İnsan Pankreas Geliştirme Lineage Belirleyicileri sorgulanması için Genom Düzenleme ve hPSCs arasında Yönetmen Farklılaşma

Bu protokol, hPSC'lerde hızlı genom düzenleme için iCRISPR platformunun nasıl kurulacağını ve insan pankreas gelişimini ve hastalığını incelemek için genom düzenlenmiş hatların hPSC'ye yönelik pankreas farklılaşması ile nasıl dahil edileceğini gösterir. Bu yöntemler, normal pankreas gelişiminin genetik kontrolü ve diyabetin moleküler temeli gibi insan pankreas gelişimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniklerin temel avantajı, hPSC'lerde ilgilenilen genleri verimli bir şekilde değiştirmemize ve bu değiştirilmiş hücre dizilerini insan pankreas gelişimi ve in vitro hastalık çalışmaları için kullanmamıza izin vermesidir.

Kesilmiş insan vitronektin kaplı tabaklarda kimyasal olarak tanımlanmış ve besleyici içermeyen koşullarda kültür hPSC'leri. Elektroporasyondan bir gün önce, ortam değişimi sırasında 10 mikromolar ROCK inhibitörü ekleyin. Elektroporasyon gününde, vitronektin kaplı 10 santimetrelik yemekleri önceden hazırlayın.

Daha sonra kültür ortamını hücrelerden çıkarın, kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile bir kez yıkayın, ardından hücreleri yaklaşık üç dakika boyunca 37 santigrat derecede 1X ayrışma reaktifi ile tedavi edin. Daha sonra, hücreler ayrılmadan önce ayrışma reaktifini aspire edin ve 10.5 mililitre tam ortam ekleyin. Santrifüj tüplerine aktarmadan önce tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için nazik pipetleme kullanın.

Otomatik bir hücre sayacı kullanarak 500 mikrolitre hücre süspansiyonunda hücre sayımı gerçekleştirin. Daha sonra hPSC'leri beş dakika boyunca 200 kez G'de pellet yapın. Hücreleri soğuk PBS'de 12.5 kez mililitre başına 10 ila altıncı hücrede yeniden süspanse edin ve 800 mikrolitrelik hacimlere alikot edin.

Plazmitleri her 800 mikrolitrelik hPSC süspansiyonuna ekleyin ve iyice karıştırın. Karışımı 0,4 santimetrelik bir elektroporasyon küvetine aktarın ve yaklaşık beş dakika buz üzerinde tutun. 250 volt ve 500 mikrofarad'da bir elektroporasyon sistemi kullanarak hücreleri elektroporate edin.

Genom düzenleme için sağlıklı ve çoğalan hPSC'leri kullanmak çok önemlidir. Elektroporasyondan sonra, hücreleri beş mililitre önceden ısıtılmış, tam ortam içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve ardından hücreleri topaklayın. Hücreleri 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile 10 mililitre tam ortamda yeniden süspanse edin ve her elektroporasyondan bir kez 10 ila altıncı, 2.5 kez 10 ila altıncı ve beş kez 10 ila altıncı hücreler vitronektin kaplı kaplar üzerine plakalayın, böylece plakalardan en az biri toplama için yeterli tek hücreli kolonilere sahip olacaktır.

Hücreleri 37 santigrat derecede kültürleyin. İkinci günde, mililitre G418 sülfat başına 500 mikrogram içeren ortam ekleyerek neomisin seçimine başlayın. Altıncı günde, mililitre puromisin dihidroklorür başına bir mikrogram içeren ortam ekleyerek puromisin seçimine başlayın.

10 ila 12. günlerde, hPSC tek hücreli kolonilerin çapı bir ila iki milimetreye ulaşacaktır. Bu noktada, stereo mikroskop altında 12 ila 24 koloni seçin. hPSC kolonilerini 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak mekanik olarak küçük parçalara ayırın ve hücreleri doğrudan vitronektin kaplı 24 oyuklu plakalara aktarın.

Kılavuz RNA transfeksiyonundan 24 saat önce, iCas9 hPSC'leri mililitre doksisiklin başına iki mikrogram ile tedavi edin. Transfeksiyon gününde, vitronektin kaplı 24 oyuklu plakalar hazırlayın ve iCas9 hücrelerini daha önce olduğu gibi 1X ayrışma reaktifi kullanarak tek hücrelere ayırın. Daha sonra, hücreleri beş dakika boyunca 200 kez G'de pelet haline getirin ve hücreleri, mililitre başına iki mikrogram doksisiklin ve 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş tam ortamda mililitre başına 0.5 kez 10 ila altıncı hücrede yeniden süspanse edin.

Yeniden süspanse edilmiş hücrelerin 500 mikrolitresini 24 oyuklu plakanın ayrı kuyucuklarına yerleştirin. Her kılavuz RNA için aşağıdaki transfeksiyon karışımlarını yapın. A, 50 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı ve bir mikrolitre kılavuz RNA'yı karıştırın.

B, 50 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı artı üç mikrolitre transfeksiyon reaktifini karıştırın. 100 mikrolitrelik bir karışım yapmak için A ve B karışımını birleştirin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Karışımın 50 mikrolitresini 24 oyuklu plakanın çift oyuklarındaki hücrelere ekleyin ve iyice karıştırın.

Dört gün sonra, genomik DNA'yı çıkarın, PCR, kılavuz RNA hedefleme dizilerini çevreleyen hedef bölgeleri çoğaltın ve T7E1 sindirimini kullanarak düzenleme verimliliğini tahmin edin. Tohumlamadan iki gün sonra hücreler %80 birleşmeye ulaştığında hPSC hatlarının farklılaşmasına başlayın. Farklılaştırma günü sıfır ortamı ekleyin ve ardından burada gösterilen formülleri kullanarak ortamı günlük olarak değiştirin.

10. günde, hücrelerin bir alt kümesini immünofloresan boyayarak daha sonraki pankreas progenitörü PP2 belirteçlerini, PDX1 ve NKX6.1'i inceleyin. Daha sonra, PP2 hücrelerini dört saat boyunca 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile muamele ederek hava-sıvı arayüz kültürüne devam edin. Kuluçka süresi geçtikten sonra, hücreleri daha önce olduğu gibi ayırın.

Farklılaşmanın hava-sıvı arayüz aşamasında tohumlama için hücre sağkalımını en üst düzeye çıkarmak için ayrışma reaktif muamelesinin süresini en aza indirin. Hücreler ayrılmadan önce ayrışma reaktifini aspire edin. Daha sonra plakaya 10 mililitre boo-lah ortamı ekleyin ve PP2 hücrelerini hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek tek hücrelere dağıtın.

Tek hücreli süspansiyonu toplayın. Hücre sayısını sayın ve hücreleri topaklayın. Hücre peletini S5 farklılaşma ortamında yeniden süspanse ettikten sonra, bir transwell ekleme filtresinde nokta başına beş ila 10 mikrolitre hücre tespit edin.

Her bir transwell ekinin altına S5 besiyeri ekleyin ve pankreas endokrin belirteçleri immünofloresan boyama ile tespit edilebilene kadar ortam değişiklikleri ile inkübe edin. Bu şekil, hPSC'lerde iCRISPR aracılı homolog olmayan uç birleştirmeyi göstermektedir. Gen nakavt, herhangi bir seçim süreci söz konusu olmadığından ve %20 ila %50 bialelik mutantlara kolayca ulaşılabildiğinden oldukça verimlidir.

Verimli ve kesin genetik değişiklikler için, kılavuz RNA'lar, kırmızı ile gösterilen spesifik dizi değişikliğini taşıyan tek sarmallı bir DNA donörü ile birlikte transfekte edilir. Genellikle, modifiye edilmiş alellerde yeniden kesmeyi önlemek için, burada yeşil renkle gösterilen PAM dizisine sessiz bir mutasyonun dahil edilmesi önerilir. Bu sistemle, her iki alelde ek değişiklikler olmaksızın, istenen homolojiye yönelik onarım aracılı genom modifikasyonunu taşıyan klonların yaklaşık% 10'u elde edilebilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, yeni bir iCas9 hPSC hattı kurmak iki aydan az sürer. Bundan sonra, bir ila iki ay içinde çeşitli hPSC mutant koloni hatları oluşturulabilir. hPSC genetik mutant hatlarının oluşturulmasını takiben, mutant hücre hatlarının pankreas beta benzeri hücrelere in vitro kademeli olarak farklılaşması, bu mutasyonlardan etkilenen spesifik gelişimsel adımları incelememize olanak tanır ve bu da altta yatan hastalık mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasını sağlar.