Name: Hedeflenen In situ Mutajenezis Histon ve Genler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae'de endojenik lokasyonlarda histon genlerinde spesifik mutasyonlar oluşturma yöntemini. Bu teknik, kromatin süreçlerindeki histon kalıntılarının rolünü incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu el yazmasının hazırlanması sırasındaki yararlı yorumları için Reine Protacio'ya teşekkür ederiz. Finansman desteği için Ulusal Bilim Vakfı'na (1243680 ve 1613754 numaralı hibeler) ve Hendrix College Odyssey Programına şükranlarımızı sunarız.

<ol><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li>
<li>Campos, E. I., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histones%3A+annotating+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histones: annotating chromatin.</a> Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).</li>
<li>Rando, O. J., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+transcription+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromatin and transcription in yeast.</a> Genetics. 190 (2), 351-387 (2012).</li>
<li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+yeast+for+budding+geneticists%3A+a+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li>
<li>Storici, F., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delitto+perfetto+targeted+mutagenesis+in+yeast+with+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Eng+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">Delitto perfetto targeted mutagenesis in yeast with oligonucleotides.</a> Genet Eng (N Y). 25, 189-207 (2003).</li>
<li>Gray, M., Kupiec, M., Honigberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+genomic+%28SSG%29+and+random+domain-localized+%28RDL%29+mutagenesis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Site-specific genomic (SSG) and random domain-localized (RDL) mutagenesis in yeast.</a> BMC Biotechnol. 4, 7(2004).</li>
<li>Erdeniz, N., Mortensen, U. H., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning-free+PCR-based+allele+replacement+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Cloning-free PCR-based allele replacement methods.</a> Genome Res. 7 (12), 1174-1183 (1997).</li>
<li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C%3A+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li>
<li>Lundblad, V., Hartzog, G., Moqtaderi, Z. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18265094">Manipulation of cloned yeast DNA.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).</li>
<li>Hoffman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+yeast+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of yeast DNA.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).</li>
<li>Treco, D. A., Lundblad, V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18265093">Preparation of yeast media.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).</li>
<li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J Bacteriol. 63 (3), 399-406 (1952).</li>
<li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).</li>
<li>Johnson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+mutational+analysis+of+a+histone+H3+residue+in+budding+yeast+provides+insights+into+chromatin+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A systematic mutational analysis of a histone H3 residue in budding yeast provides insights into chromatin dynamics.</a> G3 (Bethesda). 5 (5), 741-749 (2015).</li>
<li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Res. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li>
<li>Cross, S. L., Smith, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+structure+and+cell+cycle+expression+of+mRNAs+encoded+by+two+histone+H3-H4+loci+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of the structure and cell cycle expression of mRNAs encoded by two histone H3-H4 loci in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 8 (2), 945-954 (1988).</li>
<li>Libuda, D. E., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+histone+genes+by+circular+chromosome+formation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Amplification of histone genes by circular chromosome formation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 443 (7114), 1003-1007 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Haploid S. cerevisiae hücreleri dört temel histon proteinlerinin her biri için kod özel mutagenez için iki genin biri hedeflemek isteyen araştırmacılar için bir meydan okuma temsil edebilir olmayan iki alel genler arasındaki dizi homoloji yüksek düzeyde. Daha önce sık kullanan, Delitto Perfetto, alana özgü genomik (SSG) mutajenez ve klonlama içermeyen PCR bazlı alel değiştirme yöntemleri 5, 6, 7, hem de daha y...

Dört çekirdekli histon proteinleri H2A, H2B, H3, H4 ve ökaryotik kromozomların sıkıştırma, organizasyon ve fonksiyonunda önemli rol oynarlar. Bu histonlar her iki set sonuçta nükleozom 1 oluşumu ile sonuçlanır, histon oktameri, kendi etrafında DNA ~ 147 baz çifti sarma yönlendiren bir molekül makara oluşturur. Nükleozomlar bu tür kromozom üzerinde gen transkripsiyonu düzenlenmesi ve ökromatin oluşumu ve heterokromatin olarak kromozom tabanlı süreçleri, çeşitli aktif katılımcılar vardır ve gibi, son birkaç on yıl boyunca yoğun bir araştırmanın odak noktası olmuştur. Bu mekanizmalar histon kalıntılarının sonrası modifikasyon, ATP-bağımlı nükleozom remodeling ve ATP-bağımsız nükleozom yeniden düzenlenmesi dahil - bir takım mekanizmalar hangi nükleozom belirli işlemlerin uygulanmasını kolaylaştırabilir yollarla manipüle edilebilir tarif edilmiştirve montaj / demontaj 2, 3. Tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae ökaryotlarda histon işlevinin anlaşılması için özellikle güçlü bir model organizmadır. Bu büyük ölçüde etki ökaryotlarının boyunca histon proteinlerinin evrimsel korunması yüksek derecede ve genetik ve biyokimyasal deneysel çeşitli maya amenability isnat edilebilir 4 yaklaşır. maya Ters genetik yaklaşımlar yaygın kromatin biyolojinin çeşitli yönlerine ilişkin belirli histon mutasyonların etkilerini incelemek için kullanılır olmuştur. deneyler bu tür için anormal hücre içi (nedeniyle hücrelerde plazmidlerin sayıları değişen) histon proteinleri seviyeleri ve yol açabilir bağımsız plazmidlerden ifade mutant histonlar kendi ana genomik lokusları eksprese edildiği hücrelerin kullanımı genellikle tercih edilir kromatin tr eş zamanlı değişikliksonuçta sonuçların yorumunu karıştırabilir vironments. Burada, genomu içinde kalan eksojen DNA sekansları olmadan arzu edilen mutasyon (lar) ın üretiminde bir klonlama aşaması ve sonuç gerektirmez kendi ana genomik konumlarda histon genlerinin hedeflenen mutagenezi için izin veren bir PCR bazlı teknik açıklar. Bu teknik, maya etkili homolog rekombinasyon sistemi yararlanır ve diğer gruplar tarafından geliştirilen diğer benzer teknikler ile ortak birçok özelliğe sahiptir - özellikle Delitto Perfetto, alana özgü genomik (SSG) mutajenez ve klonlama içermeyen PCR bazlı alel yedek yöntemleri 5, 6, 7. Bununla birlikte, tarif tekniği özellikle histon gen mutagenezi için çok uygundur hale getiren bir yönü vardır. haploid maya hücreleri, dört çekirdek histon her iki olmayan a göre kodlanmıştırllelic ve yüksek ölçüde homolog genlerin: Örneğin, histon H3 HHT1 ve HHT2 genleri tarafından kodlanan ve iki genin açık okuma çerçeveleri (ORF&#39;ler), sırayla% 90 üzerinde özdeştir. homoloji Bu yüksek derecede spesifik mutagenez için iki histon-kodlayan genlerin biri hedef için tasarlanmış deneyler karmaşık hale getirebilir. Yukarıda bahsedilen yöntemler genellikle homolog rekombinasyon sürücü hedef genin ORF içinde en azından bazı dizilerin kullanılmasını gerektirir ise, burada tarif tekniği için (daha az sekans benzerliği paylaşan) histon gen ORF eteklenen dizileri kullanır rekombinasyon adımı ve böylece arzu edilen mahaline mutagenez başarılı hedefleme olasılığını arttırır. Ayrıca, rekombinasyonu sürücü homolog bölgeleri daha verimli hedeflenen homolog rekombinasyon katkıda çok geniş olabilir.

<table><tbody><tr><td>1 kb DNA Merdiveni (DNA standartları)</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5093-100G</td><td></td></tr><tr><td>Borik Asit</td><td>Sigma</td><td>B0394-500G</td><td></td></tr><tr><td>dNTP karışımı (her biri 10 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>EDTA çözeltisi (0,5 M, pH 8,0)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (200 Kanıt)</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-824</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat (EDTA</td><td>) Sigma</td><td>E4884-500G</td><td></td></tr><tr><td>Lityum asetat dihidrat</td><td>Sigma</td><td>L6883-250G</td><td></td></tr><tr><td>MyCycler Termal Döngüleyici</td><td>BioRad</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>Poli (etilen glikol) (PEG)</td> <td>Sigma</td><td>P3640-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR HS DNA Polimeraz (yüksek kaliteli DNA polimeraz) &nbsp; ve 5x tampon</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-443-960</td><td></td></tr><tr><td>Somon sperm DNA çözeltisi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Sigma 7-9 (Tris bazı, toz formu)</td> <td>Sigma</td><td>T1378-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat trihidrat</td><td>Sigma</td><td>236500-500G</td><td></td></tr><tr><td>Supra Elek GPG Agarozu (düşük metling sıcaklığı agarozu)</td> <td>AmericanBio</td><td>AB00985-00100</td><td></td></tr><tr><td>Taq Polimeraz ve 10x Tampon</td><td>New England BioLabs</td><td>M0273X</td><td></td></tr><tr><td>Kürdan</td><td>Fisher Scientific</td><td>S67859</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td><td>AmericanBio</td><td>AB14043-01000</td><td></td></tr><tr><td>AD (+) - Maya</td><td>ortamı için</td><td>Glikoz Fisher Scientific</td><td>AC170080025</td></tr><tr>Maya <td>ortamı için</td><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-01-0</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-07-2</td><td>YPD ortamı için</td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0127-17-9</td><td>YPD ortamı için</td></tr><tr><td>4-aminobenzoik asit</td><td>Sigma</td><td>A9878-100G</td><td>tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>Adenin</td><td>Sigma</td><td>A8626-100G</td><td>, tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>Glisin hidroklorür</td><td>Sigma</td><td>G2879-100G</td><td>, tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Alanine</td><td>Sigma</td><td>A7627-100G</td>, <td>tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Arginin monohidroklorür</td><td>Sigma</td><td>A5131-100G</td><td>, tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Asparagin monohidrat</td><td>Sigma</td><td>A8381-100G</td><td>, tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Aspartik asit sodyum tuzu monohidrat</td><td>Sigma</td><td>A6683-100G</td><td>, tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Sistein hidroklorür monohidrat</td><td>Sigma</td><td>C7880-100G</td><td>, tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamik asit hidroklorür</td><td>Sigma</td><td>G2128-100G</td><td>, tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma</td><td>G3126-100G</td><td>, tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Histidin monohidroklorür monohidrat</td><td>Sigma</td><td>H8125-100G</td><td>, tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>L-İzolösin</td><td>Sigma</td><td>I2752-100G</td><td>, tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Lösin</td><td>Sigma</td><td>L8000-100G</td><td>, tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Lizin monohidroklorür</td><td>Sigma</td><td>L5626-100G</td><td>, tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Metionin</td><td>Sigma</td><td>M9625-100G</td><td>, tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Fenilalanin</td><td>Sigma</td><td>P2126-100G</td><td>, tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma</td><td>P0380-100G</td><td>, tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Sigma</td><td>S4500-100G</td><td>, tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Threonine</td><td>Sigma</td><td>T8625-100G</td><td>, tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Triptofan</td><td>Sigma</td><td>T0254-100G</td><td>tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Tirozin</td><td>Sigma</td><td>T3754-100G</td><td>, tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Valine</td><td>Sigma</td><td>V0500-100G</td><td>, tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>myo-Inositol</td><td>Sigma</td><td>I5125-100G</td><td>, tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>, tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>Amonyum Sülfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>A702-500</td><td>tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>Maya Azot Bazlı</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0919-07-3</td><td>tam minimum bırakma ortamı için&nbsp;</td></tr><tr><td>5-Floroorotik asit (5-FOA)</td> <td>AmericanBio</td><td>AB04067-00005</td><td>5-FOA ortamı için</td></tr></tbody></table>

hedeflenen<em&gt; in situ</embudding maya&gt; mutajenezis histon ve genler

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Tomurcuklanan maya hücrelerinde histon genlerinde hedeflenen mutasyonlar oluşturmak için PCR ve homolog rekombinasyon tabanlı bir sistem tanımlıyoruz. Elde edilen mutant aleller endojen genomik bölgelerinde bulunur ve prosedürü takiben genomda hiçbir eksojen DNA dizisi kalmaz. Haploid maya hücrelerinde, dört çekirdek histon proteininin her biri, yüksek oranda homolog açık okuma çerçevelerine (ORF'ler) sahip iki alelik olmayan gen tarafından kodlandığından, mutajenezi spesifik olarak belirli bir histon proteinini kodlayan iki genden birine hedeflemek sorunlu olabilir. Burada tanımladığımız strateji, homolog rekombinasyon adımı için hedef genlerin ORF'sinin içinde değil, dışında dizileri kullanarak bu sorunu atlar. Bu sistemin bir başka özelliği de, homolog rekombinasyon adımlarını yönlendiren DNA bölgelerinin çok geniş hale getirilebilmesi ve böylece başarılı entegrasyon olaylarının olasılığını artırmasıdır. Bu özellikler, bu stratejiyi histon geni mutajenezi için özellikle uygun hale getirir, ancak maya genomundaki diğer genlerin mutajenezi için de uyarlanabilir.

In situ mutagenez stratejisi hedef arasında temsili bir örnek olarak, bir glutamik asit (mutan H3-R53E) bir arjininden pozisyonda 53 bir ikame barındıran bir histon H3 mutan proteini ifade eden bir hht2 alel üretilmesini tarif eder. Biz HHT2 bütün ORF URA3 geni (protokol aşamasını 1 e bakınız) ile ikame edildiği bir soy elde. Bu soy, yAAD156 da hücrelerin histidin için oksotropik ol...

Saccharomyces cerevisiae'deki endojen konumlarında histon genlerinde mutasyon oluşturmak için bir strateji sunulmuştur.

Hedeflenen<em&gt; In situ</emBudding Maya&gt; Mutajenezis Histon ve Genler

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Bu prosedürün genel amacı, tomurcuklanan maya hücrelerinde histon genlerinin endojen kromozomal konumlarında spesifik mutasyonlar oluşturmaktır. Bu yöntem, DNA transkripsiyonu gibi kromatini substrat olarak kullanan çeşitli süreçlerde spesifik histon kalıntılarının katkısını belirlemek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mayada her bir histon proteininin iki adet yüksek derecede homolog, non-allelik gen tarafından kodlanmasına rağmen, spesifik histon genlerinin mutajenez için hedeflenebilmesidir.Hedef histon geni nakavt edilip yerine URA3 yerleştirilmiş bir maya suşu oluşturduktan sonra, genin ilk yarısı için aşağıdaki reaksiyonu kurarak hedef histon geninin kısmen örtüşen iki fragmanı için PCR ürünleri oluşturun. Genin ikinci yarısı için, farklı primerler kullanarak benzer bir PCR reaksiyonu kurun. Reaksiyonları bir termosikletöre yerleştirin ve aşağıdaki programı ayarlayın.PCR reaksiyonlarının 20 ila 50 µL'sini, TBE tamponunda %0,9 düşük erime noktalı agaroz jele yükleyerek yürütün. Ardından, temiz bir jilet kullanarak PCR ürünlerini jelden kesin ve her bir parçayı 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Agaroz parçalarını, kullanıma hazır olana kadar 20 °C'de saklayın.Tam boyu

targeted-in-situ-mutagenesis-of-histone-genes-in-budding-yeast

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Maya genetik çalışmalar, hücresel DNA metabolizması insan genlerinin moleküler ve hücresel fonksiyonları araştırmak için istihdam edilebilir. Yöntem, insan genetik karakterizasyonu için...

İnsan DNA Onarım Proteinler Genetik Araştırmalar Maya Model Sistemi olarak kullanma

HO-uyarılmış translokasyon tahlil tek iplikli DNA, çift iplikli tatili diploid birden fazla lokusların kurulmasından sonra tavlama...

HO-Endonuclease Oluşum kantitasyonu ve Analiz Tavlama Tek-Strand kromozomal Translokasyonlar Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

Kaynak: Bennett, S. A.,  ve diğerleri, Maya Nörodejeneratif Proteinopati Modellerinde Histon Translasyon Sonrası Modifikasyon Değişikliklerinin Karakterize Edilmesi. J. Vis. Uzm. (2019). Bu video, nörodejeneratif proteinleri aşırı eksprese eden maya hücrelerindeki histon modifikasyonlarını değerlendirme prosedürünü göstermektedir. Adımlar, hücre lizizi, santrifüjleme, elektroforez, membran transferi ve modifiye histonların antikor bazlı tespitini içerir.

Nörodejeneratif Protein Aşırı Ekspresyonu ile Maya Hücrelerinde Histon Modifikasyonlarının Saptanması

Genetik olarak kodlanmış histon miniSOG mavi ışığa bağımlı bir şekilde genom kalıtsal mutasyonlara neden olur. Bu mutajenez yöntemi, hızlı, basit toksik kimyasalların serbest ve ileri genetik tarama ve transgen entegrasyonu için çok uygundur.

Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez<em&gt; C. elegans</em

Burada, tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaeüzerinden değiştirilmiş Histon Kromatin immunoprecipitation için bir protokol açıklayın. Immunoprecipitated DNA kantitatif PCR için daha sonra bereket ve Histon translasyonel modifikasyonlar genom boyunca yerelleştirilmesini sorguya eskiden.

Histon değişiklikler Saccharomyces cerevisiae üzerinden Kromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Bu makalede ayrıntılı bir metodoloji fisyon mayası bir hedef gen rasgele mutagenesis için. Örnek olarak, biz bir alt birim 19S proteasome ve ekran heterochromatin istikrarsızlaştırmak mutasyonlar için kodlar rpt4 +, hedef.

Fisyon mayası Heterochromatin kararsız hale Proteasome mutantlar seçmek için rasgele Mutagenesis Gene hedefli

Ribonucleotides genom ökaryotik nükleer DNA ikileşmesi sırasında dahil en bol kanonik olmayan nükleotit arasındadır. Düzgün kaldırdıysanız, ribonucleotides DNA hasarı ve mutagenesis neden olabilir. Burada, ribonucleotide birleşme DNA ve mutajenik etkileri içine bolluk değerlendirmek için kullanılan iki deneysel yaklaşımlar mevcut.

Eğitim Ribonucleotide ortaklık: Strand-özel hafiye-in Ribonucleotides Maya genom ve Ribonucleotide kaynaklı Mutagenesis ölçme

Burada sunulan dört protokolleri oluşturmak ve mayalı Saccharomyces cerevisiae muhabiri suşları insan p53 Transaktivasyon potansiyeli, çeşitli kanserle ilişkili mutasyonlar etkileri, ortak ifade etkileşim proteinleri çalışma ve istismar spesifik küçük moleküllerin etkileri.

Insan p53 çalışma fonksiyonel Assays geliştirmek için bir şasi olarak Maya

Biz Maya fizyon basit bastırıcı ekran protokolünde mevcut. Bu yöntem etkili, alkil-Alerjik ve kez tek bir genomik locus meydana gelen mutasyonlar için seçici değildir.  Protokol bir mutasyon veya bir uyuşturucu nedeniyle büyüme kusurları sıvı kültüründe hafifletmek bastırıcılarının yalıtmak için uygundur.

Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe derin sıralama yoluyla, kendiliğinden bastırıcı ekran

Hızlandırılmış mikroskopi, tomurcuklanan mayadaki mayozu incelemek için değerli bir araçtır. Bu protokol, mayotik kromozom ayrışması sırasında belirli bir proteinin işlevinin nasıl çalışılacağını göstermek için hücre döngüsü senkronizasyonunu, hızlandırılmış mikroskopiyi ve bir hedef proteinin koşullu tükenmesini birleştiren bir yöntemi açıklar.

S. cerevisiae'de Mayozu İncelemek için Hızlandırılmış Mikroskopi ve Proteinlerin Aşamaya Özgü Nükleer Tükenmesinin Kullanılması

Proteinle ilişkili yeni başlayan DNA'nın zenginlenmesi ve dizilenmesi (eSPAN), iki çoğalan DNA zincirinde kromatin ilişkili proteinin göreceli bolluğunu tespit etmek için geliştirildi ve böylece kromatin replikasyonu ve bağlı süreçler hakkında moleküler içgörüler ortaya çıktı. Bu protokol, maya ve fare embriyonik kök (ES) hücrelerinde eSPAN prosedürlerini tanımlar.

Proteinle İlgili Yeni DNA Zincirlerinin Zenginleştirilmesi ve Dizilenmesi Yoluyla Proteinlerin Zincire Özgü Analizi

Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae'de endojenik lokasyonlarda histon genlerinde spesifik mutasyonlar oluşturma yöntemini. Bu teknik, kromatin süreçlerindeki histon kalıntılarının rolünü incelemek için kullanılır.

Hedeflenen

Daha fazla video keşfet