Name: Pluripotent Verimli Farklılaşma NKX6-1 için Kök Hücreler + Pankreas Progenitörler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Öğrenin, insan çok yönlü kök hücrelerini NKX6.1 pozitif pankreas progenitörlerine dönüştürmek için dört aşamalı farklılaşma protokolünü. Bu yöntem, diyabet tedavisi ve ilaç keşfi için yüksek verimli hücre üretimi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu yazının Toronto Genel ve Batı Vakfı ve Banting ve En İyi Diyabet Merkezi-Üniversite Sağlık Ağı Lisans Ödülü fon tarafından desteklenmiştir.

Çözümler ve Medya 1. Hazırlık NOT: steril bir ortamda hücre kültürü için tüm medya hazırlayın. Ortam yapılmış ve hemen kullanılmalıdır. Reaktif bilgilerini malzemeler Tablo l&#39;de verilmiştir. <ol><li> farklılaşma Medya <ol><li> % 1 glutamin, 2 uM CHIR 99.021, 100 ng / ml Aktivin A, 10 4 M MTG ile RPMI ortamı: Gün 0 Farklılaşma Ortam hazırlayın. </li><li> % 1 glutamin, 100 ng / ml Aktivin A, 10 4 M MTG, 5 ng / ml bFGF, 50 ug / ml askorbik asit ile RPMI ortamı: Gün 1-2 Farklılaşma ortamı hazırlayın. </li><li> % 1 glutamin,% 1 B27, 10 4 M MTG, 0.75 uM Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10 ile RPMI ortamı: Gün 3-5 Farklılaşma ortamı hazırlayın. </li><li> Gün 6-7 Farklılaşma ortamı hazırlayın: DMEM,% 1 glutamin,% 1 B27, 50 ug / ml askorbik asit, 50 ng / ml FGF10, 0.25 uM SANT-1, 2 uM retinoik asit, 50 ng / ml Noggin ile. NOT: RetinoikAsit geçen ortama ilave edilmesi gereken ve ortam oksidatif bozunmasını 15 önlemek için ışıktan korunmalıdır. </li><li> Günlük 8-12 Farklılaşma ortamı hazırlayın: DMEM,% 1 glutamin,% 1 B27, 50 ug / ml askorbik asit, 50 ng / ml noggin, 100 ng / ml hEGF, 10 mM nikotinamid. </li></ol></li><li> PBS içinde% 10 FBS, eksi kalsiyum ve magnezyum: FACS tamponu hazırlayın. </li></ol> 2. HESC Farklılaşma NOT: HESC, çözülmüş geçirildi ve bFGF 16 ile desteklenmiş bir KOSR tabanlı medya varlığında ışınlanmış fare embriyonik fibroblast genişletilir. Hücreler% 80-95 confluency ulaştığında hESC farklılaşma için hazırız. Bu zamanda koloniler tanımlanmış sınırlar ve bir &quot;domelike &#39;yapısı (Şekil 1A) ile büyük olmalıdır. Tüm hücre kültürü düz tabanlı,% 0.1 jelatin ile kaplanmış doku kültür levhaları muamele gerçekleştirilir. Tipik olarak, hücreler 6 yetiştirilen veyasırası ile, 2 ml veya 1 ml&#39;lik ortam hacminde 12 oyuklu plakalar. <ol><li> 0. günde, Gün 0 Farklılaşma Medya ile KOSR tabanlı medya değiştirerek farklılaşma başlar. </li><li> gün 1 ve 2, yavaşça aspire önce tek tabaka herhangi bir ölü hücreleri çıkarmak için plakayı sallayın. Gün 1-2 Farklılaşma Medya ile değiştirin. </li><li> 3 gün, flow sitometri için hasat hücreleri. Hücreler% 90&#39;dan fazla CXCR4 + / CD117 + ifade ederse, 2.4 adıma geçin. </li><li> gün 3 ve 5, nazikçe önce aspire için tek tabaka herhangi bir ölü hücreleri çıkarmak için plakayı sallayın. Gün 3-5 Farklılaşma Medya ile değiştirin. </li><li> gün 6 ve 7, Gün 6-7 Farklılaşma Medya ile değiştirin. </li><li> gün 8, 10 ve 12 üzerinde, Gün 8-12 Farklılaşma Medya ile değiştirin. </li><li> günde 13, akış hasat hücreleri sitometri PDX1 ve NKX6-1 ifadesini belirler. </li></ol> Sitometrisi Analizi 3. Hasat Hücreleri <ol><li> olan hücreleri ayırmaküreticinin protokolü ve 3 dakika süreyle 37 ° C&#39;de inkübe e göre 1x ticari tripsin çözeltisi. </li><li> 30 ul DNaz I ile 1000 ul FACS Tampon tek hücreleri ticari tripsin çözüm çıkarın ve tekrar süspansiyon </li><li> Bir mikrosantrifüj tüp 35 mikron naylon örgü hücre süzgeç ve transfer kullanarak filtre hücreleri. </li><li> 5 dakika boyunca 455 xg&#39;de Santrifüj hücreleri. Canlı veya sabit boyama için hücreleri hazırlayın. </li></ol> Akım Sitometrisi 4. Boyama <ol><li> Günde 3 canlı boyama hazırlık Akış <ol><li> 1000 ul FACS Tampon yeniden süspanse hücreleri. Aktarım 200 ul (her ikisi de lekesiz ve lekeli örnekler için), 96 oyuklu bir plaka, iki kuyulara (yaklaşık 1-3 x 10 5 hücre). </li><li> 2 dakika süreyle 931 xg&#39;de plaka santrifüj. plakayı ters çevirerek süpernatantı. </li><li> APC ve CD117: Primer-konjuge antikor, CXCR4 ile Leke PE 3 için (MALZEMELERİNİN Tablo bakınız)Oda sıcaklığında 0 dak ışıktan korunması. </li><li> 2 dakika süreyle 931 xg&#39;de plaka santrifüj. plakayı ters çevirerek süpernatantı. </li><li> 100 ul FACS Tampon yeniden süspanse örnekleri. </li><li> 2 dakika süreyle 931 xg&#39;de plaka santrifüj. plakayı ters çevirerek süpernatantı. </li><li> 1 ml mikro test tüpleri ya da 5 mL&#39;lik yuvarlak dipli bir tüpler 300-500 ul FACS tampon toplam hacimde her bir örnek ve transfer yeniden süspanse edin. </li><li> 17 akış sitometresinde Run örnekler. Numuneler hemen çalıştırmak mümkün değilse, 4 ° C&#39;de mağaza ışıktan koruyarak. </li></ol></li><li> Günde 13 sabit boyama hazırlık Akış <ol><li> 4 ° C&#39;de 24 saat süre ile, ticari sabitleme / permeabilizasyon çözeltisi içinde hücre pelletini. </li><li> 5 dakika boyunca 455 xg&#39;de santrifüjleyin. 400 ul Perm / Wash çözeltisi içinde süspanse. </li><li> Tw için numune (yaklaşık 0.5-1 x 10 6 hücre) 200 ul aktarın(IgG kontrol ve PDX1 / NKX6-1 boyama için), 96 oyuklu plakanın O kuyu. 2 dakika süreyle 931 xg&#39;de santrifüj. </li><li> Anti-PDX1 ve anti-NKX6-1 birincil veya izotop kontrol antikorları ihtiva eden 100 ul Perm / Wash çözeltisi içinde hücre pelletleri yeniden süspanse edin (Malzeme Tablo). 4 ° C&#39;de bir gece boyunca inkübe edilir. </li><li> 2 dakika süreyle 931 xg&#39;de plaka santrifüj. plakayı ters çevirerek süpernatantı. 100 ul Perm / Wash çözeltisi içinde süspanse örnekleri. </li><li> 2 dakika süreyle 931 xg&#39;de plaka santrifüj. plakayı ters çevirerek süpernatantı. </li><li> ışıktan korunan, 1 saat boyunca, oda sıcaklığında, ikincil antikorlar ihtiva eden 100 ul Perm / Wash örnekleri yeniden süspanse edin. </li><li> 2 dakika süreyle 931 xg&#39;de plaka santrifüj. plakayı ters çevirerek süpernatantı. </li><li> 100 ul Perm / Yıkama Çözeltisi yeniden süspanse örnekleri. </li><li> 2 dakika süreyle 931 xg&#39;de plaka santrifüj. plakayı ters çevirerek süpernatantı. </li><li> temsilciadım 4.2.9 ve 4.2.10 yemek. </li><li> 1 ml mikro test tüpleri ya da 5 mL&#39;lik yuvarlak dipli bir tüpler 300-500 ul FACS tampon toplam hacimde her bir örnek ve transfer yeniden süspanse edin. </li><li> 17 akış sitometresinde Run örnekler. Numuneler hemen çalıştırmak mümkün değilse, 4 ° C&#39;de mağaza ışıktan koruyarak. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Canadian Diabetes Association. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes">http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes</a> (2016).</li>
<li>Cogger, K., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+cell+replacement+therapies+for+the+treatment+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes.</a> Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+NKX6-1%2B+pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Functional+Human+Pancreatic+beta+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. , (2014).</li>
<li>Kroon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+endoderm+derived+from+human+embryonic+stem+cells+generates+glucose-responsive+insulin-secreting+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo.</a> Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li>
<li>Gouon-Evans, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-4+is+required+for+hepatic+specification+of+mouse+embryonic+stem+cell-derived+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).</li>
<li>Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-promoter-factor+1+is+required+for+pancreas+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice.</a> Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).</li>
<li>Pan, F. C., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+organogenesis%3A+from+bud+to+plexus+to+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).</li>
<li>Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nkx6+transcription+factors+and+Ptf1a+function+as+antagonistic+lineage+determinants+in+multipotent+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors.</a> Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotent+progenitor+domain+guides+pancreatic+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis.</a> Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).</li>
<li>Sander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Nkx6.1+lies+downstream+of+Nkx2.2+in+the+major+pathway+of+beta-cell+formation+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas.</a> Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).</li>
<li>Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+stability+in+stem+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid stability in stem cell cultures.</a> Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).</li>
<li>Korytnikov, R., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+polyhormonal+and+multipotent+pancreatic+progenitor+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells.</a> Methods. , 56-64 (2016).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+signaling+through+TGFbeta+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Development. 138 (5), 861-871 (2011).</li>
<li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+system+for+production+of+functional+pancreatic+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 7 (5), e37004(2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Başarıyla in vitro hPSCs gelen NKX6-1 + pankreas progenitörlerin üreten pankreatik gelişimi sırasında önemli gelişim aşamaları yöneten belirli bir sinyal yollarının doğru düzenlenmesini kapsayan hPSCs yüksek kalitede kültürleri ve yönlendirilmiş farklılaşma kullanımına dayanır. Daha önce aşağıdaki hususlar yapılmalıdır etkin NKX6-1 üretimi sağlamak için, 3 gösterildiği gibi bu protokol hPSC hatlarının çeşitli çapında NKX6-1 sağlam ekspresyonunu indüklemek için kullanılabilir, ...

Diyabet prevalansı artmakta ve Kanada Diyabet Derneği göre, tip 1 diyabet (T1D) 1 olan bu bireylerin% 5-10 ile, Kanada&#39;da 11 milyon kişi diyabet ya da prediyabetik olduğu tahmin edilmektedir. T1D&#39;nin Langerhans adacıklarında içinde bulunan insülin üreten β hücrelerinin yok neden olduğu bir otoimmün hastalıktır. Şu anda, T1D ile yaşayan bireylerin insülin 2 eksojen kaynakları gerektirir. insülin tedavisi gelişmelere rağmen, T1D hastalarının kan şekeri düzenleyen zor bir zaman var ve hipo ve hiperglisemi hem acı çekmeye devam devam ediyor. Bir tedavi umut verici şekilde, tip 1 diyabetin bölgesindeki normogliseminin in vivo ve in vitro 3 hem β hücreleri üretmek insülin sınırsız kaynağı oluşturmak için kullanılabilecek insan embriyonik kök hücreleri (hESC) kullanılmasıdır geri <sclass = &quot;xref&quot;&gt; 4, 5, 6, 7 kadar. HESC Farklılaşan ß-benzeri hücreler mümkün tip 2 diyabet için yeni tedavi hedeflerinin belirlenmesi için izin in vitro diyabet eğitim ve T1D&#39;nin hastalara transplantasyon için hücrelerin sağlamak için yapabiliriz. In vitro hESC insülin üreten hücrelerin üretilmesi en başarılı girişim pankreas gelişimi 4, 5 sırasında meydana gelen embriyonik olayları özetlemek etmektir. Bu doğru gelişen pankreas kilit aşamaları modellemek için farklı sinyal yollarının manipülasyonu içerir. Pankreas gelişimi CXCR4 ve CD117 (c-kit) 8, 9 sentezlenmesi ile karakterize kesin endoderm, indüksiyonu ile başlar. definit kesin düzenlemeive endoderm organizasyonu daha sonra ön-arka ve ventral-dorsal desenlendirme uğrar bağırsak tüpü, oluşumu için gereklidir. Dorsal ve ventral pankreas tomurcukları pankreas gelişimi 10 için gerekli olan pankreas ve duodenum homeobox geni (Pdx1), ifade arka foregut bölgesinden çıkmaktadır. Dorsal ve ventral tomurcukları sigorta ardından geniş epitel biçimlenme ve genişleme 11 uğrar pankreası oluşturmak için. Endokrin ve ekzokrin soy bağlılık ifade eden multipotent progenitör hücreleri (MPCs) üretimi eşlik eder, diğerlerinin yanı sıra, transkripsiyon Pdx1, Nkx6.1 ve Ptf1a 12, 13 faktörleri. Endokrin ve duktal hücreleri olacak MPCs Ptf1a ifadesini düşürürken Nkx6-1 ifade etmeye devam. Bunun aksine, ekzokrin kökenli hücreler expressio kaybedersinizNkx6-1 N ve Ptf1a ifade 12 korur. Transkripsiyon faktörü Nkx6-1, özellikle hücre kaynaşmasına karşı endokrin progenitör hücrelerin farklılaşması sırasında, pankreas gelişiminde önemli bir rol oynar. Daha önce pankreas gelişimi 14 sırasında β hücrelerinin bozulmuş oluşumuna Nkx6-1 sonuçları, silme açıklandığı gibi,. Bu nedenle, in vitro ve in vivo olarak ensülin üreten β hücrelerin üretilmesi Nkx6-1 etkin indüksiyon gerektirir. Biz son zamanlarda verimli hPSCs gelen PDX1 + / NKX6-1 + pankreas atalarıdır üretmek için bir protokol geliştirmiştir. Bu hPSC türetilen pankreas ataları bağışıklık yetersizliği olan farelere 3 transplantasyon sırasında olgun β hücreleri oluşturur. 1) kesin endoderm indüksiyon: farklılaşma protokolü 4 ayrılabilir karakteristik aşamaları2) arka foregut desenleme, 3) pankreas şartname ve 4) NKX6-1 indüksiyon. Burada yönettiği farklılaşma her adımı ayrıntılı bir açıklama sağlar.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Medya ve sitokinler< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Tiogliserol (MTG)</td> <td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Aktivin A</td> R<td>& D</td><td>338-AC/CF&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Askorbik Asit</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Ek Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>12587-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Tamponu</td><td>BD Bioscience</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>BD Perma/Yıkama tamponu, 1x</td><td>BD Bioscience</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>CHIR990210</td><td>Tocris</td><td>4423a</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium (DMEM)</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>VWR</td><td>80510-412 & nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorfin</td><td>Sigma</td><td>P5499</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Ar-Ge D</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Wisent</td><td>88150</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R& D</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>Domuz derisinden elde edilen jelatin</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Nikotinamid</td><td>Sigma</td><td>NO636</td><td></td></tr><tr><td>NOGGIN</td><td>R& D</td><td>3344-NG</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Retinoik asit</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Orta 1640</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>SANT-1</td><td>Tocris</td><td>1974</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Ekspres Enzim (1x), fenol kırmızısı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Akış sitometrisi için antikorlar (çalışma dilüsyonları)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD117 PE (1:100)</td><td>Life Technologies</td><td>CD11705</td><td></td></tr><tr><td>CXCR4 APC (1:50)</td><td>BD&nbsp; Biyobilim</td><td>551966</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Anti-Fare IgG (H + L), Alexa Fluor 647 eşlenik (1:400)</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A-31571</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Anti-Keçi IgG (H + L), Alexa Fluor 488 (1:400) &nbsp;</td><td>Jackson İmmüne Araştırma Laboratuvarları A.Ş.</td><td>705-546-147</td><td></td></tr><tr><td>İzotip Kontrol Faresi IgG&nbsp;</td><td>Jackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları A.Ş. &nbsp;</td><td>015-000-003</td><td></td></tr><tr><td>İzotip Kontrolü Keçi IgG R</td><td>& D&nbsp; &nbsp;</td><td>AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>NKX6-1 (1:2.000)</td><td>DSHB</td><td>F55A10</td><td></td></tr><tr><td>PDX1 (1:100)</td><td>R& D</td><td>AF2419</td><td></td></tr></tbody></table>

pluripotent verimli farklılaşma nkx6-1 için kök hücreler<sup&gt; +</sup&gt; pankreas progenitörler

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotent kök hücreleri, kendine yenilemek ve bunların çalışma ve diyabet gelecekteki tedavisi için kullanılabilir pankreatik progenitör hücrelerinin üretimi için cazip bir kaynak yapma, birden fazla soy ayırt yeteneğine sahiptir. Bu makale, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) pankreas progenitör hücreleri üretmek için tasarlanmış bir dört aşamalı farklılaşma protokolü özetliyor. Bu protokol, insan pluripotent kök hücre (hPSC) hatları, bir dizi uygulanabilir. pankreatik progenitör hücreleri üretmek için alınan yaklaşım doğru pankreas gelişiminin temel aşamaları modellemek için hESC ayırt etmektir. Bu Aktivin A, temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve CHIR990210 mevcudiyetinde hücrelerin kültürlenmesi ile elde edilir kesin endoderm, indüksiyonu ile başlar. Fibroblast Büyüme Faktörü 10 (FGF10) ve Dorsomorphin ile daha fazla farklılaşma ve desenlendirme arka foregut benzeyen hücreler üretir. Retin eklenmesioik asit, noggin, SANT-1 ve FGF10 pankreas endoderm karakteristik hücrelerine arka foregut hücreleri ayırır. Son olarak, epidermal büyüme faktörü (EGF) kombinasyonu, nikotinamid ve Noggin PDX1 + / NKX6-1 + hücreleri etkin bir şekilde oluşmasına sebep olur. Akım sitometri pankreas gelişimin temel aşamalarında spesifik belirteçler ifadesini teyit etmek için yapılır. Evre 4 sonunda PDX1 + / NKX6-1 + pankreas progenitörler bağışıklık yetersizliği olan farelere transplantasyonu sırasında olgun β hücreleri üretme yeteneğine sahiptir ve daha fazla in vitro insülin üreten hücreleri üretmek için ayırt edilebilir. Böylece, PDX1 verimli nesil + / NKX6-1 + pankreas ataları, bu protokolde gösterdiği gibi, bu in vitro insan pankreas gelişimini incelemek için bir platform sağlar olarak büyük önem taşımaktadır ve farklılaşma potansiyeli olan hücre kaynağı sağlar EV olabilir β hücrelerientually diyabet tedavisi için kullanılabilir.

Şekil 1A şemada gösterildiği gibi pankreas progenitörlerin verimli üretimi, farklılaşma protokolü esnasında özel sinyal molekülleri tam olarak ilave edildikten sonra farklılaşmamış hücrelerin uygun büyüme ve bakım dayanır. 0. günde, farklılaşmamış hücreler% 80-95 konfluent olmalı ve koloniler tanımlanan kenarları (Şekil 1A) sahip olmalıdır. hücre ölümü bu aşamada oldukça yaygındır beri Aşama 1 sırasında, medya olasılıkla bulutlu görünecektir. Aşama 1 yıl...

Burada in vitro NKX6-1 + pankreas atalarıdır insan embriyonik kök hücreleri ayırt etmek için 4 aşamalı bir protokol açıklar. Bu protokol, insan pluripotent kök hücre hatları çeşitli uygulanabilir.

Pluripotent Verimli Farklılaşma NKX6-1 için Kök Hücreler<sup&gt; +</sup&gt; Pankreas Progenitörler

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Bu prosedürün genel amacı, insan pluripotent kök hücrelerini pankreas gelişiminin dört temel aşamasından geçirerek farklılaştırarak, in vitro ortamda NKX6.1 eksprese eden pankreatik progenitörleri verimli bir şekilde üretmektir. İnsan pluripotent kök hücrelerini pankreas gelişiminin dört temel aşaması boyunca farklılaştırarak, bu protokol insan pankreas gelişimini in vitro incelemek için bir model sunmaktadır. Bu tekniğin mevcut protokollere göre temel avantajı, çeşitli insan pluripotent kök hücre hatlarını kullanarak yüksek yüzdelerde NKX6.1 pozitif pankreatik progenitör hücreler üretebilmemizdir.Pankreas öncüllerinin insülin üreten beta benzeri hücreler oluşturma potansiyeline sahip olduğu göz önüne alındığında, bu teknik bize diyabet tedavisi, ilaç keşfi ve hastalık modellemesi için hücreler geliştirme fırsatı sunacaktır. Sıfırıncı günde, KnockOut serum ikame besiyerini sıfırıncı gün diferansiyasyon besiyeri ile değiştirerek diferansiyasyonu başlatın. Ardından birinci ve ikinci günlerde, besiyerini aspire etmeden önce monotabakadaki ölü hücreleri temizlemek için plakayı nazikçe sallayın.Ardından, bunu birinci ve ikinci gün diferansiyasyon medyumu ile değiştirin. Üçüncü günde, hücreleri akış sitometrisi için hasat edin. Hücreler %90'tan fazla CXCR4 ve CD117 eksprese ediyorsa, istenen verimliliğe ulaşılmış demektir.Ardından, aspirasyondan önce monokatmandaki ölü hücreleri uzaklaştırmak için plakayı hafifçe sallayın ve bunu üçüncü ila beşinci gün diferansiyasyon medyası ile değiştirin. Akış sitometrisi ile üçüncü güne kadar definitif endodermin verimli bir şekilde indüklenmesini sağlamak önemlidir. Hem CXCR4 hem de CD117 eksprese eden hücrelerin yüzdesi %90'dan düşükse, pankreatik progenitörlere diferansiyasyon muhtemelen sekteye uğrayacaktır.Altıncı ve yedinci günlerde, besiyerini altıncı ve yedinci gün diferansiyasyon besiyeri ile değiştirin. Sekizinci, 10. ve 12. günlerde, besiyerini sekizinci ve 12. gün diferansiyasyon besiyeri ile değiştirin. Ardından 13. günde, PDX1 ve NKX6.1 ekspresyonunu belirlemek için hücreleri akış sitometrisi için hasat edin.Akış sitometrisi analizi için hücreleri toplamak amacıyla, hücreleri üretici protokolüne uygun olarak ticari Trypsin çözeltisi ile ayrıştırın ve hücreleri 37 °C'de üç dakika inkübe edin. Üç dakika sonra, Trypsin çözeltisini uzaklaştırın ve tekil hücreleri 30 µL DNA One içeren 1.000 µL fax tamponunda yeniden süspande edin. Ardından, hücreleri 35 µm naylon ağ hücre süzgeci kullanarak filtreleyin ve bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.Hücreleri, canlı veya fikse boyamaya hazırlamadan önce 455 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından hücreleri 1.000 µL fax tamponunda yeniden süspande edin. Hem boyanmamış hem de boyanmış örnekler için 200 µL'yi 96 kuyucuklu bir plakanın iki kuyucuğuna aktarın.Ardından, plakayı 931 ×g'de iki dakika boyunca santrifüj edin, sonrasında plakayı ters çevirerek süpernatanı uzaklaştırın, hücreleri 100 µL'lik nihai hacimdeki primer konjuge antikor ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca boyayın ve ışıktan koruyun. Sonrasında, plakayı 931 ×g'de iki dakika boyunca santrifüj edin, iki dakika sonra plakayı ters çevirerek süpernatanı uzaklaştırın. Bunu takiben, örnekleri 100 µL fax tamponu içinde yeniden süspanse edin.Ardından plakayı iki dakika boyunca 931 ×g kuvvetinde santrifüjleyin. Plakayı ters çevirerek süpernatantı uzaklaştırın. Sonrasında örnekleri 300 ile 500 µL fax tamponu içinde yeniden süspanse edin, bunları 1 mL'lik mikro test tüplerine veya 5 mL'lik yuvarlak tabanlı tüplere aktarın ve örnekleri akış sitometresinde analiz edin.Numuneler hemen çalıştıramayacaksa, dört santigrat derecede saklayın ve ışıktan koruyun. Bu prosedürde, hücre peletini ticari fikse etme ve permeabilizasyon çözeltisinde dört santigrat derecede 24 saat boyunca yeniden süspande edin. 24 saat sonra, numuneyi 455 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin, ardından 400 µL ticari perm yıkama çözeltisinde yeniden süspande edin.Ardından, IgG kontrolü ile PDX1 ve NKX6.1 boyamaları için örnekten 200 µL'yi 96 kuyucuklu bir plakanın iki kuyucuğuna aktarın ve plakayı 931 ×g'de iki dakika boyunca santrifüj edin. Daha sonra hücre peletlerini, anti-PDX1 ve anti-NKX61 primer veya izotip kontrol antikorları içeren 100 µL ticari perm yıkama çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Bunları 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, plakayı 931 ×g'de iki dakika boyunca santrifüjleyin, plakayı ters çevirerek süpernatantı uzaklaştırın ve örnekleri 100 µL ticari perm yıkama solüsyonu içinde yeniden süspande edin. Ardından, plakayı 931 ×g'de iki dakika boyunca santrifüjleyin. Plakayı ters çevirerek süpernatantı uzaklaştırın.Ardından numuneleri, sekonder antikor içeren 100 µL perm yıkama çözeltisi içinde oda sıcaklığında bir saat boyunca ve ışıktan koruyarak yeniden süspande edin. Bir saat sonra, plakayı iki dakika boyunca 931 ×g hızında santrifüjleyin, ardından plakayı ters çevirerek süpernatanı uzaklaştırın; bunu takiben numuneleri 100 µL ticari perm yıkama çözeltisinde yeniden süspande edin, plakayı iki dakika boyunca 931 ×g hızında santrifüjleyin ve plakayı ters çevirerek süpernatanı uzaklaştırın. Son olarak, numuneyi 100 µL ticari perm yıkama çözeltisinde yeniden süspande edin ve süpernatanı uzaklaştırmadan önce plakayı tekrar iki dakika boyunca 931 ×g hızında santrifüjleyin.Ardından, örnekleri 300 ila 500 µL fax tamponu içerisinde yeniden süspande edin ve akış sitometrisi analizi için ayrı birer mL'lik test tüplerine veya 5 mL'lik yuvarlak tabanlı tüplere aktarın. Burada, insan embriyonik kök hücrelerinden pankreatik progenitör indüksiyonunun; farklılaşma gününü, gelişim aşamasını, bazal medyumları ve her aşamada eklenen sitokinleri gösteren şeması sunulmuştur. Burada ise pankreatik farklılaşmanın temel aşamalarındaki faz kontrast görüntüleri yer almaktadır.H1 hücreleri, gösterilen dört aşamalı diferansiyasyon protokolüne göre diferansiye edilmiştir. Sıfırıncı günde diferansiye olmamış insan embriyonik kök hücreleri, birinci aşamada definitif endoderm, ikinci aşamada posterior ön bağırsak, üçüncü aşamada pankreatik endoderm ve dördüncü aşamada NKX6.1 pozitif endoderm pankreatik progenitorler yer almaktadır. Bu şekil, CXCR4 PE ve CD117 APC antikor boyamaları için üçüncü güne ait temsili akış sitometrisi grafiklerini göstermektedir.Burada boyanmamış örnek, burada ise boyanmış örnek yer almaktadır. Bu şekil, NKX61 ve PDX1 eksprese eden evre dört türevli pankreas progenitor hücreleri için 13. güne ait temsili akış sitometrisi grafiklerini göstermektedir. Bu IGG kontrolü, bu ise boyanmış örnektir.Bu teknik uzmanlaşıldığında 13 günde tamamlanabilir. Ancak bu süre, kullanılan hücre hattına bağlı olarak değişiklik gösterebilir. Bu prosedür uygulanırken, partiler arası değişkenlik nedeniyle tüm ajanların test edilmesi önemlidir.Prosedür takip edildikten sonra, NKX6.1 pozitif pankreatik progenitör hücreler, yayınlanmış diğer protokoller kullanılarak insülin üreten beta benzeri hücrelere daha fazla farklılaştırılabilir. Bu, beta hücresi olgunlaşması ve gelişiminin in vitro ortamda incelenmesi için bir platform sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, insan plüripoten kök hücrelerini gelişiminin dört temel aşamasından geçirerek pankreatik progenitörlere nasıl verimli bir şekilde farklılaştıracağınız konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

efficient-differentiation-pluripotent-stem-cells-to-nkx6-1-pancreatic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video, transgenik olmayan ve transgenik insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) nöral progenitör hücrelerin oluşumunu göstermektedir. hPSC'ler, bir nöronal farklılaşma ortamı kullanılarak nöral progenitör hücrelere farklılaştırılır. Farklılaşma, küçük moleküller kullanılarak transgenik olmayan hücrelerde indüklenirken, transgenik hPSC'ler, nöronal farklılaşmaya özgü bir transkripsiyon faktörü için promotörü indükleyen bir antibiyotik eklenerek farklılaştırılır.

Transgenik Olmayan ve Transgenik İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin Nöral Progenitör Hücrelere Ayırt Edilmesi

Burada, alt uygulamalar ve diğer farklılıklar iyileştirilmesi için kesin endoderm doğru kararlı farklılaştırılmış insan embriyonik kök hücrelerinin saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Yaratılan Endoderm Hücrelerinin Saflaştırılması Hızlı ve Etkin Yöntem

Protokoller iCRISPR platformu kullanılarak hPSC mutan çizgileri oluşturmak için ve tarif edilen glukoz duyarlı β-benzeri hücrelere hPSCs ayırt etmek. hPSC yönettiği farklılaşma ile genom düzenleme teknolojisini birleştirerek insan gelişimi ve hastalık seyrinde soy belirleyicilerinin rolü sistematik analizi için güçlü bir platform sunmaktadır.

İnsan Pankreas Geliştirme Lineage Belirleyicileri sorgulanması için Genom Düzenleme ve hPSCs arasında Yönetmen Farklılaşma

Bu iletişim kuralı kortikal interneuron ataları ve sonrası Mitotik interneuron öncüleri fare embriyonik kök değiştirilmiş bir embryoid vücut monolayer yöntemi kullanarak hücre oluşturmak için bir yöntem açıklanır. Bu ataları/hareketlenme öncesi ilk belirtiler kullanılan vitro olabilir fluorescently sıralanmış ve kader tayini çalışmak için yenidoğan yeni korteksimiz içine nakledilen veya tedavi uygulamalarında kullanılan.

Fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal Interneuron Kara filmin tarih öncesi

Burada, pankreas/oniki parmak bağırsağı homeobox protein 1+ insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) ayırt etmek için ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut (PDX1+) hücreleri pankreas soy nesil için alan koloni sigara türü monolayer büyüme üzerinde tek hücre ayrışmış. Bu yöntem homojen hPSC elde edilen hücreleri, genetik manipülasyon üreten ve eleme için uygundur.

Verimli üretimi, pankreas/oniki parmak bağırsağı Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/pankreas ataları hPSCs yapışma kültürlerde üzerinden

Bu protokol, 18 gün içinde insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSCs) hepatosit benzeri hücreleri verimli bir şekilde üretmek için bir monolayer, serum içermeyen bir yöntem ayrıntıları. Bu hpscs sırayla ilkel çizgi, kesin endoderm, posterior foregut ve karaciğer tomurcuk ataları hepatosit benzeri hücreler oluşturmadan önce gibi ara hücre türlerine ayırt olarak altı adım gerektirir.

Insan pluripotent kök hücrelerinin karaciğer hücrelerine verimli farklılaşma

Bu protokolde, postgangliyonik sempatik nöronların insan pluripotent kök hücrelerinden üretimi için istikrarlı ve yüksek verimli bir ayırım stratejisi tanımlıyoruz. Bu model nöronlar birden fazla otonom bozuklukların çalışmalarının kullanımı için kullanılabilir hale getirecek.

Besleyicisiz ve Kimyasal Olarak Tanımlanmış Kültür Koşulları Altında İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Kullanan Postgangliyonik Sempatik Nöronların Verimli Farklılaşması

Bu makalenin amacı, insan hepatik progenitörlerin pluripotent kök hücrelerden farklılaşmasına neden olmak için standartlaştırılmış bir yaklaşım sağlamaktır. Bu prosedürün kullanıma hazır ortam formülasyonları ile geliştirilmesi, kullanıcıya biyomedikal araştırma ve çeviri için insan karaciğer hücreleri üretmek için bir facile sistemi sunmaktadır.

Tanımlanmış Bir Farklılaşma Sistemi Kullanarak Pluripotent Kök Hücrelerden Hepatik Progenitör Spesifikasyonu

Mevcut protokol, düzlemsel tek katmanlı insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) türetilen pankreas progenitörlerinde PDX1 ve NKX6.1 transkripsiyon faktörlerinin birlikte ekspresyonunu arttırmak için geliştirilmiş bir yöntemi açıklamaktadır. Bu, taze matrisin yenilenmesi, hücre yoğunluğunun manipüle edilmesi ve endodermal hücrelerin ayrışmasıyla elde edilir.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin 2D Kültür Sisteminde Pankreatik Beta Hücre Öncüllerine Farklılaşması

Kök hücrelerin adacık hücrelerine farklılaşması, geleneksel diyabet tedavisine ve hastalık modellemesine alternatif bir çözüm sunar. Bir tabakta insülin salgılayan, kök hücreden türetilen adacıkların üretilmesine yardımcı olmak için ticari bir farklılaşma kitini önceden onaylanmış bir yöntemle birleştiren ayrıntılı bir kök hücre kültürü protokolünü açıklıyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin İnsülin Üreten Adacık Kümelerine Farklılaşması

Bu makale, β hücreli benzeri hücrelerin yönlendirilmiş farklılaşması ve fonksiyonel analizi için bir protokol sunmaktadır. İnsülin üreten pankreas hücreleri oluşturmadan önce insan pluripotent kök hücreleri için optimal kültür koşullarını ve pasajlarını tanımladık. Altı aşamalı farklılaşma, kesin endoderm oluşumundan, glikoza yanıt olarak insülin salgılayan fonksiyonel β hücreli hücrelere doğru ilerler.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Fonksiyonel Pankreas İnsülin Salgılayan Hücreler Üretmek için Optimize Edilmiş Protokol

Öğrenin, insan çok yönlü kök hücrelerini NKX6.1 pozitif pankreas progenitörlerine dönüştürmek için dört aşamalı farklılaşma protokolünü. Bu yöntem, diyabet tedavisi ve ilaç keşfi için yüksek verimli hücre üretimi sağlar.

Pluripotent Verimli Farklılaşma NKX6-1 için Kök Hücreler

Daha fazla video keşfet