Hedeflenen In situ Mutajenezis Histon ve Genler

Bu prosedürün genel amacı, tomurcuklanan maya hücrelerinde endojen kromozomal konumlarında histon genlerinde spesifik mutasyonlar oluşturmaktır. Bu yöntem, DNA transkripsiyonu gibi substrat olarak kromatin kullanan çeşitli işlemlerde spesifik histon kalıntılarının katkısını belirlemek için kullanılabilir, örneğin her kombinasyonda. Bu tekniğin ana avantajı, mayada, her histon proteininin iki yüksek derecede homolog, alelik olmayan gen tarafından kodlanmasına rağmen, spesifik histon genlerinin mutajenez için hedeflenebilmesidir.

Hedef histon geni nakavt edilmiş ve URA3 ile değiştirilmiş bir maya suşu oluşturduktan sonra, genin ilk yarısı için aşağıdaki reaksiyonu ayarlayarak hedef histon geninin kısmen örtüşen iki parçası için PCR ürünleri oluşturun. Genin ikinci yarısı için, farklı primerler kullanarak benzer bir PCR reaksiyonu ayarlayın. Reaksiyonları bir termodöngüleyiciye yerleştirin ve aşağıdaki programı ayarlayın.

TBE tamponunda %0.9 düşük erime noktalı agaroz jel üzerinde 20 ila 50 mikrolitre PCR reaksiyonu çalıştırın. Ardından, PCR ürünlerini jelden kesmek için temiz bir tıraş bıçağı kullanın ve her bölümü 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Agaroz parçalarını kullanıma hazır olana kadar 20 santigrat derecede saklayın.

Tam boyutlu PCR ürünleri oluşturmak üzere PCR reaksiyonları için şablon DNA hazırlamak için, agaroz bölümlerini beş dakika boyunca 65 santigrat derecede bir ısı bloğunda eritin. Erimeye yardımcı olmak için tüpleri her bir ila iki dakikada bir girdaplamak. Her numuneden belirli bir miktarda erimiş agarozu tek bir Mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpü girdaplama ile karıştırın.

Bunu füzyon PCR için şablon olarak kullanın ve kullanana kadar 20 santigrat derecede saklayın. Büyük miktarda tam boyutlu PCR ürününü amplifiye etmek için, her biri aşağıdaki reaktiflerle altı PCR reaksiyonu ayarlayın. Tüpleri termocycler'a yerleştirin ve reaksiyonları aşağıdaki ayarlarla çalıştırın.

PCR ürünlerini çökeltme yoluyla konsantre edin ve metin protokolüne göre omurga plazmidi ile kotransformasyon için kullanın. PCR ürün entegrasyonunun bir sonucu olarak URA3 geninin kaybını taramak için, plaka kapağını çıkararak ve kolonileri içeren plakayı steril kadife üzerine bastırarak plaka 1'den 20'ye kadar plaka hücrelerini çoğaltın. Plakayı kadife üzerine bastırarak hücreleri kadifeden 5 FOA'lık bir plakaya aktarın.

Plakaları iki gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Ardından plakaları büyüme açısından dikkatlice inceleyin. Metin protokolüne göre aday kolonileri YPD plakaları üzerinde çizgiledikten ve inkübe ettikten sonra, her bir YPD saflaştırma plakasını yeni bir YPD plakasına, URA3 geninin kaybını kontrol etmek için urasil içermeyen bir bırakma plakasına ve omurga plazmidinin varlığını veya yokluğunu izlemek için ikinci bir bırakma plakasına replika plaka

Kuluçkayı takiben, her aday numuneden YPD plakasında büyüyen ancak her iki bırakma plakasında da büyümeyen bir koloni tanımlayın. Bu kolonileri taze YPD plakalarına yeniden yerleştirin. Metin protokolüne göre PCR kullanarak mutant alelin uygun entegrasyonu için olduğu gibi.

Bu şekil, sonuçta bir R2E mutasyonu üreten bir AGA'dan GAA'ya kodon değişikliği ile sonuçlanan istenen mutasyonlara sahip, kısmen örtüşen iki HHT53 fragmanı oluşturmak için PCR sonuçlarını göstermektedir. Tam boyutlu PCR ürünlerini oluşturan bir füzyon PCR reaksiyonunun sonucu burada gösterilmektedir. Tam boyutlu PCR ürünleri, homolog rekombinasyonu sürmek için sırasıyla HHT195 açık okuma çerçevesinin yukarı ve aşağı bölgelerine homolog 220 ve 2 baz çifti bölgesi içeriyordu.

Bu örnek dönüşümde, tam boyutlu PCR ürünleri HIS-3 işaretli plazmid ile birlikte transforme edildi ve histidin içermeyen plakalarda dönüştürücüler seçildi. HIS pozitif kolonileri daha sonra 5-FOA direnci açısından tarandı. Aday örneklerinin yanı sıra istenen entegrasyon olaylarını temsil etme olasılığı düşük olan örnekler de gösterilir.

12 aday numune belirlendi ve URA3 geninin mutant PCR ürünleri ile değiştirilmesi için PCR analizine tabi tutuldu. Dört aday, bir PCR ürününün doğru yere entegrasyonunu gösterdi. Bu adaylardan biri dördüncü şeritte gösteriliyor.

AG2GA mutasyonu yeni bir EcoR1 kısıtlama bölgesi oluşturduğundan, mutant dizinin gerçekten genoma dahil edildiğini göstermek için başarılı entegrasyon PCR örneklerinden birinde EcoR1 ile sindirim gerçekleştirildi. Tüm reaktifler mevcut olduğunda, zaman dilimi içinde veya 15 ila 20 gün içinde istenen histon mutasyonlarını barındıran maya hücreleri elde etmek mümkün olmalıdır. Konak suşunda istenen mutasyon oluşturulduktan sonra, hedef histon proteinini yalnızca mutajenize genden eksprese eden hücreler, uygun genetik çaprazlamalar yoluyla elde edilebilir.

Bu prosedürü denerken, PCR reaksiyonlarının çevrelerinin, deneylerde kullanılan spesifik primerlerin doğasına ve PCR ürünlerinin beklenen boyutlarına göre ayarlanması gerekebileceğini unutmamak önemlidir. Bu prosedür, ikinci bir yüksek derecede homolog, alelik olmayan genin varlığına rağmen spesifik bir histon genini hedeflemeye izin verdiği için histon geni mutajenezi için çok uygun olsa da, diğer genomik konumlarda mutasyonlar oluşturmak için de kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, PCR yaklaşımları ve maya genetiği tekniklerinin bir kombinasyonunu kullanarak tomurcuklanan mayada hedeflenen NC2 histon mutasyonlarının nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.

UV ışığına maruz kalmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bir UV transilluminatörü ile çalışırken her zaman koruyucu gözlük, kalkan ve giysi kullanılması gerektiğini unutmayın. Ayrıca prosedürün çoğu adımında eldiven, gözlük ve koruyucu giysi giyin.