Name: Hücre içi Boyama ve Sitometrisi Hipertansiyon Modelinde Fare Aort, Böbrek ve Lenf düğümleri içinde lenfosit alt tanımak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Öğrenin hipertansiyon modelinde fare aort, böbrek ve lenf düğümlerinden tek hücreli süspansiyon hazırlama ve akış sitometrisi ile T lenfosit alt kümelerini tanımlama. Bu yöntem kardiyovasküler hastalıklarda immün yanıtları incelemek için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma FL bir Amerikan Kalp Derneği Bursu Ödülü (16POST29950007), Sağlık (NIH T32 HL069765) BLD, MA Salih bir Amerikan Kalp Derneği Bursu Ödülü (14POST20420025) için National Institutes of bir eğitim hibe ve bir NIH tarafından desteklenen K08 ödülü MSM (HL121671). MSM de Gilead Sciences, Inc. bir araştırma bursu ile desteklenmektedir

Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Burada tarif edilen prosedürler onayladı. Fareler ev sahipliği ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu uyarınca bakılan (Ulusal Akademiler Press. Revize 2010). Fareler ile Aort lenf düğümleri, Böbrek ve Aort 1. İzolasyonu <ol><li> CO 2 inhalasyon fareler Euthanize. % 70 etanol ile göğüs püskürtün ve dikkatle deri ve kalp maruz makas ile göğüs duvarı açın. </li><li> damarsal serpmek için, sağ atrium küçük bir kesi yapmak ve sürekli bir 21 ya da 23 G iğne kullanılarak sol ventrikül apeksi içine soğuk PBS (yaklaşık 1 ml / sn) en az 10 ml enjekte edilir. Tüm organlar blanched kadar serpmek. Kalp ilk blanches. karaciğer Ağartma perfüzyon iyi performans olduğunu gösterir. </li><li> küçük forseps ve ince makas kullanarak, hafifçe, kesip ve bağırsakları dışarı çekinmide, dalak, pankreas ve karaciğer daha iyi aorta görselleştirmek için. Not: Bu adım kontaminasyonu uyarabilir gastrointestinal hasar olarak çok hassas yapılmalıdır. </li><li> Cut out ve makasla her akciğer çıkarın. Bir iğnesiz şırınga kullanılarak, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile göğüs boşluğunu durulayın. steril gazlı bez kullanılarak aşırı kan ve sıvı kaldırmak. </li><li> ince diseksiyon forseps kullanılarak abdominal aort lenf düğümleri kaldırın. kapsül yırtılmasına değil emin olun. kesme forseps her lenf nodu yüzeyi üzerinde geride kalan yağ çıkarmak. ince makasla iki böbrekleri kesip. </li><li> ince, kavisli makas ile tüm aorta (torasik ve abdominal aorta) teşrih. kalp hizasında başlayın ve dikkatle uzak yemek borusu ve aort bağlı çevreleyen perivasküler yağ tutmak için emin iliak bifurkasyona kadar aşağı omurları arasından teşrih. NOT: Aort diseksiyonu daha fazla remoÇevredeki yapıların mikroskop altında yapılabilir ettik. Özellikle, arteriyel dalları (karotis arterler, subklavyen arter, çölyak, mezenterik ve renal arterler) ve lenf düğümleri kaldırın. Bu çok inflamatuar hücreler hipertansiyon ayarında ikamet bir site olduğundan her aort etrafında perivasküler yağ tutarlı bir tabaka tutun. soğuk PBS içeren tüplere, her doku yerleştirin. </li></ol> Her bir dokudan Tek hücre süspansiyonları, 2. Üretim <ol><li> böbrekler NOT: Böbrek mekanik ayrışma artı enzimatik sindirim birleştirerek tek bir hücre süspansiyonu ayrışmış edilebilir. <ol><li> (% 5 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş) 1640 ortamı (2 mg / ml) kollajenaz D eklenmesi ve DNase I (100 ug / ml), RPMI ile Böbrek sindirim çözeltisi hazırlayın. Böbrek örnek başına 10 ml hazırlayın. </li><li> Böbreğin sindirmek 10 ml içeren bir ayrışma tüp içine iki böbreği aktarmak için forseps kullanabiliriyon solüsyonu. </li><li> üreticinin talimatlarına göre bir yarı-otomatik bir ayıracı cihazı kullanılarak mekanik ayrılma gerçekleştirin. </li><li> mekanik ayrışma sonra cihazdan tüp ayırmak ve enzimatik sindirim gerçekleştirin. sürekli dönme altında 37 ° C &#39;de 20 dakika boyunca inkübe edin. Hemen% 5 FBS ile takviye edilmiş, soğuk RPMI 1640 ortamı eklenerek enzimatik sindirim dur. </li><li> 40 mikron süzgeç vasıtasıyla filtreleme sonra 50 ml konik tüp içine pipetleme çözüm aktarın. 1 ml şırınga pistonu bastırarak birbirinden kalan doku alay. hücreler (500 xg, 8 dakika, 4 ° C) pelet. </li><li> % 36 yoğunluk gradyan santrifüj ortamının 3 ml pelletini. 15 ml konik tüp içine süspansiyon aktarın. Yavaşça herhangi bir kesinti olmadan 3 ml% 36 hücre süspansiyonu altında% 72 yoğunluk gradyan santrifüj medya 3 ml ekleyin. Santrifüj (frensiz 1000 xg, 20 dakika, 4 ° C). &lt;/ Li&gt; <li> bağışıklık hücreleri arayüzünde yer alacaktır. hücresel enkaz içeren üstteki sarımsı bir tabaka çıkarın ve sonra soğuk PBS kullanarak 15 ml hacim getirmek. arıza iyice degrade sallayın. hücreler (300 xg, 8 dakika, 4 ° C) Spin ve% 5 FBS ile RPMI 3 ml pelletini. Tripan mavisi dışlama kullanarak hemasitometre canlı hücrelerinin sayısını. </li></ol></li><li> aort <ol><li> kolajenaz A (1 mg / ml), kolagenaz B (1 mg / ml) eklenerek aort sindirim çözeltisi hazırlayın ve DNase I (100 ug / ml), RPMI ile (% 5 FBS ile takviye edilmiş) 1640 ortamı. </li><li> ince forseps kullanılarak, aort sindirim çözeltisi, 1 ml içeren 2 ml&#39;lik bir tüp içine aort aktarın. 1 ml sindirim çözeltisi içinde ince makas ile çok küçük parçalar halinde bütün aort kıyma. buz üzerinde tutun. sürekli dönme altında 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Bir doku kültürü çanak çözüm aktarın ve enzyma durdurmak% 5 FBS soğuk RPMI 5 kez hacmi eklenerek tlc sindirim. </li><li> 40 mikron süzgeç vasıtasıyla filtreleme sonra 50 ml konik tüp içine pipetleme çözüm aktarın. 1 ml şırınga pistonu bastırarak tek bir hücre süspansiyonu içine ayrı kalan doku alay. süzgeci yıkayın ve hücreleri (300 xg, 8 dakika, 4 ° C) pelet. </li><li> % 5 FBS ile RPMI 10 ml ekleyerek pelet yıkayın. hücreler (300 xg, 8 dakika, 4 ° C) Spin ve% 5 FBS ile RPMI 3 ml pelletini. Tripan mavisi dışlama kullanarak hemasitometre canlı hücrelerinin sayısını. </li></ol></li><li> Aort lenf düğümleri <ol><li> bir doku kültürü kabı (60 mm x 15 mm) ve 40 um süzgeç yerleştirin. süzgeç üzerinde lenf düğümlerini yerleştirin ve 1 ml şırınga pistonu bastırarak tek bir hücre süspansiyonu içine birbirinden kızdırmak. % 5 FBS ile RPMI 2 ml süzgeç yıkayın. çanak hücreleri toplamak. </li><li> transfer15 ml&#39;lik bir Falcon tüpü içine hücre ve pelet hücreleri (300 xg, 8 dakika, 4 ° C). % 5 FBS ile RPMI 500 ul pelletini. Tripan mavisi dışlama kullanarak hemasitometre canlı hücrelerinin sayısını. </li></ol></li></ol> Akış Sitometrisi ile sitokin Algılama 3. Ex Vivo Uyarım <ol><li> % 5 FBS, temel olmayan amino asitler, 0.1 mM, 50 uM β-mersaptoetanol ve% 1 penisilin / streptomisin ile RPMI: hücre kültür ortamı hazırlayın. </li><li> Santrifüj, böbrek, aort ve lenf düğümlerinden elde edilen her hücre süspansiyonu (300 xg, 8 dakika, 4 ° C). Ml başına 1 x 10 6 hücre bir konsantrasyonda, hücre kültür ortamı, her pelletini. </li><li> Hücre kültürünün her 1 ml (Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA), kalsiyum iyonofor iyonomisin ihtiva eden ve Golgi inhibitörü Brefeldin A) hücre aktivasyonu kokteyli 2 ul ekleyerek hücrelerini uyarır. NOT: nihai konsantrasyonPMA 81 nM PMA ile Brefeldin A Tedavi ionomisin 1.33 uM ve 5 ug / ml ve iyonomisin sitokinler üretmek için hücreleri aktive eder: her bir bileşenin s bulunmaktadır. Sitokinler tespit edilecek hücrelerde sıkışıp gereken proteinleri salgılanır. Brefeldin A endoplazmik retikulum ve Golgi aygıtında normal salgılanan proteinlerin birikmesine yol açar. Bu nedenle, burada tarif edilen teknik, akış sitometrisi ile sitokin üreten limfositlerin tespit edilebilirliğini arttırır. </li><li> 12 oyuklu 2.000.000 hücre (aort veya böbrek) ya da 24 oyuklu (lenf düğümü) düşük yapışma plakaları Levha 1. 3 saat 37 ° C nemlendirilmiş CO2 kuluçka makinesi içinde plaka koyun. Not: kaplama hücre sayısı kontrol farelerinin lenf düğümlerinde daha düşük olabilir. Ayrıca, uyarılma zaman deneysel olarak çalışılan her hücre popülasyonu ve sitokin için belirlenmelidir. aort, böbrek veya lenf düğümlerinden izole edilmiş T hücreleri durumda, 3 ila 4 saat boyunca teşvik önerilir. Daha uzun bir uyarım WHasta sitokin salgılanmasını arttırmak ve CD3, CD4 ve CD8 gibi çeşitli T hücresi yüzey markerlerine bir başka infekte hücrelerde bunu yapmaz. (Hatta 3-4 saat stimülasyon bu belirteçlerin bazı infekte hücrelerde unutmayın.) </li></ol> 4. Yüzey Boyama <ol><li> bir polistiren FACS tüpü ve santrifüj (300 xg, 8 dakika, 4 ° C) içine hücreleri aktarın. (FACS tamponu ile iki kez (Ca2 + ve Mg + serbest PBS% 4 FBS ve 2 mM EDTA ihtiva eden) hücreler yıkanır ve arzu edilen antikor panel sayısı ve gerekli kontrol tüplerinin sayısına bağlı olarak farklı FACS tüplere eşit hücre süspansiyonu bölmek aşağıya bakınız). </li><li> Her panel için tazminat gerçekleştirmek için, her doku tipi ve antikor paneli için lekesiz kontrol tüpleri ve tek lekeli tüpler hazırlamak. Buna ek olarak, tüm ama antikorların birini ekleyerek her antikor paneli için floresans eksi bir (FMO) kontrol tüpleri hazırlar. </li><li> FACS ile 2 ml her tüp ses seviyesini ayarlamakTampon. Santrifüj hücre süspansiyonu (300 xg, 8 dakika, 4 ° C), buz üzerinde 10 dakika süre ile milyon hücre başına anti-CD16 / CD32 antikorları, 0.5 ug hücrelerin inkübe edilmesi ile yüzer ve blok Fc reseptörleri çıkarın. NOT: CD16 düşük afinite IgG Fc reseptörü III (FcR III) ve CD32 FcR II. CD16 / CD32 granülositler, mast hücreleri, monositler / makrofajlar, doğal katil hücreler, B hücreleri, dendritik hücreler ve bazı aktif, olgun T hücreleri üzerinde ifade edilir. </li><li> geçerlilik boyaması yapın: 1x PBS 1000 ul 1x PBS, santrifüj (300 xg, 8 dakika, 4 ° C) ve tekrar süspansiyon hücreleri yıkayın. hücre geçirgenliği olmayan amin reaktif boya (canlılık leke) 1 ul ekle. ışıktan korumalı 4 ° C&#39;de 15 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> İnkübasyon sırasında, FACS tamponu uygun bir hacimde (yüzey boyama) antikor kokteyli hazırlanır. FACS tampon 1-2 ml hücreler iki kez yıkanır, santrifüj (300 xg, 8 dakika, 4 ° C) ve 100 ul her bir peletAntikor karışımı. ışıktan korumalı 4 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. Not: antikor sitometri her bir akış sağlamak için, bir doz titrasyon eğrisi gereksinim duyulan antikor optimal miktarını belirlemek için yararlıdır. </li><li> hücreler (300 xg, 8 dakika, 4 ° C) FACS tampon, 2 ml ile iki kez hücreleri yıkayın ve pelet. </li></ol> 5. Sabitleme, Permeabilization ve Hücre içi Boyama <ol><li> Üreticinin talimatlarını takip ederek uygun tamponlar içeren bir tespit ve permeabilization kiti ile hücre içi boyama yapın. Fix ve uygun tampon onları resuspending hücreleri geçirgenliği. ışıktan korumalı 4 ° C&#39;de 40 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 1x Permeabilization 1 ml ekleyin ve sabit ve permeabilize hücrelere doğrudan tampon yıkayın. Santrifüj (500 xg, 8 dakika, 4 ° C) ve süpernatant kaldırmak. 1x yıkama tamponu 2 ml pelletini. </li><li> antib karışımlarını hazırlamak1x yıkama tamponu (tüp başına genellikle 100 ul) uygun bir hacimde (hücre içi boyama için) Odies. Not: Yukarıda tarif edildiği gibi, uygun antikor konsantrasyonu panelinde, her bir antikor için tespit edilmesi gerekmektedir. Örneğin, IL-17A veya IL-17F karşı antikorlar için, biz 1:30 bir seyreltme faktörü kullanın, ancak IFNy ve T-bahis antikorları için, biz 1 bir seyreltme faktörü kullanın: 100. </li><li> Santrifüj hücreleri (500 xg, 8 dakika, 4 ° C) ve antikor karışımı, 100 ul her pelletini. ışıktan korumalı 4 ° C&#39;de 40 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> hücreler (500 xg, 8 dakika, 4 ° C) 1 x yıkama tamponu 2 ml hücreler iki kez yıkanır ve pelet. 1x yıkama tamponu 300 ul ile pelet yeniden süspanse edin ve uygun filtreler ile bir akış sitometresi üzerinde analiz. </li><li> doku örneğinin başına toplam hücre sayısının ölçümü için sayma boncuk kullanmayın. alımı öncesinde, her tüpe boncuk sayma önerilen hacim / numara ekleyin. </li></ol> 6. Tazminat, Yolluk, Normalleştirme, ve İpuçları <ol><li> Tazminat ve yolluk <ol><li> tazminat çalıştırın lekesiz ve tek lekeli kontrol tüpleri spektral örtüşme ayarlamak için. Not: dengeleme boncuklar yerine hücre bazlı dengeleme kontrol kullanımı, bir numunede ilgi veya hücre popülasyonunun bir antijen olduğu telafi zor olacak hücreler kullanılarak bu düşük seviyelerde mevcut olduğu durumlarda gereklidir. tandem boyalar kullanarak Ayrıca notun, tandem boyalar çok-çok-ve her gün değişir çünkü her bir deney için tazminat hazırlamak için tavsiye edilir. </li><li> Yeni bir renkli deney başlatırken floresan eksi panelde tüm fluorophores için bir kontrol (FMOs) çalıştırın. NOT: FMO kontrolleri biri hariç panelde tüm antikorlar içeren örneklerdir. Bu kontroller düzgün rla ma k atlanmış antikor negatif sinyallerin karşı pozitif doğru ayrımcılığa izinKapıları t. Bu kontroller ifade seviyeleri hedef nüfusun ayrılması kötü olduğunda ya da (örneğin, zaman hedef bir sitokin veya transkripsiyon faktörüdür) düşük olduğunda özellikle önemlidir. bunlar, antijen spesifikliği olmayan antikor izotipinin ve fluorofor konjügatı için uygun telafi sağlamak gibi FMO kontrol her zaman gerekli olmasa da, bazı durumlarda, izotip kontrol yerde tercih edilebilir. </li><li> Birincil kapıyı kurmak: lökosit nüfusu tespit etmek amacıyla Forward Scatter Area (FSC-A) ve Side Scatter Area (SSC-A) Gerilimi ayarlamak. </li><li> ölü hücreleri hariç. NOT: canlılık leke yüzeyi ve hücrelerin iç hem de mevcut ücretsiz aminler ile reaksiyona girer. hücrelerin yaşama aksine, (tehlikeye diyaframlarla) ölü hücreler, protein etiketleme miktarının artırılması, boya sitoplazmaya girmesine izin verir. Böylece, ölü hücreler kolay ayrımcılık sağlayan canlı hücreler daha parlak olacaktır. Canlı üzerinde KapısıHücreler. Not: aort ve böbrek hücre süspansiyonları canlılığı nedeniyle ek sindirim aşamasından lenf düğümleri hücre süspansiyonları canlılığı daha düşük olabilir. </li><li> Arsa İleri Yayılım Alanı (FSC-A) [y-ekseni] ve İleri Yayılım Yükseklik (FSC-H) [x ekseni]. Mayoları bu nokta arsa üzerinde bir diyagonal olarak görünür. Bu diyagonal Kapısı ikilileri dışlamak için. Sonra SSC-A [y ekseni] ve CD45 [x eksenini] arsa. </li><li> CD45 + lökosit nüfus kolaylıkla tespit edilebilir. Bu nüfus Kapısı. Takip eden popülasyonlarının Bu popülasyondan tespit edilebilir. </li></ol></li><li> Hücre sayımlarının Normalleştirme <ol><li> Sayma boncuklar düşük FSC ve yüksek SSC neden özelliklere sahiptir. 50.000 boncuk tek bir hücre süspansiyonu 300 ul ilave edilir, aşağıdaki gibi tüp başına Örneğin, herhangi bir mutlak sayısının hesaplanması için denklemi hücre tipi vermek: Hücre sayısı per tüp = (akış sitometresi tarafından sayılan boncuk 50,000 / sayısı) sayılan hücrelerin sayısı x. Bu hesaplama kullanarak, tüp başına herhangi bir hücre tipinde mutlak sayısı belirlenebilir. Her organ elde kaç borular göre, organ başına hücre sayısı hesaplanabilir. Not: protokolü 4 ° C&#39;de tüm hücreleri ve reaktifler tutun. bu hücrelere zarar verebilir, çünkü kuvvetli vorteks kaçının. pelet hücreleri çok az güçleri kullanın. hücre ölümünü hızlandırabilir beri FACS tüp içinde kabarcıklar yapmaktan kaçının. topaklar, herhangi bir zamanda kurumasına izin vermeyin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+adaptor+protein+LNK+deficiency+exacerbates+hypertension+and+end-organ+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).</li>
<li>Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+17+promotes+angiotensin+II-induced+hypertension+and+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction.</a> Hypertension. 55 (2), 500-507 (2010).</li>
<li>Laroumanie, F., Douin-Echinard, V., Pozzo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+Cells+Promote+the+Transition+From+Hypertrophy+to+Heart+Failure+During+Chronic+Pressure+Overload%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">CD4+ T Cells Promote the Transition From Hypertrophy to Heart Failure During Chronic Pressure Overload.</a> Circulation. 129 (21), 2111-2124 (2014).</li>
<li>Guzik, T. J., Hoch, N. E., Brown, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+T+cell+in+the+genesis+of+angiotensin+II+induced+hypertension+and+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction.</a> J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).</li>
<li>Ketelhuth, D. F. J., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+Response+of+T+and+B+Cells+in+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis.</a> Circ Res. 118 (4), 668-678 (2016).</li>
<li>McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation%2C+Immunity%2C+and+Hypertensive+End-Organ+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Inflammation, Immunity, and Hypertensive End-Organ Damage.</a> Circ Res. (6), 1022-1033 (2015).</li>
<li>Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BT+Cells%3A+Differentiation+and+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dev+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD4+T Cells: Differentiation and Functions.</a> Clin Dev Immunol. 2012, 1-12 (2012).</li>
<li>Mittrücker, H. -W., Visekruna, A., Huber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+the+differentiation+and+function+of+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Immunol+Ther+Exp+%28Warsz%29%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in the differentiation and function of CD8+ T cells.</a> Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 62 (6), 449-458 (2014).</li>
<li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Microbiol+Immunol+%28Bp%29%22%5BJournal%5D)">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).</li>
<li>Finak, G., Langweiler, M., Jaimes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+Flow+Cytometry+Immunophenotyping+Analysis+from+the+Human+ImmunoPhenotyping+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium.</a> Sci Rep. 6, 20686(2016).</li>
<li>Herzenberg, L. A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+future+of+the+fluorescence+activated+cell+sorter+and+flow+cytometry%3A+a+view+from+Stanford%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford.</a> Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).</li>
<li>Hrvatin, S., Deng, F., O'Donnell, C. W., Gifford, D. K., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MARIS%3A+method+for+analyzing+RNA+following+intracellular+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MARIS: method for analyzing RNA following intracellular sorting.</a> PLoS One. 9 (3), 89459(2014).</li>
<li>Kalisky, T., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell genomics.</a> Nat Methods. 8 (4), 311-314 (2011).</li>
<li>Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry%3A+Today%27s+technology+and+tomorrow%27s+horizons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cytometry: Today's technology and tomorrow's horizons.</a> Methods. 57 (3), 251-258 (2012).</li>
<li>Jiang, L., Tixeira, R., Caruso, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+progression+of+cell+death+and+the+disassembly+of+dying+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry.</a> Nat Protoc. 11 (4), 655-663 (2016).</li>
<li>Lemoine, S., Jaron, B., Tabka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dectin-1+activation+unlocks+IL12A+expression+and+reveals+the+TH1+potency+of+neonatal+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dectin-1 activation unlocks IL12A expression and reveals the TH1 potency of neonatal dendritic cells.</a> J Allergy Clin Immunol. 136 (5), 1355-1368 (2015).</li>
<li>Gaublomme, J. T., Yosef, N., Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Genomics+Unveils+Critical+Regulators+of+Th17+Cell+Pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity.</a> Cell. 163 (6), 1400-1412 (2015).</li>
</ol>

MSM Gilead Sciences Kardiyovasküler bir hibe ile desteklenmektedir.

Burada açıklanan protokol, murin böbrekleri, aort ve lenf düğümlerinde bulunan T hücresi alt kümelerini doğru bir şekilde tanımlamak için optimize edilmiştir. Bu protokol, B lenfositleri ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri gibi diğer bağışıklık hücresi alt kümelerini incelemek için kolayca uyarlanabilir ve diğer doku tiplerini içerecek şekilde değiştirilebilir. Sindirim adımı kritiktir ve her doku için değiştirilmeli ve optimize edilmelidir9. Uzun süreli bir sindirim adımı veya uygun olmayan bir enzimin kul...

Son kanıtlar, adaptif bağışıklık sisteminin, özellikle de T lenfositler, çok sayıda kalp-damar hastalıkları 1,2,3,4,5 gelişiminde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Örneğin, anjiyotensin II kaynaklı hipertansiyonu modelinde, gemiler ve farelerin böbreklerinde T hücrelerinin birikimi 6 tarif edilmiştir. damar birikim adventisya ve perivasküler yağ ağırlıklı olarak. Böbrekte, T hücreleri, medulla ve renal korteksten hem de birikir. Dahil olduğu alt kümesi bağlı olarak, bu T hücreleri vasküler ve böbrek fonksiyonlarını etkileyebilir ve patolojinin gelişmesine yol açabilir farklı sitokinler doğuran (McMaster ve ark., 6 tarafından gözden). CD4 + T yardımcı lenfositler çok alt-grup halinde ayrılabilir: fonksiyonları ve imza sito göre T yardımcı 1 (Th1), Th2 Th9, Th17, Th22, regülatör T (regülatör) hücreleri ve T yardımcı foliküler (TFH) hücrelerkines 7. Benzer şekilde, CD8 + sitotoksik T hücreleri Tc1, TC2, Tc17 ya TC9 8 olarak sınıflandırılabilir. (CD4 veya CD8 T hücresi işaretlerini ifade yoktur, yani hücreleri) çift negatif T hücreleri bulunmaktadır. Bu hücrelerin bir alt alternatif bir gama delta T hücre reseptörü (yerine klasik alfa ve beta reseptörleri) sahiptirler ve bu nedenle, gama, delta T hücreleri olarak ifade edilir. yüzey işaretleyici, sitokin ve transkripsiyon faktörü flow sitometri çok parametre analizi bu hücreleri tanımlamak için en iyi yaklaşım oluşturmaktadır. Bu yöntem geniş bir immünoloji alanında kullanılmasına rağmen, bu daha az katı organlar ve kalp-damar hastalıklarının bir ortamda tarif edilmektedir. Tarihsel olarak, dokularda lenfosit tanımlama immünohistokimya ya da RT-PCR yaklaşımlar ile sınırlı kalmıştır. immünohistokimyasal ve immünofloresan int bir antijenin doku dağılımını belirlemek için güçlü yöntemler olmasına rağmenerest, onlar fenotipik ilgili alt grupları tanımlamak için yetersiz kalmaktadır. RT-PCR analizi antijenleri, sitokinler ya da transkripsiyon faktörleri mRNA ekspresyonunu tespit etmek için yararlıdır Buna ek olarak, bu aynı zamanda tek tek hücreler seviyesinde çok proteinlerin tespiti izin vermez. sitokinler ve transkripsiyon faktörleri tespit etmek için hücre içi boyama ile birlikte, özellikle flow sitometri gelişi, katı organlarda immün hücre alt tek hücre düzeyinde belirlenmesi ve niceliksel olanak sağlayan güçlü bir teknikle araştırmacılar sağlar. Bu, anjiyotensin II kaynaklı hipertansiyonu modelinde kemirgen böbrek, aort ve aort lenf düğümleri içinde bulunan ana T hücre alt akış sitometrisi ile tespit etmek, bir hücre içi boyama tahlili optimize ettik. Çok yeniden bir doku sindirim, ex vivo aktivasyonu, permeabilization ve yüzey ve hücre içi boyama sonuçları: her adımın optimizasyonuDiğer kardiyovasküler ve böbrek hastalığı modellerinde uygulanabilir üretilebilir deneyi.

<table><tbody><tr><td>Kollajenaz D</td><td>ROCHE</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz A</td><td>ROCHE</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz B</td><td>ROCHE</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>ROCHE</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>1x Kırmızı kan hücresi lizis tamponu</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Orta 1614 1x</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5445-02</td><td>Yoğunluk gradyanı santrifüjleme için</td></tr><tr><td>GentleMACS&trade; C tüpü</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS ayrıştırıcı cihaz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>Programı kullanın SPLEEN_04</td></tr><tr><td>Hücre aktivasyon kokteyli (Brefeldin A ile)</td><td>Biolegend</td><td>423303</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD16/32</td><td>eBioscience</td><td>14-0161-81</td><td>seyreltik 1:100</td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ sabitlenebilir menekşe ölü hücre leke kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>L34955</td><td></td></tr><tr><td>Transkripsiyon faktörü tampon seti</td><td>BD Pharmingen</td><td>562725</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>123 sayım eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45 AmCyan (klon 30-F11)</td><td>BioLegend</td><td>103138</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PerCP-Cy5.5 (klon 17A2)</td><td>BioLegend</td><td>100218</td><td></td></tr><tr><td>IL-17A FITC (klon TC11-18H10.1)</td><td>BioLegend</td><td>506910</td><td></td></tr><tr><td>IL-17F APC (klon 9D3.1C8)</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>517004</tr><tr><td>CD4 APC-Cy7 (klon GK1.5)</td> <td>BD Biosciences</td><td>560181</td><td></td></tr><tr><td>CD8 APC (klon 53-67)</td> <td>eBioscience</td><td>17-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>T-bet PE-Cy7 (klon 4B10)</td> <td>BioLegend</td><td>644823</td><td></td></tr><tr><td>IFN & gama; FITC (klon XMG1.2)</td><td>BD Biosciences</td><td>557724</td><td></td></tr></tbody></table>

hücre içi boyama ve sitometrisi hipertansiyon modelinde fare aort, böbrek ve lenf düğümleri içinde lenfosit alt tanımak

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

T lenfositlerin çeşitli kardiyovasküler hastalıkların gelişiminde kritik bir rol oynadığı artık iyi bilinmektedir1,2,3,4,5. Örneğin, grubumuzdan yapılan çalışmalar, hipertansiyonun, deneysel hipertansiyon gelişimi sırasında damarlarda ve böbrekte aşırı T hücresi birikimi ile ilişkili olduğunu göstermiştir6. Bu dokulara girdikten sonra, T hücreleri hem vasküler hem de böbrek fonksiyonunu etkileyen birkaç sitokin üretir ve bu da vazokonstriksiyona ve sodyum ve su tutulmasına yol açar1,2. T hücrelerinin kardiyovasküler ve böbrek hastalıklarına nasıl neden olduğunu tam olarak anlamak için, bu dokularda bulunan spesifik T hücresi alt kümelerini tanımlayabilmek ve ölçebilmek önemlidir. T hücresi alt kümeleri, yüzey belirteçleri, salgıladıkları sitokinler ve eksprese ettikleri transkripsiyon faktörlerinin bir kombinasyonu ile tanımlanır. T hücresi popülasyonunun karmaşıklığı, akış sitometrisini ve hücre içi boyamayı, dokularda bulunan lenfositlerin fenotiplerini incelemek için paha biçilmez bir teknik haline getirir. Burada, anjiyotensin II ile indüklenen hipertansiyon modelinde murin böbrek, aort ve aort drenaj lenf nodlarından izole edilen T hücrelerinde yüzey ve hücre içi belirteçleri (sitokinler ve transkripsiyon faktörleri) tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Aşağıdaki adımlar ayrıntılı olarak açıklanmaktadır: dokuların izolasyonu, tek hücreli süspansiyonların oluşturulması, ex vivo stimülasyon, fiksasyon, geçirgenleştirme ve boyama. Ek olarak, uygun kontrollerin seçilmesi ve uygun geçit stratejileri dahil olmak üzere akış sitometrik analizlerinin birkaç temel ilkesi tartışılmaktadır.

Protokol izin veren anjiyotensin II kaynaklı hipertansiyonu modelinde kemirgen böbrek, aort ve aort lenf düğümlerinden izole edilmiş T hücreleri yer yüzeyi ve hücre içi işaretlerinin belirlenmesi tarif edildiği. Temsilcisi sonuçları aşağıda sunulmuştur. Şekil 1, hipertansiyon uyarılması için anjiotensin II ile aşılanmış WT fare aort hazırlanan tek bir hücre süspansiyonu olarak T hücre popülasyonu belirlemek iç...

Bu makalede, tanımlamak ve hücre içi boyama ile fare böbrek, aort ve lenf düğümleri içinde mevcut fonksiyonel T lenfosit alt grupları ölçmek ve akım sitometri ayrıntılı bir metodoloji sağlar. anjiotensin II hipertansiyon modeli açıklamak adım-adım, usul ve flow sitometri temel ilkelerine ve hücre içi boyama seçildi.

Hücre içi Boyama ve Sitometrisi Hipertansiyon Modelinde Fare Aort, Böbrek ve Lenf düğümleri içinde lenfosit alt tanımak

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Bu protokolün genel amacı, angiotensin II ile indüklenen hipertansiyon modelinde immün hücreleri niceliksel olarak belirlemek ve karakterize etmek için fare aortu, böbreği ve lenf düğümlerinden tek hücreli süspansiyonlar elde etmektir. Bu yöntem, hipertansiyon gelişimini hangi iki lenfosit alt kümesinin desteklediği gibi kardiyovasküler hastalıklar alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, solid organlardaki immün hücre alt kümelerinin tek hücre düzeyinde tanımlanmasına ve miktarının belirlenmesine olanak tanımasıdır.Prosedüre başlamadan önce fare göğsünü %70 ethanol ile dezenfekte edin. Ardından, kalbi açığa çıkarmak için makas kullanarak deri ve göğüs duvarını dikkatlice açın. Damar sistemini perfüze etmek için sağ atriumda küçük bir insizyon yapın ve soğuk PBS'den en az 10 mililitreyi, saniyede yaklaşık bir mililitre hızla sol ventrikül apeksine sabit bir şekilde enjekte edin.Tüm organlar beyazlaştığında, kapsülleri yırtmamaya dikkat ederek abdominal aortik drenaj lenf nodlarını çıkarmak için ince diseksiyon pensleri kullanın. Bir diseksiyon mikroskobu altında, iki böbreği ince makasla çıkarın. Ardından, çevredeki perivasküler yağın

intracellular-staining-flow-cytometry-to-identify-lymphocyte-subsets

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu yazıda, aorta bağışıklık kompozisyonu araştırmak için flow sitometri tabanlı bir yöntem sunmaktadır. Kağıt aynı zamanda çevresindeki adventisya ve damar duvarında ayrı ayrı inceleyerek sağlayan ek bir teknik göstermektedir. Bu yöntem, aort lökositlerin fenotipik analizler gerçekleştirmek ve ateroskleroz çalışmalar için çeşitli immünolojik testleri uygulamak için imkanlar açılır.

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Histokimyasal ve immünohistokimyasal analizle birlikte aort sinüsünün ve çıkan aortun hassas kesitini kullanarak fare modellerinde aterosklerotik lezyonları ölçmek ve karakterize etmek için prosedürleri açıklıyoruz.

Murin Aort Sinüsünde Aterosklerotik Lezyonların Kantitatif Analizi ve Karakterizasyonu

Vasküler hücre fonksiyonu, hücre içi habercilerin aktivitesine bağlıdır.  Burada tarif edilen, izole bir aortun bireysel endotel ve düz kas hücrelerinde fizyolojik ve farmakolojik uyaranlara yanıt olarak hücre içi kalsiyum ve nitrik oksit seviyelerinin ölçülmesine izin veren bir ex vivo iki foton görüntüleme yöntemidir.

Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Bir İzole Sıçan Aort Kullanım ve Endotel Nitrik Oksit Üretimi ve düz kas hücreleri

Monosit arteriogenesis periferik arter hastalığı bağlamında önemli arabulucu vardır. Bu iletişim kuralı bir membran benzeri matris ve intravital mikroskobu kullanarak, monosit enjeksiyon femoral arter ligasyonu fare modeli sonra monosit izleme ve tümör ile ilgili angiogenez inceler.

Monosit posta ve tümör ile ilgili angiogenez periferik arter hastalığı, bir fare modeli intravital mikroskobu

Bu el yazması transgenik muhabir fare kullanımı ve bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu değerlendirmek için kan damarlarının intravital video mikroskobu kullanılarak Anjiyotensin II kaynaklı hipertansiyonda floresan boyalar farklı yönetim yollarını açıklar ve onların yetenek rulo ve endotel için uygun.

Lökosit haddeleme ve yapışma Anjiyotensin II-infüzyon farelerde görselleştirme: teknikleri ve Püf noktalar

Bu iletişim kuralının amacı lenfatik endotel hücre popülasyonlarının içinde açıklanan işaretçileri kullanarak karaciğer belirlemektir. Biz collagenase IV ve DNaz ve yumuşak dokusu, lenfatik endotel hücreleri farklı nüfusu tanımlamak için akış sitometresi ile birlikte kıyma kullanmaktadır.

Lenfatik endotel hücreleri akış sitometrik çözümlenmesi için fare karaciğer sindirim

Biz hayvan diseksiyon, doku gömme, kesit, Boyama, ve brachiocephalic arterler analizini sistematik yöntemleri de dahil olmak üzere son aşama fare aterosklerotik lezyonları hücresel bileşimi karakterize etmek için standart bir protokol öneriyoruz atheroprone düz kas hücre soy izleme fare.

Kantitatif analiz düz kas hücre soy izleme farelerin gelişmiş aterosklerotik lezyonları içinde hücresel kompozisyon

Burada, murine dalak, kemik iliği, lenf düğümleri ve sinovyal doku içinde hem ekstra hem de hücre içi boyama tahlilleri kullanarak monosit/makrofaj ve T hücrealt kümelerini tanımlamak için ayrıntılı ve tekrarlanabilir akış sitometri protokolünü tanımladık ve murine osteoartritin yerleşik bir cerrahi modelini kullanıyoruz.

Bir Osteoartrit Modelinde Minör Dalak, Kemik İliği, Lenf Düğümleri ve Sinovyal DokuDaki İmmün Hücre Alt Kümelerinin Akış Sitometri Analizi

Viral enfeksiyonutaki böbrek, nispeten çok sayıda CD8+ T hücrebarındırır ve mukozal olmayan TRM hücrelerini inceleme fırsatı sunar. Burada, akış sitometri analizi için fare böbrek lenfositleri izole etmek için bir protokol açıklar.

Akış Sitometri Analizi için Fare Böbrek-Resident CD8+ T hücrelerinin izolasyonu

Lökosit ve trombositlerin işe alınması, arteriyogenez sırasında kollateral arterlerin etkili büyümesi için gerekli olan önemli bir bileşeni oluşturur. Multifoton mikroskopisi, arteriyogenez sırasında lökosit alımını ve ekstravazasyonunu incelemek için in vivo yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe ve daha az foto-toksisiteye sahip hücre dinamiklerini izlemek için etkili bir araçtır.

Bir Murin Arka Bacak Modelinde Arteriyogenez Sırasında Lökosit Alımını İzlemek için Multifoton İntravital Görüntüleme

Burada, murin aortunu üç boyutlu (3D) olarak görüntülemek için optimize edilmiş doku temizleme protokolleri sunuyoruz. Aterosklerozda adventiti ve aterosklerozda periferik sinir sisteminin aterosklerotik plaklarla anatomik yakınlığını tanımlamak amacıyla immün boyama, optik temizleme ve görüntüleme için son teknoloji prosedürleri betimliyoruz.

Aterosklerozda Aort Dokularının Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Öğrenin hipertansiyon modelinde fare aort, böbrek ve lenf düğümlerinden tek hücreli süspansiyon hazırlama ve akış sitometrisi ile T lenfosit alt kümelerini tanımlama. Bu yöntem kardiyovasküler hastalıklarda immün yanıtları incelemek için güçlü bir araç sunar.

Hücre içi Boyama ve Sitometrisi Hipertansiyon Modelinde Fare Aort, Böbrek ve Lenf düğümleri içinde lenfosit alt tanımak

Daha fazla video keşfet