de uygun ikincil antikor hazırlayın: 500 Engelleme Çözüm. <ol><li> oda slaytlar için hazırlamak 300 uL / ​​kuyu 4-iyi bir oda slayt anti-fare IgM Alexa Fluor keçi anti-fare IgG3 Alexa Fluor 488 (SSEA4 için) veya 1 uL keçi uL Engelleme Çözüm 499 uL karıştırma ve 1 ile 488 (Tra-1-60 için). </li><li> lamelleri için, bloklama çözeltisi 499 uL karıştırılarak 40 uL / ​​lamel hazırlayıp keçi 1 ul anti-fare IgG3 Alexa Fluor 488 keçi ul anti-fare IgM Alexa Fluor 488 (SSEA4 için) veya 1 (Tra-1-60 ). </li></ol></li><li> kamara slayt PBS aspire ve uygun kuyulara ikincil antikor dağıtmak. lamelleri, Aşama 6.2 ardından, 2 saat boyunca oda sıcaklığında parafilm yerleştirilen antikor çözeltisi üzerine lamelleri ters çevirin. Not: kullanarak, ışıltılı ikincil antikorlar etiketlemişse hücreler ışıktan korunmalıdır. Karanlık bir env odasının slaytlar ve lamelleri yerleştirininkubasyon ve yıkama sırasında ironment. </li><li> kamara slayt antikoru çıkarılması ve PBS eklenerek 10 dk - her 5 için Hücreleri 3 kere yıkayın. lamelleri için parafilm dikkatlice her biri kaldırın ve 24-plaka, hücre tarafı üste gelecek bir kuyuda geri yerleştirin. Yavaşça yıkama sırasında PBS ekleyin. </li><li> İkinci antijen için tarama önce, hücre içi OCT-4 ya da bu durumda, Sox2, oda sıcaklığında 1 saat süre ile geçirimli hale reaktifi (Triton-X-100) ile yapılan engelleme solüsyonu içinde tekrar inkübe edin. </li><li> Ekim-4 ya da Sox2 immunostain için, sadece birincil ve ikincil antikorlar ve uygulanması aşamalarım 6,1-6,6 açıklanan yöntem takip edin. 1&#39;den 200 ve ikincil antikor keçi anti-tavşan IgG Alexa Fluor 594: Bu protokolün amaçları için, 1 konsantrasyonda OCT-4 ve Sox2 kullanın 500. </li><li> 6&#39;-diamidino-2, &#39;PBS ile 10 dakika her ve 4 ile counterstain - yukarıda belirtilen birincil ve ikincil antikor tedavileri sonrasında, 5 için hücreler 3 kere yıkayın-phenylindole, nükleer görüntüleme isteniyorsa standart protokoller aşağıdaki dihidroklorür (DAPI). </li></ol> Görüntüleme 7. Hazırlık <ol><li> oda slaytlar için, üreticinin talimatlarını dikkatlice takip, slayt üst bölmeyi çıkarın. Daha sonra, damıtılmış su içinde durulanır ve mikroskopi sağlamak için ortam ve coverglass monte ekleyin. </li><li> lamelleri için, orta bir cam mikroskop lamı üzerine yerleştirilen montaj bir damla üzerine lamelleri ters. </li><li> Bir standart veya konfokal floresan mikroskop altında görüntü. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li>
<li>Hallett, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+function+of+autologous+iPSC-derived+dopamine+neurons+following+transplantation+in+a+non-human+primate+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease.</a> Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).</li>
<li>Haston, K. M., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Trials+in+a+Dish%3A+The+Potential+of+Pluripotent+Stem+Cells+to+Develop+Therapies+for+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+rev+pharm+toxicol%22%5BJournal%5D)">Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases.</a> Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+heart+fail%22%5BJournal%5D)">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).</li>
<li>Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+a+subpopulation+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts.</a> PloS one. 4, 7118(2009).</li>
<li>Sivapatham, R., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+Characterization+of+Patient-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+for+Disease+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+bio%22%5BJournal%5D)">Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling.</a> Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Ruff, D., Lieu, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+stem+cells+using+quantitative+PCR+protein+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+bio%22%5BJournal%5D)">Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays.</a> Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).</li>
<li>Pripuzova, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+protein+marker+panel+for+characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28hiPSCs%29+using+global+quantitative+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+res%22%5BJournal%5D)">Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis.</a> Stem cell res. 14, 323-338 (2015).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+jpn+acad+ser+B+phys+biol+sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Bigdeli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+embryonic+stem+cells+to+feeder-free+and+matrix-free+culture+conditions+directly+on+plastic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces.</a> J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).</li>
<li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+bio%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada sunulan sistematik protokol özellikle immünsitokimya yoluyla etkili Pluripotency analizini desteklemek için tasarlanmış bir küçültülmüş kültür tekniği şeklinde bir zaman kazandıran ve maliyet-etkin bir yöntem, sunmaktadır. şöyle tarif metodolojinin temel avantajlarıdır. Geleneksel olarak en fazla 3 ila 4 geçitler 12, 13 görünmesini dökme ayrılma tekniklerinin kullanımı sonrası kalan iMEFs ortadan kaldırmak için ve tipik tek ta...

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine insan yetişkin somatik hücre yeniden programlama (iPSCs) Hastalık 1, 2 incelemek için hastaya özgü hücrelerin bir potansiyel olarak sınırsız kaynağı elde etmek için bir yol sağlar. In vitro bir hastalık fenotipi yansıtan bu makul hastalığı ile ilişkili hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek yapmak ve uyuşturucu keşif geliştirmek ve tıp 3. kişiselleştirilmiş olur. Buna ek olarak, insan iPSCs (hiPSCs) ölü ya da işlevsiz hücrelerinin yerini alır ve birçok hastalığın 4 kapsamında, 5 fonksiyonu geri eşsiz bir kaynak olarak kullanılabilecek özel hücre tipleri kaynaklanan imkanı sunuyoruz. Yukarıdaki uygulamalarda iPSCs kullanarak önemli bir ön koşul kendi pluripotent ve farklılaşmamış devlet kültüründe genişleme sırasında muhafaza edilmesini sağlamaktır. Tipik haliyle, TECHNIQhücre ve özel ekipman büyük miktarlarda ihtiyaç gibi akış sitometrisi, Western blotting, polimeraz zincir reaksiyonu ve işlevsel tahlilleri gibi daah, iPSC pluripotensin 6, 7, 8, 9, 10, ayrıntılı analiz için kullanılmıştır. Ancak, iPSCs &#39;farklılaşmamış devletin rutin değerlendirme etkin şekilde azaltılmış zaman ve kaynak içeren, özellikle immünsitokimya (ICC) için bu hücrelerin sınırlı yayılımı yoluyla elde edilebilir. Son gelişmeler, murin fibroblast besleyici tabakalar ve serum ihtiva eden ortam gerektiren geleneksel kültür sistemlerine göre önemli bir gelişmedir tanımlanan serumsuz koşullarda iPSCs büyümesi izin verir. Bununla birlikte, mevcut literatür besleyici iPSCs geçiş anlatan net adım adım protokolleri içermezbesleyici içermeyen sistemlere tabaka. Bu bağlamda, bu protokol, sistematik olarak ışınlanmış fare embriyonik fibroblast üzerinde büyümüş hiPSCs (IMEF) besleyici tabakalar (1) olarak, serumsuz ortam içinde yayılması için uyarlanmış, ve (2), bir küçük ölçekte kültürlendi özellikle sağlam bir destek nasıl detayları immünositokimyasal analizi. Genel olarak, bu yöntem, immünsitokimya kullanarak rutin olarak kendi pluripotensini teyit etmek için, serum içermeyen koşullar insan iPSCs yaymak için zamanında ve düşük maliyetli bir prosedür gösterir.

<table><tbody><tr><td>DMEM-F12/HEPES</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt Serum Replasman</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Yaşam</td><td>Teknolojileri 21985023</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan FGF-Temel</td><td>Hücre Bilimleri</td><td>CRF001B</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK İnhibitörü</td><td>R& D</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip IV</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel hESC nitelikli Matris</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 Bazal Orta Kök</td><td>Hücre Teknolojileri</td><td>05850</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 5x Ek</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>05850</td><td></td></tr><tr><td>Nazik Hücre Ayrışması Tamponu</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>07174</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M PO < alt > 4 Tampon</td><td>Şirket İçi</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit, prill</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>1x Fosfat Tamponlu Salin</td><td>n / a</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Ekim-4A (C30A3) Tavşan mAb, Sox2 (D6D9) Tavşan mAb, SSEA4 (MC813) Fare mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Fare mAb</td><td>Hücre Sinyali Hücre Sinyali Hücre Sinyali Hücre Sinyali</td><td>2840 3579 4755 4746</td><td>Alternatif olarak, 6 pluripotent primer antikorun bir kombinasyonu, Katalog #9656'da bir kit olarak birlikte satın alınabilir</td></tr>. <tr><td>Keçi anti-Ms IgM Alexa Fluor 488</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A21042</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A21151</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Rb IgG Alexa Fluor 594</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell Hücre Kültürü Plakaları</td><td>Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td>0720080/0720081</td><td>6, 12, 24, 48, 96 kuyucuklu boyutlarda mevcuttur</td></tr><tr><td>Oda Slaytları</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12 565 21</td><td>1, 2, 4, 8, 16 kuyucuklu boyutlarda Cam veya Permanox Plastik olarak mevcuttur</td></tr><tr><td>Büyüme için kapak camı</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12 545 82</td><td>12, 15, 18, 22 ve 25 mm ebatlarda mevcuttur</td></tr></tbody></table>

rutin İmmünositokimyasal karakterizasyonu için serum serbest şartlar İnsan ipscs küçük ölçekli yayılım

Small-scale Propagation of Human iPSCs in Serum-free Conditions for Routine Immunocytochemical Characterization

Hasta özgüllükleri ve karakteristik saplılıkları nedeniyle hastalık modellemesi ve hücre terapötikleri için insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler) kullanılmasına büyük ilgi vardır. Bununla birlikte, işlevselliği için gerekli olan iPSC'lerin pluripotentliği, bu hücrelerin bu tür uygulamalarda kullanılabilmesi için doğrulanması gerekir. Pluripotentliklerini belirlemek için farklı hücresel ve fonksiyonel testler yoluyla iPSC'lerin titiz bir karakterizasyonu gerekli olsa da, pluripotens bakımının rutin değerlendirmesi, immünositokimyasal tekniklerle daha basit ve etkili bir şekilde gerçekleştirilebilir. Burada, özellikle immünositokimya kullanılarak pluripotent durumlarının doğrulanmasını kolaylaştırmak için hiPSC'lerin küçültülmüş bir şekilde kültürlenmesi için sistematik bir protokol sunuyoruz. Daha spesifik olarak, bu metodoloji, iPSC'leri serumsuz koşullarda büyütmenin ve bunları immünositokimya için ideal olan küçük odacıklı slaytlar veya cam lameller üzerine kaplamanın verimli ve uygun maliyetli bir yolunu kapsar.

Bu protokol, özellikle Pluripotency bakım teyit için maliyet-etkin immünsitokimya sağlamak için sınırlı bir şekilde besleyici serbest koşulları besleyici tabaka transfer ve daha sonra yayılan nasıl insan iPSCs bir adım adım açıklama sağlar. Şekil 1, bu prosedürün şematik bir temsilini göstermektedir. Şekil 2A, 6-çukurlu plakalara iMEFs üzerinde büyüyen hiPSC kolonileri gösterir. Bu koloniler tanımlanmış sınırlar ve yoğun faz parlak merkezleri ile tipik m...

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) pluripotent durumlarının korunmasını belirlemek için düzenli karakterizasyonu, bu hücrelerin diğer uygulamalar için kullanılmadan önce önemli bir adımdır. Burada, immünositokimya yoluyla kolay ve rutin karakterizasyonlarını sağlamak için özel olarak tasarlanmış insan iPSC'lerinin küçük ölçekli yayılımı için bir yöntem açıklıyoruz.

Rutin İmmünositokimyasal Karakterizasyonu için serum serbest şartlar İnsan iPSCs küçük ölçekli Yayılım

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient ...

Bu kültür yönteminin genel amacı, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (human iPSC'ler) rutin immünositokimyasal karakterizasyonuna özel olarak olanak sağlamak amacıyla küçük ölçekte çoğaltılmasıdır. Laboratuvarımdan gelen bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri, alt fetal katmandan spesifik pluripotens antikorları kullanılarak antijen tespitine daha uygun olan bir substrata geçirmek için kullanılan bir ölçek küçültme tekniği sunmaktadır. Bu tekniğin temel avantajı, pluripotent hücrelerin immünositokimya için ideal olan küçük kamaralı lamlar üzerinde veya lamellerde büyütülmesi için zaman ve maliyet açısından etkili bir yöntem sağlamasıdır.Pasajlama gününde, matris kaplı plakayı dört santigrat dereceden çıkarın ve doku kültürü davlumbazında bir saat boyunca oda sıcaklığına alışmasını sağlayın. Ardından, iMEF'ler üzerinde büyütülen insan iPSC kültürünün bulunduğu altılı plakanın bir kuyucuğundaki medyumu aspire edin ve yerine 500 mikrolitre kollajenaz disosyasyon reaktifi ekleyin. Sonrasında, mikroskop altında gözlemlendiğinde iPSC kolonilerinin kenarları hafifçe kalkana kadar hücreleri 37 santigrat derecede 10 ila 30 dakika inkube edin, ardından disosyasyon reakt

small-scale-propagation-human-ipscs-serum-free-conditions-for-routine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Gözlem ve ölçümü için bir tek tabaka hücreleri oluşturmak için bir self-made sitospin cihazların kullanımı dayalı, insan pluripotent kök hücreleri hücre yüzey belirteçleri için Süspansiyon immünositokimyasal boyama (hPSCs) (SSEA-3/SSEA-4) elde edildi.

Self-Made sitospin Aparatı kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücre İmmünositokimyasal Analizi

Burada tek bir lentiviral yeniden programlanması vektörü kullanılarak periferal kan 3-4 ml insan iPSCs üretimi için basit ve etkili bir protokol göstermektedir. Hazır kan hücrelerinin yeniden programlanması daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknoloji kullanımı hızlandırmak için vaat ediyor.

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Pluripotent kök hücreler, embriyonik veya uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri ya, kardiyomiyositler dahil olmak üzere insan farklılaşmış hücrelerin, değerli bir kaynak oluşturmaktadır. Burada, bir embriyoid organları tabanlı protokol ile fonksiyonel insan kardiyomiyositlerin elde etmek için bunları nasıl kullanacağınızı gösteren, iPS hücrelerin kalp indüksiyon üzerinde durulacak.

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), klinik uygulamalar ve temel araştırma için hastaya özgü dokuların bir kaynağı temsil eder. Burada, non-entegre epizomal plasmidleri kullanılarak viral içermeyen iPSCs içine donmuş buffy kat elde edilen insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) yeniden programlamak için detaylı bir protokol mevcut.

Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu protokol, yeniden programlama faktörleri içeren matrigel ve Sendai virüs vektörlerinin bir kombinasyonunu kullanarak, besleyicisiz koşullarda insan periferik T hücrelerinden indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) nasıl üretileceğini açıklar.

Besleyici içermeyen şartlar Sendai virüs kullanılarak insan periferik T hücrelerinden uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Burada, insandan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC) serum serbest embriyo gövdesi (SFEB) denilen üç boyutlu (3 boyutlu) bir sistem geliştirmek için bir protokol bildirdik. Bu 3 Boyutlu model, insan kortikal gelişimini modellemek için organotipik dilim kültürü gibi ve gelişmekte olan sinir devrelerinin fizyolojik sorgusu için kullanılabilir.

Fizyolojik Olarak İlgili Tahliller Kullanılarak 3-D Kök Hücre Kültürlerinin Sorgulanması İçin HiPSC Türevi Serum Serbest Embriyoid Cisim Geliştirilmesi

Bu iletişim kuralı koşullarda besleyici içermeyen insan pankreas hücreleri ayak izi-Alerjik İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) nesil ayrıntılı olarak anlatılmaktadır kullanarak CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins ve değiştirilmiş karakterizasyonu düzenleyerek takip tek hücre klonlar.

Verimli üretimi ve besleyici-Alerjik IPSCs CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak insan pankreas hücreleri düzenleme

Bir protokol olan ve olmayan oligopeptides, biyomalzemeler farklılaşması üzerine sertliği etkisini ve yayılması araştırmak için aşılı değişen sertlik ile polivinil alkol-co-İtakonik asit hydrogels hazırlamak için sunulan kök hücreler. Hydrogels sertliği crosslinking zaman tarafından kontrol ediliyordu.

İnsan Pluripotent kök hücre kültürü ile Xeno-Alerjik koşullar altında değişik sertlik polivinil alkol-Co-İtakonik asit Hydrogels

Gelecekteki hastalığı modelleme uygulamaları olan kimyasal olarak tanımlanan koşullarda, burada İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre farklılaşma içine her somite türev (myotome, sclerotome, dermatome ve syndetome) için bir iletişim kuralı mevcut ve Ortopedik cerrahi hücre tabanlı terapiler.

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

Hücre yeniden programlama, pluripotent hücre durumunu düzenleyen ve koruyan anahtar genlerin tanıtılmasını gerektirir. Açıklanan protokol, insan dermal fibroblastlarından viral/entegre yöntemler olmadan ancak modifiye edilmeyen RNA'lar (NM-RNA) kullanarak hücresel savunma mekanizmalarını azaltan immün kaçırma faktörleri ile birlikte indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) kolonilerinin oluşmasını sağlar.

Erişkin İnsan Dermal Fibroblastlarının Abdominal Deriden İzolasyon ve İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerin Indüklenen Alacalı Kök Hücrelerin Indükleyici Olmayan Yöntemle Üretilmesi

Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin fonksiyonel ön beyne özgü astrositlere farklılaşmasını kolaylaştıran bir protokolü açıklıyoruz. Bu, Frajil X Sendromu gibi nörogelişimsel bozuklukların patogenezinde glial hücrelerin rolünün araştırılmasını ve diğer beyin bozukluklarının modellenmesini sağlar.

Frajil X Messenger Ribonükleoproteinden Yoksun İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Astrositlerin Üretimi ve Karakterizasyonu

Öğrenin, insan iPSCs'lerinin küçük ölçekli yayılımını ve immünositokimyasal karakterizasyonunu. Bu yöntem, kök hücre araştırmalarında zaman ve maliyet tasarrufu sağlar.

Rutin İmmünositokimyasal Karakterizasyonu için serum serbest şartlar İnsan iPSCs küçük ölçekli Yayılım

Daha fazla video keşfet