Name: Ölçme Hücre Göç Bir Özelleştirilebilir Odası (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Öğrenin, hücre göçünü kemotaktik ajanlara yanıt olarak ölçmek için özelleştirilebilir bir mikrokanal yöntemi kullanarak. Bu teknik, yara iyileşmesi ve büyüme faktörleri etkilerini in vitro çalışmalarda araştırmacılara basit ve erişilebilir bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar bu proje için finansman sağlamak için Clemson Üniversitesi Yaratıcı Sorgulama program ve NSF CBET1254609 kabul.

1. Bir Konsantrasyon Gradient Oluşturma için Microchannel Chamber Üreten <ol><li> Bir akrilik kalıp parçanın kesilmesi <ol><li> istenen genişlikte akrilik bir parça elde edilir. Tipik olarak 1/16-inç kalınlığında akrilik levhalar kullanmak. Kalın yaprak onları sürecinde kırmaya veya çözgü neden gerekli mekanik gücüm yok iyi ve çok ince yaprak kesmek zordur. </li><li> polidimetilsiloksan (PDMS) içinde bir boşluk üretmek için akrilik parça istenen şekle sahip bir CAD dosyası oluşturun. Bireysel deneysel protokollere uygun istenen degrade elde etmek için kanal genişliği ve uzunluğunu ayarlayın. <ol><li> Iki kare (0.254 cm x 0.254 cm) bir 0.127 cm genişliğinde kanal tarafından (0.254 cm uzunluğunda) bağlı (Şekil 1): Burada, aşağıdaki boyutlardan bir akrilik parça kullanın. </li></ol></li><li> manu göre bir lazer kesici akrilik parça lazer kesme aparatı içine CAD dosyasını içe ve koyunfacturer protokol. NOT: Alternatif olarak, CAD tasarım parça 3D-yazdırın. Bu yöntemin avantajı, diğer maddeler, kalıp için kullanılabilir olmasıdır; Ancak, çözünürlük ve uyarlık lazer kesim ile karşılaştırıldığında 3D baskı ile azaltılabilir. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55264/55264fig1.jpg" /> Şekil 1: Mikrokanal Odası Bilgisayar Destekli Tasarım (CAD) Temsil. Bu görüntü mikrokanal odasını oluşturmak için gerekli akrilik ekin çizim CAD göstermektedir. 1 A) CAD çizim, 1B) inç boyutları ile çizim CAD Side view, 1C) inç boyutları ile çizim CAD Üst bakış Üstten görünüm <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55264/55264fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="2"><li&gt; polidimetilsiloksan Dökme (PDMS) <ol><li> Bir ağırlık teknede ticari Elastomer Sertleştirici (örneğin Sylgard 194), ağırlıkça 1 kısım ticari Elastomer baz ağırlığı (örneğin Sylgard 184) 10 kısım karıştırın. Tipik haliyle, Elastomer Sertleştirici 1 g elastomer tabanı 10 g karıştırılır. </li><li> 5 dakika boyunca, bir mikropipet ile taban ve sertleştirme maddesi birleştirmek için karıştırın. </li><li> bir vakum çan kurmak ve hava kabarcığı kaldırmak için 30 dakika süreyle vakum PDMS ile tartın tekne yerleştirin. </li><li> Vakumu kapatın ve tartmak tekne çıkarın. Küçük bir Petri kabındaki akrilik cut-out üstüne PDMS dökün. PDMS tamamen ekleme kapsar emin olun. </li><li> PDMS oda sıcaklığında (en azından 18 saat) bir gecede bekletilmelidir. </li></ol></li><li> PDMS gelen parçayı çıkarma <ol><li> PDMS kür sonra, dikkatlice bir neşter ile akrilik parçası etrafında PDMS keserek çıkartın. </li></ol&gt; </li></ol> 2. Microchannel Odası Hücreler Kaplama <ol><li> Hücreleri kaplama hazne Sterilizasyon. Not: PDMS, etilen oksit veya diğer teknikleri kullanarak sterilize edilebilir olsa da, hızlı bir UV muamele hücre kültürü çalışmaları için, hızlı, ucuz ve yeterlidir. kısa UV tedavi süresi PDMS parçasının yapısı veya mekanik bütünlüğüne zarar vermedi. <ol><li> Standart bir hücre kültürü kabininde tamamen% 70 etanol ile bölmeyi kapsamaktadır. </li><li> kapaklı kapalı olarak laminer akış kaputu Petri kabı koyun. </li><li> Kaputu kapatın ve UV ışığı açın. 1-2 saat süreyle UV ışınlarına maruz kalmaktadır. </li><li> laminer akış kaputu açın ve akışını yeniden kurmak için 15 dakika bekleyin. </li><li> % 70 etanol çıkarın. </li><li> steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez odaları yıkayın. her bir yıkama için 1 mL PBS kullanın. PBS kaldırmak ve odaları kapaklı kapalı bir gecede kurumasını bekleyin. NOT: Alternatif olarak, yerineVarsa bir laminer akış kaput kullanarak, sterilizasyon UV odası kutusunu kullanın. alüminyum folyo ile kaplı bir karton kutusunun arkasında bir UV ışık kaynağı koyarak UV kutusu yapın. Alüminyum folyo örnek da aydınlatma sağlamak için ışık yansıtır. </li></ol></li><li> Odasına Hücreler Kaplama <ol><li> Tripan mavi ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. <ol><li> % 0.4 tripan mavisi 400 uL hücre süspansiyonu 100 ul ekleyin ve yavaşça karıştırın. nazikçe cam lamel altında iki bölmeyi doldurarak hemasitometre bu çözümün 100 mcL uygulayın. </li><li> hemasitometre ızgara üzerinde odaklanmak için bir 10X amacı ile bir mikroskop kullanın. hemasitometre 16 meydanlarından biri kümesi içinde canlı boyanmamış hücreleri saymak için bir el taksitli sayacı kullanın. </li><li> 16 kareler her 4 set halinde hücreleri saymak. 16 kareler 4 setleri ortalama hücre sayısını alın ve 5x10 4 ile çarpın. Bu son sayı numbe olduğunuhücre süspansiyonu hücre / ml r. </li></ol></li><li> Her bir bölme bir oyuğuna 2500 hücreleri ekleyin. Bu ~ 30,000 / cm2 &#39;lik bir yakın konfluent hücre yoğunluğuna çevirir. </li><li> Hücreler ortam eklemeden önce 60 dakika boyunca bölme oturmasına izin (Dulbecco Modifiye Eagle ortamı,% 10 fetal bovin serumu,% 1 penisilin-streptomisin). </li></ol></li></ol> 3. Dekstran Sırılsıklam Agaroz Blokları <ol><li> Bir agaroz blok oluşturma <ol><li> 3D baskılı kalıbın (2 mm x 2 mm x 2 mm arasında) agaroz% 3 dökün. </li><li> 30 dakika kabarcıkları uzaklaştırmak için agaroz bir vakum odasına katılaşmasına izin verin. </li><li> kalıptan agaroz bloğunu çıkarın. Not: Alternatif olarak, 2 mm kalınlığında, küçük bir Petri kabı içine agaroz% 3 dökün. bir neşter ya da başka kesici alet kullanılarak bir 2 mm x 2 mm x 2 mm&#39;lik bir blok kesin. Bu kalıp sistemi gibi kesin değil ama yapmak için biraz daha kolay olabilir. </li></ol></li><li> tamamen submergkemotaktik faktörü istenen konsantrasyonda bir çözelti e agaroz bloğu. konsantrasyon gradyanı oluşumu değerlendirmek için, floresan dekstran ile birinci bölme yıkayın. dekstran konsantrasyonu ve moleküler ağırlığı, bir çözünür faktör veya ilgi duyulan ilaç ile aynı olmalıdır. </li><li> Agaroz blok gecede ıslatın. </li></ol> Çözünür Faktörü Konsantrasyon Gradient değerlendirin Dekstran Difüzyon 4. Time-lapse <ol><li> mikrokanal odasının küçük bir kare kuyuda dekstran batırılmış agaroz blok yerleştirin. </li><li> Bir hücre görüntüleme sisteminde mikro odasına yerleştirin veya bir time-lapse özelliği ile başka bir floresan mikroskop kullanın. üreticinin talimatlarına uygun olarak zaman atlamalı başlayın. NOT: Gösterilen sonuçlar GFP filtresi,% 50 ışık, 4/10 pH ve 4X büyütme ile alınır. </li></ol> Hücre Büyüme 5. Time-lapse <ol><li> bir ucunda, mikrokanal bölmesi Levha hücreleribölme. Burada, 3T3 fibroblastların kullanın. Mikrokanal odası içinde, bir oyuğuna 2500 hücreleri ekleyin. 2.2.1 açıklandığı gibi hücreleri saymak. <ol><li> Hücreler ortam eklemeden önce 60 dakika boyunca bölme oturmasına izin (Dulbecco Modifiye Eagle ortamı,% 10 fetal bovin serumu,% 1 penisilin-streptomisin). % 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de kaplanmıştır hücrelerle mikrokanal odası tutun. kanaldan hücre göçü bir mikroskop ile görülebilir. </li><li> bir belirteç ekleme veya mesafeyi hücre ön hamle ölçmek için bir başlangıç ​​yeri olarak hizmet etmek üzere bir belirteç olarak odasında bir mikroskobik kusur kullanın. </li></ol></li><li> Bir agaroz jel (8 mm3 blok) ihtiva eden yerleştirerek gradyanı oluşturulması konsantre büyüme faktörü, kemo-çekici, ilaç veya diğer bir faktör, test edilen mikrokanalın bir ucunda (burada,% 40 FBS, örnek olarak kullanılıyor) bölme. </li><li> Hareketli hücre ön time-lapse fotoğraf çekmek. Burada, sonuçlar fro hücre görüntüleri gösterirnt o bir görüntüleme sistemi kullanılarak 12 saatte çekildi. </li><li> Hücre büyüme hızını ölçmek için hücre ön resimlerini kullanın. ilk hücre ön, kanal duvarları ve referans markeri ile tanımlanan bir çokgen maske oluşturmak için (roipoly) MATLAB polyfit işlevini kullanarak büyüme oranını hesaplayınız. Bu maskenin boyutları ortalama hücre ön hız hesaplanır hangi ön göç mesafesini verir. Diğer çalışmalar benzer bir yöntem 8 kullanmışlardır. NOT: Aynı mesafeden çözünür faktörün konsantrasyonuna her karede hücre büyümesi ön kenarını karşılaştırın. çözünür faktör konsantrasyon gradyanı 1D difüzyon modeli yaklaşımı kullanılarak hesaplanır. </li><li> Phalloidin ve DAPI boyama kullanarak hücrelerin floresan görüntüleri çekmek. <ol><li> Phalloidin ile boyamadan önce hücreleri sabitleyin. <ol><li> 37 ° C &#39;de sıcak bir% 4 paraformaldehid. </li><li> hücreleri karşılamak için yeterli% 4 paraformaldehid ekleyin. hücreleri tutun10 dakika boyunca paraformaldehit. </li><li> 15 dakika her zaman için iki kez PBS ile durulayın. Hücreleri karşılamak için yeterli PBS kullanın. </li></ol></li><li> hücreler PBS çıkarın ve hücreleri karşılamak için yeterli su-geçirimli çözeltisi (PBS içinde% 0.1 Triton X-100) ilave edin. 10 dakika süre ile çözelti bırakın. </li><li> 5 dakika, her seferinde, PBS ile iki kez yıkanır. Hücreleri karşılamak için yeterli PBS kullanın. </li><li> hücreler PBS çıkarın ve 20 dakika çözeltisi (PBS içinde% 1 sığır serumu albümini) bloke ekleyin. </li><li> Bloklama çözeltisi, çıkarın ve her biri 5 dakika bir zaman boyunca PBS ile 2 kez yıkanır. Hücreleri karşılamak için yeterli PBS kullanın. </li><li> kullanılmadığı zaman, bu noktadan sonra, alüminyum folyo ile ışıktan hücreleri korur. hücreler PBS çıkarın ve 1 saat süreyle PBS içinde seyreltilmiş Phalloidin 488 1:50 ekleyin. </li><li> her bir yıkama için, 5 dakika süreyle PBS içinde 2 kez yıkayın. Hücreleri karşılamak için yeterli PBS kullanın. Sonra hücrelerden PBS kaldırmak. </li><li> 15 dakika boyunca hücreler PBS içinde 1000: DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol); 1 seyreltilmiştir. </li><li> Kaldır DAPI veher bir yıkama için 5 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkama hücreleri. </li><li> Son yıkama çıkarın ve hücreleri karşılamak için yeterli PBS ekleyin. Hücreler artık floresan mikroskop ile görüntülenebilir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+fabricated+in+poly+%28dimethylsiloxane%29+for+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices fabricated in poly (dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).</li>
<li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dynamic+temporal+and+spatial+concentration+gradients+using+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices.</a> Lab Chip. 4 (3), 164-167 (2004).</li>
<li>Darby, I., Hewitson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+Differentiation+in+Wound+Healing+and+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast Differentiation in Wound Healing and Fibrosis.</a> Int Rev Cytol. 257, 143-179 (2007).</li>
<li>Thampatty, B. P., Wang, J. H. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+study+fibroblast+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskel%22%5BJournal%5D)">A new approach to study fibroblast migration.</a> Cell Motil Cytoskel. 64, 1-5 (2007).</li>
<li>Discher, D., Mooney, D., Zandstra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+Factors%2C+Matrices%2C+and+Forces+Combine+and+Control+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells.</a> Science. 324, 1673-1677 (2009).</li>
<li>Zengel, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21592329">µ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies.</a> BMC Cell Biol. , (2011).</li>
<li>Chen, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15576901">Boyden Chamber Assay.</a> Methods Molec Biol. 2, 15-22 (2005).</li>
<li>Safferling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+revised%3A+A+novel+reepithelialization+mechanism+revealed+by+in+vitro+and+in+silico+models%5BTitle%5D)+AND+%22JCB%22%5BJournal%5D)">Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models.</a> JCB. 203 (4), 691-709 (2013).</li>
<li>Saadi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+concentration+gradients+in+2D+and+3D+environments+using+a+microfluidic+ladder+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Generation of stable concentration gradients in 2D and 3D environments using a microfluidic ladder chamber.</a> Biomed Microdevices. 9, 627-635 (2007).</li>
<li>Cammer, M., Cox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+Responses+by+Macrophages+to+a+Directional+Source+of+a+Cytokine+Delivered+by+a+Micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotactic Responses by Macrophages to a Directional Source of a Cytokine Delivered by a Micropipette.</a> Methods Mol Biol. , 125-135 (2014).</li>
<li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J Cell Sci. 99 (4), 769-775 (1991).</li>
<li>Wells, C. M., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+migration+using+the+Dunn+chemotaxis+chamber+and+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell migration using the Dunn chemotaxis chamber and time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol. , 31-41 (2005).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+migration+chip+for+chemotaxis-based+microfluidic+selection+of+heterogeneous+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li>
<li>Wright, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+open+microfluidic+devices+for+chemotaxis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">On-chip open microfluidic devices for chemotaxis studies.</a> Microsc. Microanal. 18 (04), 816-828 (2012).</li>
<li>Adler, M., Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oxygen+gradients+with+arbitrary+shapes+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of oxygen gradients with arbitrary shapes in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 10 (3), 388-391 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+devices%3A+New+tools+for+studying+cancer+and+cancer+stem+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration.</a> Biomicrofluidics. 5 (1), 013412(2011).</li>
<li>Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chambers+for+cell+migration+and+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Tech%3A+Rev+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chambers for cell migration and neuroscience research.</a> Microfluid Tech: Rev Protoc. , 167-177 (2006).</li>
<li>Tang, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTang%2C+SK+%22Basic+microfluidic+and+soft+lithographic+techniques.+Optofluidics%3A+Fundamentals%2C+Devices+and+Applications%22">Basic microfluidic and soft lithographic techniques. Optofluidics: Fundamentals, Devices and Applications</a>. Fainman, Y., Lee, L., Psaltis, D., Yang, C. , McGraw-Hill, 2010. (2010).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+multicompartment+device+for+neuroscience+research%29%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microfluidic multicompartment device for neuroscience research).</a> Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).</li>
<li>Aidelberg, G., Goldshmidt, Y., Nachman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+Device+for+Studying+Multiple+Distinct+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains.</a> JoVE. (69), (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bizim mikrokanal odası büyüme faktörleri ve kimyasal çekici yanıt olarak, hücre göçü hızının belirlenmesi ve bir polimer matristen bir ilacın difüzyon oranını ölçmek de dahil olmak üzere amacıyla, bir çok kullanılabilir. Hücrelerin büyümesine ve odanın bir ucunda, bir kemoatraktanttır yerleştirmek için mikrokanal bölmesini kullanmak mümkündür. Hücreler kemoatraktan yanıt olarak büyür ve hücre göçü, hücre göçü oranını belirlemek üzere analiz edilebilir zaman atlamalı görüntü alınarak belirlenebilir. Bu yöntemin Örnek son...

Yara iyileşmesi, bağışıklık tepkileri ve embriyonik gelişim gibi hayati süreçlerin gerçekleşmesi için hücre göçünün gerçekleşmesi gerekir. Hücre göçü, hücreler ve komşu hücreler, hücre dışı matris ve çözünür kimyasal ipuçları (cezbedici veya kovucular) arasındaki etkileşimi içerir. Örnek olarak, yara iyileşmesi sürecinde, fibroblastlar, hücrelerin hücre dışı matris3'ü oluşturmak için kollajen sentezlemek üzere yaralanma bölgesine alındığı fibrogenez ve yara kasılmasında ayrılmaz bir rol oynar. Fibroblastların bir yara bölgesine göçünün arkasındaki çok sayıda mekanizma incelenmiştir ve bunlar farklı mekanik, fiziksel, elektriksel ve kemotaktik faktörleri içerir4. Fibroblastlar, büyüme faktörlerinin farklı konsantrasyon gradyanlarına özellikle iyi yanıt verir. Bu farklı büyüme faktörleri, doku rejenerasyonunu optimize etmek için birlikte çalışır5. Fibroblastların büyüme faktörü konsantrasyonlarına kemotaktik tepkisini gözlemlerken, fibroblastların yönlü göç paterni ve hedeflerine ulaşmak için kendilerini fiziksel engeller etrafında nasıl yönlendirdikleri incelenebilir. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, ilk olarak fibroblast büyümesinin fiziksel engeller tarafından yönlendirilerek izlenebileceği bir sistem geliştirmek ve ikinci olarak fibroblastların sistem boyunca gezinirken büyümesini modellemekti.
Şu anda, Boyden odası testi, hücrelerin göçünü ölçmek için en yaygın kullanılan sistemdir6. Boyden odası, her bir kuyucuğun kemoatraktanlı veya kemoatraktansız ortam içerebileceği iki odacıklı çok kuyulu bir plakadan oluşur7. Bir filtre membranı, her bir oyuktaki iki oda arasında gözenekli bir arayüz sağlar; Bu, hücrelerin aktif göç olmadıkça geçememesi için bir bariyer oluşturur. Tipik olarak, Boyden odası için, alt odaya bir kemoatraktan eklenir ve sistemin üst ve alt kuyular arasında bir gradyan oluşturmak üzere dengelenmesine izin verilir4. Boyden odası tahlili ile ilgili bir sorun, dik gradyanların, zarın yüzeyine dik olan tek bir eksen boyunca oluşmasıdır. Bu, üst ve alt kuyucuklar arasındaki kemoatraktan konsantrasyonundaki farkın, başlangıçta beklenenden daha düşük olmasına neden olur. Bu kısıtlama nedeniyle, Boyden odası testi, belirli hücre tepkilerini eğim ve konsantrasyon farkı gibi belirli gradyan özellikleriyle ilişkilendirmeyi zorlaştırır. Bu ölçümler olmadan, çok gradyanlı sinyal entegrasyonunu incelemek zordur.
Geleneksel Boyden odası testinin bazı kısıtlamalarını ele almak için, özelleştirilebilir konsantrasyon gradyanları oluşturmak üzere mikroakışkan testler geliştirilmiştir1. Mikroakışkan sistemler oluşturmak için standart yöntemler, litografik teknikler için temiz odalar gerektirir. Bu tekniklerin öğrenilmesi, özellikle standart bir sınıf ortamında zor olabilir. Bu nedenle, hücre göçünü ölçmek için temiz oda kullanmadan yapılabilecek bir hazne sistemi tasarladık. Sistemimizi kullanarak, tahlilin kuyuları tercih edilen bir boyuta ayarlanabilir ve özelleştirilmiş eğimin doğrusal bir konsantrasyon gradyanı üretilebilir. Bu, rastgele hareketten kemotaksisin doğru bir şekilde ölçülmesini sağlar. Tasarım, farklı kimyasal uyaranlara yanıt olarak hücre büyümesini modellemek için ucuz ve kullanımı kolay bir sistemdir.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silikon Elastomer Kiti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td>poli (dimetilsiloksan) silikon elastomer taban ve silikon elastomer kürleme maddesi içeren 2 parçalı kit</td></tr><tr><td>Akrilik Levhalar</td><td>US Plastik</td><td>44200</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Petri Kapları&nbsp;</td><td>Şahin&nbsp;</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Floresein izotiyosiyanat &ndash; dekstran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD20s-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz, Tip I, Düşük EEO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6013-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>Hücre ortamı bileşenleri</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serium</td><td>Fisher Scientific</td><td>16000036</td><td>Hücre ortamı bileşenleri</td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td>Hücre ortamı bileşenleri</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24384</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Hücre Görüntüleme Sistemi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AME3300</td><td>Zaman atlamalı görüntüler çekmek için kullanılan alet</td></tr><tr><td>Versa Laser</td><td>Universal Laser Systems, Inc.&nbsp;</td><td>Model numarası: VLS2.30</td><td>Plastik kesmek için kullanılan lazer kesici</td></tr></tbody></table>

Ölçme hücre göç bir Özelleştirilebilir odası

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Hücre göçü bağışıklık tepkilerinin, büyüme ve yara iyileşmesi önemli bir parçasıdır. Hücre göçü hücreleri, hücre-dışı matris ve çözünen ve çözünmeyen bir kimyasal faktörleri (örneğin, Kemoattraktantlar) arasındaki etkileşimleri içeren karmaşık bir süreçtir. Bu Boyden Chamber tahlilinde, bir bölücünün iki tarafında hücre sayımı yolu ile çalışma gibi hücrelerin göçünü ölçmek için standart yöntemler. Bu teknikler kullanımı kolay; Bununla birlikte, farklı uygulamalar için çok az bir geometrik değişiklik vardır. Bunun aksine, mikroakışkan cihazlar çözünür faktörlerin, 1, 2 özelleştirilebilir konsantrasyon gradyanı hücre göçü için kullanılabilir. Ancak, Mikroakiskan tabanlı deneyleri yapma yöntemleri öğrenmek için zor olabilir. Burada, kimyasal konsantrasyon gradyanı yanıt olarak hücre göçü ölçmek için hücre kültürü odaları oluşturmak için kolay bir yöntem tarif eder. Bizim cep mibütünleştirme oda yönteminin, çeşitli uygulamalar için, hücre göçü incelemek üzere farklı doğrusal konsantrasyon gradyanları oluşturabilir. Bu yöntem kullanımı nispeten kolaydır ve genellikle lisans öğrencileri tarafından gerçekleştirilir. Mikrokanal odası iyi bir Petri kabı içine nihai mikrokanal odasının şeklinde bir akrilik insert yerleştirerek oluşturuldu. Bundan sonra, poli (dimetilsiloksan) (PDMS) ekin üzerine döküldü. PDMS sertleşmeye bırakıldı ve daha sonra da ekleme uzaklaştırılmıştır. Bu, herhangi bir arzu edilen şekil ya da boyutta kuyu oluşturulması için izin verdi. Hücreler, daha sonra mikrokanal odasına ilave edilebilir ve çözünebilir maddeler arzu edilen maddenin bir agaroz blok ıslatılmasıyla kuyu birine eklenebilir. Agaroz blok kuyu birine ilave edilir ve zaman atlamalı görüntüler hücre göçü miktarını belirlemek amacıyla mikrokanal odasının alınabilir. Bu yöntemin varyasyonları bu yöntem HIG yapmak, belirli bir uygulama için yapılabilirhly özelleştirilebilir.

Şekil 2, hücre plakalanmıştır burada kanal, zıt uca yerleştirilen fetal sığır serumu gradyanı yanıt olarak kanal boyunca hücre ön hareketini gösterir. Hücre ön 48 saat (Şekil 2A), 72 saat (Şekil 2B), 96 saat (Şekil 2C), ve 120 saat (Şekil 2B) sonrası kaplama gösterilir. Hücre ön hareketi bu zaman atlamalı görüntüleri ile takip edildi ve göç mesafesi ve büyüme oranı MATLAB polyfit işlevi tarafından hesapl...

Bu protokol, aynı zamanda, bir polimer matrisi üzerinden bir ilacın difüzyon hızını belirlemek için kullanılabilir chemoattractants yanıt olarak hücre göçü ölçmek için özelleştirilebilir yöntemi göstermektedir.

Ölçme Hücre Göç Bir Özelleştirilebilir Odası

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...

Bu prosedürün genel amacı, kemotaktik ve kemorepülsif ajanların hücre göçü üzerindeki etkilerini incelemek için basit bir yöntem sunmaktır. Bu yöntem, farklı büyüme faktörlerinin yara iyileşmesi üzerindeki etkileri gibi hücre etkileşim alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, farklı uygulamalar için kolayca özelleştirilebilir olması ve her beceri seviyesindeki araştırmacı için kullanımının basit olmasıdır.Prosedürü, laboratuvarımdan lisans öğrencisi Aniqa Chowdhury ve lisansüstü öğrencisi Tyler Harvey gösterecektir. Başlamak için, mikro kanalın istenen şeklini içeren bir CAD dosyası oluşturun. Gerekli gradyanı elde etmek için kanalın genişliğini ve uzunluğunu ayarlayın.Burada, 2,254 cm²'lik kareler 0,127 cm genişliğinde bir kanal ile birbirine bağlanmıştır. Ardından, mikrokanalın uygun derinliğini oluşturmak için istenen kalınlıkta bir akrilik parça temin edin. Daha kalın levhaların kesilmesi zor olduğundan ve çok ince levhalar işlem sırasında kırılıp bükülebileceğinden, yaklaşık 1/16 inç genişliğinde bir akrilik levha idealdir.CAD dosyasını bir lazer kesim cihazına aktarın ve akrilik parçayı kesim yüzeyine yerleştirin. Ardından, üretici protokolüne uygun olarak hücreyi kesin. Yeni kesilmiş halter şeklindeki akrilik kesiti küçük bir Petri kabına yerleştirin ve ihtiyaç duyulana kadar üzerini kapatın.Bir tartım kabına, on birim elastomer bazla bir birim kürleme ajanı ekleyin ve bir mikropipet kullanarak beş dakika boyunca karıştırın. Karışımı bir vakum odasına aktarın ve PDMS içindeki hapsolmuş hava kabarcıklarını gidermek için 30 dakika boyunca vakum uygulayın. İşlem tamamlandığında vakumu kapatın ve tartım kabını çıkarın.Gazı alınmış PDMS'i küçük bir Petri kabındaki halter şeklinde akrilik kesimin üzerine dökün. PDMS'in ek parçayı tamamen kapladığından emin olun. PDMS'in oda sıcaklığında en az 18 saat kürlenmesine izin verin, ardından bir skalpel ile akrilik parçanın etrafındaki PDMS'i dikkatlice kesin ve ek parçayı çıkarın.Standart bir hücre kültür kabininde, mikrokanal haznesini özellik tarafı yukarı gelecek şekilde bir Petri kabına yerleştirin ve tamamen %70 etanol ile kaplayın. Ardından kabini kapatın ve UV ışığını açın. Hazneyi bir ila iki saat boyunca UV ışığına maruz bırakın.Pozlamanın ardından, laminar akış kabinini açın ve akışın yeniden tesis edilmesi için 15 dakika bekleyin. Ardından, %70 etanolü uzaklaştırın ve odacıkları steril PBS ile iki kez yıkayın. Her yıkama işlemi için 1 mL PBS kullanın.Son yıkamanın ardından PBS'yi uzaklaştırın ve kapaklar açık şekilde odacıkların gece boyunca kurumasına izin verin. Test edilecek hücre tipini hasat edin ve 100 µL hücre süspansiyonunu 400 µL %0,4 trypan blue ile karıştırıp nazikçe harmanlayın. Bu çözeltiden 100 µL'yi, cam lamel altındaki her iki odacığı nazikçe doldurarak hemositometreye uygulayın.Hemositometredeki ızgaraya odaklanmak için 10x objektifli bir mikroskop kullanın. Ardından, hemositometredeki 16 kareden oluşan dört setin tamamındaki canlı, bölünmemiş hücreleri saymak için el tipi bir sayaç kullanın. Toplam hücre sayısını dörde bölün ve hücre süspansiyonunun mililitresindeki hücre sayısını elde etmek için bu sayıyı 50.000 ile çarpın.Bu hesaplamaya dayanarak, her bölmedeki bir kuyucuğa 2500 hücre ve 100 µL besiyeri ekleyin. Hücrelerin bölmede 60 dakika boyunca beklemesine izin verin, ardından ek besiyeri ekleyin. Başlamak için, suya agaroz ekleyin ve çözeltiyi bir mikrodalga fırında bir dakika boyunca veya agaroz tamamen çözünüp çözelti berraklaşana kadar ısıtın.Çözeltiyi bir Petri kabına dökmeden önce 15 ila 30 saniye boyunca soğumaya bırakın. Kabarcıkları gidermek için Petri kabını bir vakum kamarasına yerleştirin ve agarozun 30 dakika boyunca vakum altında katılaşmasını sağlayın. Katılaştıktan sonra, Petri kabından bir bistüri yardımıyla iki milimetre çarpı iki milimetre çarpı iki milimetre boyutlarında bir agaroz küpü kesin.Küpü, istenen konsantrasyondaki kemotaktik faktörü içeren bir çözeltiye tamamen daldırın ve agaroz bloğunu oda sıcaklığında gece boyunca bekletin. Ardından, kemotaktik faktör içeren agaroz bloğunu mikrokanal odasının uzak ucuna yerleştirin. Polistiren mikroboncuklar veya odadaki mikroskobik bir kusur gibi bir işaretleyici kullanın.Hücrelerin göreceli başlangıç konumunu belirlemek için görüntüleme yazılımını kullanarak hareket eden hücre ön safhasının 12 saat boyunca her saat başı zaman ayarlı görüntülerini alın. Burada gösterilen görüntü serisi, kanalın karşı ucuna yerleştirilen fetal bovine serum gradyanına yanıt olarak bir hücre ön safhasının kanal boyunca hareketini belgelemektedir.Göç mesafesi, büyüme cephesinin cihazdaki mikroskobik bir kusurdan olan uzaklığına göre ölçülmüştür. Bu ölçümler sonucunda, ortalama hücre cephesi hızının saatte 13,4 mikrometre olduğu belirlenmiştir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik dört saatte tamamlanabilir; buna ek olarak PDMS'nin kürleşmesi için 18 saatlik bir bekleme süresi ve zaman ayarlı görüntüleme için ek 12 saat gerekmektedir.Geliştirilmesinin ardından bu teknik, laboratuvar deneyimi az olan lisans öğrencileri de dahil olmak üzere farklı beceri seviyelerindeki araştırmacıların, in vitro yara iyileşmesi ve hücre göçünü kolayca incelemelerinin yolunu açmıştır. Bu prosedürü uygularken, bir mikrokanal odasının başarılı bir şekilde üretilmesini sağlamak için akrilik ekini PDMS kalıptan dikkatlice çıkarmanız gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, farklı kimyasal uyaranlara yanıt olarak hücre göçünü incelemek için basit bir mikrokanal odasının nasıl üretileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu prosedürün ardından, hücre göçü üzerindeki etkilerini incelemek amacıyla birden fazla çözünür kimyasal gradyan, substratlar, sıvı kayma gerilmesi ve elektrik alanları gibi diğer uyaranlar çalışılabilir. Lazer kesicilerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini; bu prosedürü gerçekleştirirken uygun eğitim almak ve kişisel koruyucu donanım kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

a-customizable-chamber-for-measuring-cell-migration

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kanser kök hücre göçü araştırılması için bir bölme oluşturan mikroakışkan cihaz tarif edilmektedir. Bu yeni platform canlı hücresel mikroçevrede oluşturur ve canlı hücre lokomosyon mikroskobik görselleştirme sağlar. Son derece hareketli kanser hücrelerinin potansiyel olarak daha etkin gelecekteki tedaviler neden agresif infiltrasyon moleküler mekanizmaları, çalışma izole edilmiştir.

Bölümlere Mikroakışkan Cihazlar ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma Kanser Kök Hücre Göç Değerlendirilmesi

Phagokinetic motilite parça tahlil hücre hareketi değerlendirmek için kullanılan bir yöntemdir. Özellikle, tahlil, bir nicel bir şekilde, zaman içinde chemokinesis (rastgele hücre hareketliliğinin) ölçer. Tahlil, koloidal altın kaplama lameller üzerine onların hareket ölçülebilir bir parça oluşturmak için hücrelerinin yeteneği yararlanır.

Phagokinetic Parça Motilite Testi sayesinde Hücre Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

Canlı hücre göç çalışmaları için bir mikroskop odasında yapıştırıcı ve çözünür degradelerin montajı için bir yöntem tarif edilmiştir. Mühendislik ortamı çözümü degradelerle antifouling yüzeyleri ve yapıştırıcı parçaları birleştirir ve bu nedenle bir rehberlik ipuçları göreli önemini belirlemek için izin verir.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Tek boyutlu bir kapalı mikro hücrelerin spontan göç incelemek için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöntem, mikrofabrike kanalları yararlanır ve tek bir deneyde, farklı koşullar altında hücrelerin büyük sayıda göçünü incelemek için kullanılabilir.

Microfabricated Kanallar Hücre Göç Çalışması

Erken endotel hücre (EEC) göçünün araştırılması, bazı hastalıkların patofizyolojisini anlamak ve terapötik müdahale için potansiyel olarak yeni stratejiler belirlemek için önemlidir. Aşağıdaki protokol, EEC'nin araştırılması için uyarlanmış hücre göçünü değerlendirmek için teknikleri açıklamaktadır.

Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi

Bu çalışmada cep işgali ve geçiş analizi için iki farklı yöntem raporları: Boyden odası tahlil ve vitro video mikroskobu tabanlı yara iyileşmesi tahlil. Bu iki deney protokollerde açıklanmış ve kendi yararları ve dezavantajları karşılaştırılır.

Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

Bu iletişim kuralı hücreleri hücre microenvironment koruma sırasında bir üç boyutlu ortamda göç ve işgal yeteneklerini ölçmek için kullanılabilir bir ters dikey işgali tahlil açıklar. Bu tahlil nadir ve/veya hassas hücreler için uygundur.

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Geçerli protokol kanser hücre göç ve gerçek zamanlı olarak tek bir platformda işgali araştırma, kolayca tekrarlanabilir ve zamanı verimli bir seçenek hücre hareketlilik ve morfoloji çalışmaya sağlayan entegre bir yöntemini açıklar.

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Granül hidrojellerin arayüzü içinde ve içine 3D hücre göçünün kantitatif değerlendirmesi için bir protokol burada sunulmaktadır.

Granül Hidrojel Biyomalzemeler İçinde ve İçine Üç Boyutlu Hücre Migrasyonunun Ölçülmesi

Vezikül serbest kinetiği ölçmek için yeteneği nörotransmisyon bazı temel içgörü sağlamak yardımcı olabilir. Burada kırmızı floresan boya FM 4-64 etiketli veziküller presinaptik hipokampal nöron kültürlerinde vezikül serbest hızını ölçmek için gerçek zamanlı görüntüleme kullanılır.

Nöronlar FM Etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz

Öğrenin, hücre göçünü kemotaktik ajanlara yanıt olarak ölçmek için özelleştirilebilir bir mikrokanal yöntemi kullanarak. Bu teknik, yara iyileşmesi ve büyüme faktörleri etkilerini in vitro çalışmalarda araştırmacılara basit ve erişilebilir bir araç sunar.

Ölçme Hücre Göç Bir Özelleştirilebilir Odası

Daha fazla video keşfet