Hücre içi Boyama ve Sitometrisi Hipertansiyon Modelinde Fare Aort, Böbrek ve Lenf düğümleri içinde lenfosit alt tanımak

Bu protokolün genel amacı, anjiyotensin II ile indüklenen hipertansiyon modelinde bağışıklık hücrelerini ölçmek ve karakterize etmek için murin aort, böbrek ve lenf düğümlerinden tek hücreli süspansiyonlar elde etmektir. Bu yöntem, hangi iki lenfosit alt kümesinin hipertansiyon gelişimini teşvik ettiği gibi kardiyovasküler hastalık alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, katı organlardaki bağışıklık hücresi alt kümelerinin tek hücre düzeyinde tanımlanmasına ve miktarının belirlenmesine izin vermesidir.

Prosedüre başlamadan önce, fare göğsünü% 70 etanol ile dezenfekte edin. Ardından, kalbi ortaya çıkarmak için cildi ve göğüs duvarını dikkatlice açmak için makas kullanın. Damar sistemini perfüze etmek için, sağ atriyumda küçük bir kesi yapın ve sol ventrikülün tepesine saniyede yaklaşık bir mililitre oranında en az 10 mililitre soğuk PBS enjekte edin.

Tüm organlar beyazladığında, abdominal aort drenajlı lenf düğümlerini çıkarmak için ince diseksiyon forsepsleri kullanın ve kapsülleri yırtmamaya dikkat edin. Diseksiyon mikroskobu altında, iki böbreği ince bir makasla çıkarın. Daha sonra, kalpten başlayıp iliak bifurkasyonda sona eren tüm torasik ve abdominal aortu incelemek için ince kavisli makas kullanın ve çevredeki perivasküler yağın aorta bağlı kalmasına dikkat edin.

Daha sonra, böbrekleri 10 mililitre böbrek sindirim çözeltisi içeren bir ayrışma tüpüne aktarın ve üreticinin talimatlarına göre böbrek dokusunu mekanik olarak ayırmak için yarı otomatik bir ayrıştırıcı kullanın. Ayrışmanın sonunda, numuneleri sürekli rotasyon altında 37 santigrat derecede inkübe edin. 20 dakika sonra, %5 FBS ile takviye edilmiş soğuk RPMI 1640 besiyeri ile enzimatik sindirimi hemen durdurun ve elde edilen doku bulamacını 40 mikronluk bir süzgeçten 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün

Kalan dokuyu ayırmak için pistonu bir mililitrelik şırıngadan kullanın. Daha sonra hücreleri santrifüjleme ile peletleyin. Peletleri üç mililitre% 36 yoğunluk gradyan ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Katmanları rahatsız etmemeye dikkat ederek hücrelerin altına üç mililitrelik %72 yoğunluklu gradyan ortamını nazikçe katmanlayın ve hücreleri santrifüjleme ile ayırın. Bağışıklık hücreleri arayüzde yer alacaktır. Hücresel kalıntı içeren en üstteki sarımsı tabakayı çıkarın ve ardından soğuk PBS kullanarak hacmi 15 mililitreye getirin.

Gradyanı kırmak için iyice çalkalayın ve ardından hücreleri santrifüjleme ile yıkayın. Aort bağışıklık hücrelerini izole etmek için, aortu buz üzerinde bir mililitre taze hazırlanmış aort sindirim solüsyonu içeren iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüm aortu ince parçalar halinde doğramak için ince makas kullanın. Daha sonra parçaları 30 dakikalık sürekli dönüş için 37 santigrat derecede inkübe edin.

Sindirimin sonunda, sindirim çözeltisinin hacminin beş katı kadar% 5 FBS ile desteklenmiş soğuk RPMI ekleyin ve elde edilen doku bulamacını 40 mikronluk bir süzgeçten süzün. Daha sonra tek hücreli süspansiyonu santrifüjleme ile toplayın ve peleti FBS ile taze RPM'de yeniden süspanse edin. Aort drenajlı lenf düğümlerinden tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için, lenf düğümlerini 60 x 15 milimetrelik bir doku kültürü kabında 40 mikronluk bir süzgecin üzerine aktarın ve dokuyu ayırmak için bir mililitrelik bir şırınga pistonu kullanın.

Daha sonra süzgeci iki mililitre RPMI artı FBS ile yıkayın ve serbest kalan hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri uyarmak için, önce her bir hücre süspansiyonunu, hücre kültürü ortamında mililitre konsantrasyonunda bir kez 10 ila altıncı hücreye ayarlayın. Daha sonra, her bir mililitre ortam için her bir hücre grubuna iki mikrolitre hücre aktivasyon kokteyli ekleyin.

Daha sonra, 12 oyuklu bir plakaya oyuk başına 10 ila altıncı aort veya böbrek hücresine bir ila iki kez 10 ila 24 oyuklu bir plakaya aktarın. Plakaları üç saat boyunca 37 santigrat derece nemlendirilmiş karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Daha sonra hücreleri uygun karşılık gelen polistiren FACS tüplerine aktarın ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin.

Hücreleri aynı santrifüj koşullarında taze FACS tamponu ile iki kez yıkadıktan sonra, spesifik olmayan yüzey bağlamasını FC bloğu ile bloke edin ve hücreleri PBS'de yıkayın. Peletleri bir mililitre taze PBS'de yeniden süspanse edin ve hücreleri, ışıktan korunarak dört santigrat derecede 15 dakika boyunca bir mikrolitre hücre geçirmez amin reaktif canlılık lekesi ile boyayın. İnkübasyonun sonunda, hücreleri bir ila iki mililitre FACS tamponunda iki kez daha yıkayın ve peletleri uygun hücre yüzeyi boyama antikor kokteylinin 100 mikrolitresinde yeniden süspanse edin.

Dört santigrat derecede 30 dakika bekletildikten ve ışıktan korunduktan sonra, hücreleri iki mililitre taze FACS tamponunda iki kez daha yıkayın ve hücreleri üreticinin talimatlarına göre bir fiksasyon ve geçirgenlik kiti ile sabitleyin ve geçirgenleştirin. Daha sonra, hücreleri ilgilenilen hücre içi antikor kokteyli ile etiketleyin ve hücreleri tekrar FACS tamponunda yıkayın. Uyarılmış hücre içi sitokin üretiminin akış sitometrik analizi için, spektral örtüşmeyi ayarlamak için önce boyanmamış ve tek lekeli kontrol tüplerini çalıştırın, ardından paneldeki her florofor için floresan-eksi bir kontrolleri izleyin.

Temel floresan analiz parametreleri ayarlandığında, lökosit popülasyonu tespiti için birincil kapıyı ayarlamak için ileriye doğru bir saçılma alanı grafiği kullanın, ardından ölü hücreleri canlılık-leke ifadesi eksikliğine göre hariç tutmak için geçit kullanın. Çiftleri dışlamak için ileri dağılım alanını ileri dağılım yüksekliğine ve kapısına göre çizin. Lökositler daha sonra CD45 ekspresyonu ile tanımlanabilir.

Murin böbreği veya aortu ile IL-17A veya IL-17F üreten T hücrelerinin varlığını belirlemek için, her bir sitokinin floresan eksi bir kontrol analizi için gösterildiği gibi tek hücreli süspansiyonlar hazırlanabilir. Beklendiği gibi, floresan eksi bir kontrollerde IL-17A veya IL-17F için çok az hücre pozitiftir, bu da IL-17A veya IL-17F pozitif hücrelerin tanımlanması için kapıları uygun şekilde ayarlamak için pozitif ve negatif sinyallerin doğru bir şekilde ayırt edilmesine izin verir. Böbrekten izole edilen T hücrelerinin ve araç veya anjiyotensin II ile infüze edilen vahşi tip farelerin aortunun temsili hücre içi boyanması, her iki dokuda IL-17A veya IL-17F eksprese eden T hücrelerinin bir alt kümesinin varlığını ortaya çıkarır.

Ayrıca, aort drenajlı lenf düğümlerinden T hücrelerinin hücre içi boyanması, CD8 pozitif T hücrelerinin anjiyotensin II stimülasyonunu takiben interferon gama ve T-bet eksprese ettiğini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, işlenen doku sayısına bağlı olarak altı ila dokuz saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, hücre ölümünü en aza indirmek için hızlı ve verimli bir şekilde çalışmak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, murin böbrek, aort ve lenf düğümlerinden tek hücreli süspansiyonun nasıl oluşturulacağını ve bu organlardan bağışıklık hücresi alt kümelerini karakterize etmeyi ve ölçmeyi iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik, kardiyovasküler ve böbrek fizyolojilerinin, hipertansiyon ve diğer proinflamatuar hastalıklara katkıda bulunabilecek bağışıklık hücresi popülasyonlarındaki değişiklikleri keşfetmesine izin verir.