Ölçme Hücre Göç Bir Özelleştirilebilir Odası

Bu prosedürün genel amacı, kemotaktik ve kemorepulsif ajanların hücre göçü üzerindeki etkilerini incelemek için basit bir yol sağlamaktır. Bu yöntem, farklı büyüme faktörlerinin yara iyileşmesi üzerindeki etkileri gibi hücre etkileşim alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, farklı uygulamalar için kolayca özelleştirilebilir olması ve tüm beceri seviyelerindeki araştırmacılar için kullanımının basit olmasıdır.

Prosedürü gösterenler, bir lisans öğrencisi olan Aniqa Chowdhury ve laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Tyler Harvey olacak. Başlamak için, mikro kanalın istenen şekline sahip bir CAD dosyası oluşturun. Gerekli gradyanı elde etmek için kanalın genişliğini ve uzunluğunu ayarlayın.

Burada 2.254 santimetre kare, 0.127 santimetre genişliğinde bir kanalla birbirine bağlanıyor. Daha sonra, mikrokanalın uygun derinliğini oluşturmak için istenen kalınlıkta bir akrilik parçası elde edin. Daha kalın tabakaların kesilmesi zor olduğundan ve çok ince tabakaların işlem sırasında kırılabileceğinden veya bükülebileceğinden, yaklaşık bir inçin on altıda biri kadar bir akrilik levha genişliği idealdir.

CAD dosyasını bir lazer kesim aparatına aktarın ve akrilik parçayı kesme yüzeyine yerleştirin. Ardından, üreticinin protokolüne göre hazneyi kesin. Taze kesilmiş halter şeklindeki akrilik kesiği küçük bir Petri kabına yerleştirin ve ihtiyaç duyulana kadar üzerini kapatın.

Bir tartım teknesinde, bir kısım kürleme maddesi ile birlikte bir elastomer tabanın on parçasını ekleyin ve beş dakika boyunca bir mikro pipet kullanarak karıştırın. Karışımı bir vakum odasına aktarın ve PDMS'de sıkışan hava kabarcıklarını gidermek için 30 dakika boyunca bir vakum çekin. İşiniz bittiğinde vakumu kapatın ve tartı teknesini çıkarın.

Gazı alınmış PDMS'yi küçük bir Petri kabında halter şeklindeki akrilik bir oyuğun üzerine dökün. PDMS'nin ek parçayı tamamen kapladığından emin olun. PDMS'nin oda sıcaklığında en az 18 saat kürlenmesine izin verin, ardından PDMS'yi akrilik parçanın etrafından bir neşterle dikkatlice kesin ve eki çıkarın.

Standart bir hücre kültürü kabininde, mikrokanal odasını bir Petri kabına yerleştirin, yüzü yukarı bakacak şekilde ve tamamen %70 etanol ile kaplayın. Ardından kaputu kapatın ve UV ışığını açın. Hazneyi bir ila iki saat UV ışığına maruz bırakın.

Maruz kaldıktan sonra, laminer akış başlığını açın ve akış başlığının akışı yeniden sağlaması için 15 dakika bekleyin. Daha sonra,% 70 etanolü çıkarın ve odaları steril PBS ile iki kez yıkayın. Her yıkama için bir mililitre PBS kullanın.

Son yıkamanın ardından PBS'yi çıkarın ve kapaklar kapalıyken haznelerin gece boyunca kurumasını bekleyin. Test edilecek hücre tipini hasat edin ve 400 mikrolitre tripan mavisine 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve hafifçe karıştırın. Bu solüsyonun 100 mikrolitresini hemositometreye uygulayın ve her iki odayı da cam örtü kaymasının altına hafifçe doldurun.

Hemositometre üzerindeki ızgaraya odaklanmak için 10x objektifli bir mikroskop kullanın. Ardından, hemositometredeki 16 karelik dört setin tümündeki canlı, sürdürülemeyen hücreleri saymak için bir el çetele sayacı kullanın. Toplam hücre sayısını dörde bölün ve mililitre hücre süspansiyonu başına hücre sayısını elde etmek için bu sayıyı 50.000 ile çarpın.

Bu hesaplamaya dayanarak, her odadaki bir kuyucuğa 2500 hücre ve 100 mikrolitre ortam ekleyin. Hücrelerin haznede 60 dakika oturmasına izin verin, ardından ek ortam ekleyin. Başlamak için, suya agaroz ekleyin ve çözeltiyi bir mikrodalgada bir dakika veya agaroz tamamen eriyene ve çözelti berraklaşana kadar ısıtın.

Bir Petri kabına dökmeden önce çözeltinin 15 ila 30 saniye soğumasını bekleyin. Kabarcıkları çıkarmak için Petri kabını bir vakum odasına yerleştirin ve agarozun 30 dakika vakum altındayken katılaşmasına izin verin. Katılaştıktan sonra, Petri kabından bir neşter ile iki milimetre x iki milimetre x iki milimetre küp agaroz kesin.

Küpü, istenen kemoterapi taktik faktörü konsantrasyonunu içeren bir çözeltiye tamamen batırın ve agaroz bloğunu gece boyunca oda sıcaklığında ıslatın. Ardından, kemoterapi taktik faktörünü içeren agaroz bloğunu mikrokanal odasının en ucuna yerleştirin. Polistiren mikro boncuklar veya haznedeki mikroskobik bir kusur gibi bir işaretleyici kullanın.

Hücrelerin göreli başlangıç konumunu belirlemek için. 12 saat boyunca her saat başı hareketli hücre cephesinin hızlandırılmış görüntülerini almak için görüntüleme yazılımını kullanın. Burada gösterilen görüntü serisi, kanalın karşı ucuna yerleştirilen fetal sığır serumu gradyanına yanıt olarak bir hücre cephesinin kanal boyunca hareketini belgelemektedir.

Migrasyon mesafesi, büyüme cephesinin cihazdaki mikroskobik bir kusurdan olan mesafesine göre ölçüldü. Bu ölçümlerden, ortalama hücre ön hızının saatte 13.4 mikrometre olduğu bulundu. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, PDMS'nin kürlenmesi için ek 18 saatlik bekleme süresi ve hızlandırılmış görüntüleme için ek 12 saat ile dört saat içinde tamamlanabilir.

Geliştirildikten sonra, bu teknik, yara iyileşmesini ve hücre göçünü in vitro olarak kolayca keşfetmek için çok az laboratuvar deneyimi olan lisans öğrencileri de dahil olmak üzere farklı beceri seviyelerindeki araştırmacıların yolunu açtı. Bu prosedürü denerken, bir mikrokanal odasının başarılı bir şekilde üretilmesini sağlamak için akrilik eki PDMS kalıbından dikkatlice çıkarmayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, farklı kimyasal ipuçlarına yanıt olarak hücre göçünü incelemek için basit bir mikrokanal odasının nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bu prosedürü takiben, hücre göçü üzerindeki etkilerini incelemek için çoklu çözünür kimyasal gradyanlar, substratlar, sıvı şeffaf ve elektrik alanları gibi diğer ipuçları incelenebilir. Lazer kesicilerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun eğitim almak ve kişisel koruyucu ekipman kullanmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.