Name: İnsan Pankreas Geliştirme Lineage Belirleyicileri sorgulanması için Genom Düzenleme ve hPSCs arasında Yönetmen Farklılaşma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Keşfedin iCRISPR platformu ile hPSClerde genom düzenleme ve pankreas beta benzeri hücrelere yönlendirilmiş farklılaşma yöntemlerini. Bu teknikler insani pankreas gelişimi ve diyabet hastalık mekanizmalarının incelenmesine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma NIH / NIDDK (R01DK096239) ve New York Eyalet Kök Hücre Bilimi (NYSTEM C029156) tarafından kısmen finanse edildi. ZZ Sloan Kettering Enstitüsü Kök Hücre Biyolojisi Merkezi&#39;nden NYSTEM doktora sonrası burs tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+mice%3A+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).</li>
<li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).</li>
<li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11 (7), 514-518 (2001).</li>
<li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).</li>
<li>González, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+iCRISPR+Platform+for+Rapid%2C+Multiplexable%2C+and+Inducible+Genome+Editing+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">An iCRISPR Platform for Rapid, Multiplexable, and Inducible Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 215-226 (2014).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5 (5), 389-392 (2008).</li>
<li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+of+Lineage+Determinants+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Reveals+Mechanisms+of+Pancreatic+Development+and+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome Editing of Lineage Determinants in Human Pluripotent Stem Cells Reveals Mechanisms of Pancreatic Development and Diabetes.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 755-768 (2016).</li>
<li>Kotini, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+a+chromosomal+deletion+associated+with+myelodysplastic+syndromes+using+isogenic+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).</li>
<li>Carlson-Stevermer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Content+Analysis+of+CRISPR-Cas9+Gene-Edited+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">High-Content Analysis of CRISPR-Cas9 Gene-Edited Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 109-120 (2016).</li>
<li>Zhu, Z., Verma, N., Gonzalez, F., Shi, Z. D., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas-Mediated+Selection-free+Knockin+Strategy+in+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas-Mediated Selection-free Knockin Strategy in Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (6), 1103-1111 (2015).</li>
<li>Mandegar, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+Interference+Efficiently+Induces+Specific+and+Reversible+Gene+Silencing+in+Human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR Interference Efficiently Induces Specific and Reversible Gene Silencing in Human iPSCs.</a> Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+functional+glucagon-secreting+alpha-cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Production of functional glucagon-secreting alpha-cells from human embryonic stem cells.</a> Diabetes. 60 (1), 239-247 (2011).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+molecule+that+directs+differentiation+of+human+ESCs+into+the+pancreatic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A small molecule that directs differentiation of human ESCs into the pancreatic lineage.</a> Nat Chem Biol. 5 (4), 258-265 (2009).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+NKX6-1%2B+pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li>
<li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO J. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li>
<li>Zhu, Z., Gonzalez, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods Enzymol. 546, 215-250 (2014).</li>
<li>Soh, C. L., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-Mediated+Mutagenesis+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+Defined+Xeno-Free+E8+Medium%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Human Pluripotent Stem Cells in Defined Xeno-Free E8 Medium.</a> Methods in Molecular Biology. 1498, (2017).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).</li>
<li>Kelly, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+markers+for+the+isolation+of+pancreatic+cell+types+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 750-756 (2011).</li>
<li>Musunuru, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+of+human+pluripotent+stem+cells+to+generate+human+cellular+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Genome editing of human pluripotent stem cells to generate human cellular disease models.</a> Dis Model Mech. 6 (4), 896-904 (2013).</li>
<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li>
<li>Yusa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+correction+of+alpha1-antitrypsin+deficiency+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeted gene correction of alpha1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+genome+editing+using+ssDNA+oligonucleotides+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases.</a> Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).</li>
<li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+incidence+of+off-target+mutations+in+individual+CRISPR-Cas9+and+TALEN+targeted+human+stem+cell+clones+detected+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Gene-Corrected+Adult+Beta+Globin+Protein+in+Human+Erythrocytes+Differentiated+from+Patient+iPSCs+After+Genome+Editing+of+the+Sickle+Point+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Production of Gene-Corrected Adult Beta Globin Protein in Human Erythrocytes Differentiated from Patient iPSCs After Genome Editing of the Sickle Point Mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li>
<li>Shi, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+in+hPSCs+Reveals+GATA6+Haploinsufficiency+and+a+Genetic+Interaction+with+GATA4+in+Human+Pancreatic+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome Editing in hPSCs Reveals GATA6 Haploinsufficiency and a Genetic Interaction with GATA4 in Human Pancreatic Development.</a> Cell Stem Cell. , in press (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Yaratma Mutant Hatları Zaman Hususlar genom düzenleme için CRISPR / Cas sistemlerine dayanan son yaklaşımlar başarılı hedefleme yol açmıştır rağmen, daha etkili ve evrensel bir platform gen fonksiyonu analizleri daha büyük ölçekli tercih olacaktır. ICRISPR platformu ilgi 5, 9 herhangi bir gen mutasyonu tanıtmak için hızlı ve etkili bir yöntem sunmaktadır. İlk olarak, PCR bazlı gRNA sentez yöntemi zaman alıcı klonlama adımları olmadan bir gün içinde dizilmiş biçimde gRNAs yüzlerce üretimine olanak sağlar. İkinci olarak, iCas9 hPSCs doksisiklinin indüklenebilir Cas9 ifadesi ile, gRNA transfeksiyon içeren adım iş yalnızca küçük bir miktar gerektirir, ve bu nedenle, çok sayıda gRNA hedefleme deneyleri eşzamanlı gerçekleştirilebilir. Bizim sisteminin analizi ile ulaşılabilir Üçüncü olarak, yüksek hedefleme nedeniyle verimlilik ~ 24 - transfekte gRNA başına 48 koloni suff olmalıdırverimlilik, hedef lokusu bağlı olarak değişir, ancak icient, tek bir gen birden fazla monoallelik ve bialelik mutan çizgileri kurmak. Eğitimli bir kişinin mekanik bir oturuşta 384 koloni (4 x 96-yuvalı plakalar) almak için bir tahlil mikroskobu altında yaklaşık 4 saat için hangi için mümkün olduğu için, eğitilmiş bir kişide 12 genleri etki mutan çizgileri oluşturmak için beklenebilir 12 ay. Kısa bir süre içinde hPSC mutantlarının akıcı üretimi gelişim sürecini 9 düzenleyen birbiriyle etkileşim, transkripsiyon faktörleri ve / veya sinyal yolu bileşenlerinin bir dizi sistematik analiz için izin verir. Ayrıca, verimli çoklanmış gen hedefleme de genetik etkileşmeler altında yatan karmaşık insan özelliklerini araştıran kapıyı açar. Hassas Genetik Değişiklikler Üretimi kolayca erişilebilir somatik hücre tipinden hastaya özgü iPSCs türetilmesi<html> s ve hastalık ilgili hücre tiplerine farklılaşma hastalıkla ilişkili mutasyonlar işlevsel doğrulama için büyük bir fırsat sağlar. Ancak, bireyler arasındaki genetik arka planda önemli değişkenlik, hastalardan iPSCs arasında sağlıklı donörlerden doğrudan karşılaştırmalar bir arka plan etkilerinden hastalık fenotipleri ayırt izin vermeyebilir. Nedenle, tekrar doğal tipte sekansa hastalığı mutasyon düzelterek izogenik kontrol iPSCs oluşturmak için ya da başkalarına 25, 26 tarafından önerilen, bir vahşi tip hPSC plana hastaya özgü mutasyonların katılması için gereklidir. -kaybı fonksiyonu (boş) mutasyona ilave olarak, bir anda daha kesin olarak, hypermorphic hypomorphic, neomorphic, veya baskın negatif hasta da dahil hPSCs endojen mahaline, bir hastaya özgü sekansı değiştirmelerine tanıtım yoluyla hastalık mekanizmalarını incelemek olabilir mutasyonlar. o NHEJ-aracılı DNA tamiri çok daha az etkili olduğu. Bir onarım şablonunun varlığında DSB onarım için HDR istihdam Hassas genetik modifikasyon ntent &quot;&gt;, hastaya özgü mutasyon, bir ilaç seçimi kaset ve homoloji kolları içeren bir donör plazmid en yaygın olarak kullanılan Cre-loxP ve FLP-FRT sistemleri geride bırakırken, daha önce tamir şablonuna 2 olarak kullanılmaya başlanmıştır. ilaç seçimi ve hastaya özgü mutasyon doğrulanmasının ardından, ikinci bir adım genelde. ilaç seçimi kasetini çıkarmak için gerekli olan endojen mahal kalıntı sırası, piggyBac transpozonun kullanımı, ilaç seçme kasetinin 27 kesintisiz uzaklaştırılması için izin vardır. son zamanlarda, kısa bir ssDNA şablonları tasarlanmış DNA endonükleazlar 28 verimli HDR desteklemek için gösterilmiştir. bir verici plazmid ile karşılaştırıldığında , ssDNA doğrudan sentezlenmiş ve böylece zaman alıcı klonlama adımı circumvents edilebilir. Burada olması vardırgösterilen en, bu ko-transfekte homoloji yönelik onarım indükleme gRNA ve ssDNA şablonu iCRISPR yüksek verimlilik, spesifik nükleotid modifikasyonlar için kullanılabilir göre. Bu, aynı zamanda, insan hastalığı mutasyonlar modelleme ve potansiyel terapötik müdahale için, bu hastalıkla ilişkili mutasyonlar düzeltilmiştir protein, fonksiyonel alanları içinde önemli bir nükleotid rolü kesme değildir için önemlidir. Nedeniyle her diyabet gibi karmaşık ve multigenik hastalıkları modelleme, çoklu dizi varyantları ile ilişkili duyarlılık mahallerinin çok sayıda genetikçileri için bir meydan okuma olmuştur. iCRISPR platformu alelik dizi hızlı üretimi için ya multiplexable gen hedefleme için serbest olduğu gibi, ya tek başına ya da izogenik arka ile kombinasyon halinde, birden çok hastalıkla ilişkili lokus araştırma kolaylaştırabilir. Etkinlikleri ve Off-hedef Etkileri Hedefleme Sahibiz<html> T7E1 ve RFLP tahlil sonuçları ve sıralama tarafından tespit mutant satır sayısı arasında iyi bir korelasyon bulunmuştur. Bu klonal hatlarının kurulması ile paralel olarak bu analizleri gerçekleştirerek önemini vurgulamaktadır. En tek gen hedefleme deneyleri, genomik lokusları bağlı olarak değişebilir elde hedefleme verimleri 20 da - klonların% 60 &#39;iki allel mutasyona uğramış bulunmuştur (dahil kare kaymalı mutasyonlar-çerçevede) 9. Çoklanmış gen hedefleme gerçekleştirildi durumlarda,% 5-10 verimliliği ile üçlü bialelik mutant klon 5 elde edilmiştir. % 10 5 - çeşitli genlerin ssDNA aracılı HDR da knock-1 arasında değişen klonların homozigot elde verimliliği ile, kesin genetik değişiklikleri elde etmek üzere gerçekleştirilmiştir. Aynı gRNA hedef dizisi paylaşmayan potansiyel hedef dışı siteleri, hPSCs CRISPR / Cas ile herhangi bir mutasyon Çalışma henüz tespit edilecek olanlass = &quot;xref&quot;&gt; 5, 9, 12. Yeni bir çalışmada gerçekleştirilen tüm genom sıralaması da CRISPR / Cas 29 kullanılarak oluşturulan klonal hPSC hatlarında önemli off-hedef mutasyonları tespit etmek başarısız oldu. Bununla birlikte, hedef dışı etki bölgelerinde mutasyonlarla fenotipleri karıştırıcı herhangi bir potansiyel etkisi en aza indirmek için, aynı gen içinde farklı dizileri hedef alan en azından iki bağımsız gRNAs kullanan bağımsız mutant sıraları oluşturmak için önerilmektedir. birden fazla satır gözlenen benzer fenotipleri esas fenotip bir off-hedef etkisinden geldiğini olasılığını ekarte olabilir farklı gRNAs kullanılarak oluşturulan. Besleyici bağımlı Bağımsız Kültür ve Hedefleme karşı hPSC kültürü için geleneksel yöntemler hayvan eşya içeren serum veya serum değiştirme içeren ortamda besleyici hücreler üzerindeki bakım ve genişleme dahilsığır serum albümini gibi leri,. Besleyici hücreler, serum, serum yerine ve tüm albumin karmaşık, tanımlanmamış bileşenleri içerir ve önemli toplu değişkenlik göstermektedir. besleyici içermeyen ve kimyasal olarak tanımlanmış durumuna uyarlanması anlamlı ve daha da önemlisi, farklılaşma deneyleri tutarlılığını artırır hPSC bakım çalışmalarını azaltır. Şu anda, tam olarak tanımlanmış kültür koşullarında 30 kültüre hPSCs üzerinde genom düzenleme prosedürleri tarif çok az sayıda çalışma vardır. Biz gRNA transfeksiyonu ve klonal yerleştirme besleyici bağımlı kültür koşullarına göre besleyici içermeyen koşullar uygulandı zaman verimliliği hedefleme yüksek CRISPR bulduk. Bu koloni oluşumu için transfeksiyon ve tek hücreli tohumlama sonra artan hücre hayatta kalması nedeniyle olduğuna inanıyoruz. Ayrıca, besleme hücreleri, daha önce bu şekilde transfeksiyon verimini düşürmek, transfeksiyon reaktifleri ayırmak için gösterilmiştir. birleştirmeYönetmen Farklılaşma ile Genom Düzenleme Önceki farklılaşma protokolleri insülin pozitif hücrelerin sadece küçük bir bölümünü ortaya çıkarmıştır, çoğunluğu polyhormonal ve fetal endokrin hücreleri 23 benziyordu. Son yıllardaki gelişmeler, daha olgun glikoz-tepkimeli beta benzeri hücreler 16, 17, 19, 20 içine hPSCs farklılaşmasını izin vermiştir. Rutin HUES8 hPSCs 9 kullanarak en az% 75, kesin endoderm hücreleri,% 40 PDX1 + NKX6.1 + pankreas progenitörler, ve yaklaşık% 20 NKX6.1 + CPEP + glikoz-tepkimeli beta benzeri hücreler elde edebilir. iCRISPR genom düzenleme sistemi ile kombine edildiğinde, bu daha sağlam farklılaşma protokolü pankreas farklılaşma pankreas progenitör ve endokrin aşamaları için çok önemli transkripsiyon faktörlerinin analizi kolaylaştırmıştır. Bu yapacakmümkün, gelecekteki çalışmalarda, diyabet 9 altında yatan mekanizmaların içine fonksiyonel doğrulama ve soruşturma için aday hastalık genlerinin çok sayıda incelemek. Gelecek Uygulamalar veya Tarifi Böyle aracılığıyla muhabir allellerin oluşturulması gibi daha karmaşık genomik değişiklikler, üretilmesini kolaylaştırabilir Bizim iCRISPR sistemi uzun donör DNA şablonları kodlayan protein etiketleri veya floresan gazetecilere 12 kullanarak hedef geni HDR-aracılı. Bu yazıda sistemde elde verimliliği hedef yüksek bir CRISPR için göstermiştir, bu işlem, bundan başka ilaç seçimi 12 gerek kalmadan, hPSCs gerçekleştirilebilir. Ayrıca, hedef çoğullamalı gen biz bu işin 31 ilk örneği olduğuna inanıyoruz bizim son çalışmada gösterildiği gibi, altta yatan karmaşık insan hastalık genetik etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir. iCRISPR ayrıca promoterler ve arttırıcı madde olarak düzenleyici bölgeler, silme oluşturarak ya da kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar bölgesi ya da genin gen düzenleyici kontrol anlamak için kullanılabilir. etkin bir şekilde iCRISPR kullanılarak düzenleme mutantlan oluşturmak için, gRNAs de dahil olmak üzere, bir DNA-bağlama proteini bağlanma bölgesini parçalar için tasarlanmıştır, ancak bazal transkripsiyon makine ya da dokuya özgü bir transkripsiyon faktörü ile sınırlı değildir edilebilir. ssDNA şablonu aracılı HDR de özel protein bağlama siteleri mutasyona kullanılabilir. Son olarak, bir in vitro farklılaşma protokolü ile kombine edildiğinde daha fazla optimizasyon pluripotense fenotipleri veya hastalık fenotiplerinin daha yüksek verim, genetik analizler için hPSCs içinde iCRISPR platformun kullanılması mümkün olabilir öngörmektedir. Bu iCRISPR aracılı çalışmalar aday hastalıkla ilişkili genlerin ve fonksiyonel alaka çalışmaların daha hızlı belirlenmesi için izin verebilir.

Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) yeteneğine sahip, hem kendini yenilemek ve üç embriyonik germ soy tüm türevleri doğuran. Onlar insan gelişim bağlamında hücresel süreçleri özetlemek için eşsiz bir platform olarak hizmet vererek hücre replasman tedavisi ve hastalık modelleme için değerli bir kaynak sağlamaktadır. Onlar da ölçeklenebilir, yüksek hacimli analizler için deneysel bir hücre kaynağıdır. verimli genetik modifikasyon araçları eksikliği ve kültür çanak karmaşık embriyonik gelişim aşamaları yansıtan zorluk: Ancak, ilerleme nedeniyle iki ana zorluklar sınırlı kalmıştır. Genetik modifikasyon, normal gelişim ve hastalık gen fonksiyonunu incelemek için vazgeçilmez bir araçtır. Homolog rekombinasyon yoluyla yaklaşımlar hedefleme klasik gen kanıtlamıştır Bununla birlikte, fare embriyonik kök hücreleri (mESCs) gen fonksiyonu incelemek için güçlü bir araç 1, bu yaklaşım içinhPSCs 2, 3 uygulandığında derece verimsiz olmuştur. çinko parmak nükleazların (ZFNs), transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazların (Talens) ve kümelenmiş düzenli interspaced kısa yineleyen tekrarlar (CRISPR) / CRISPR ilişkili olmak üzere laboratuvar kullanımı için doğadan programlanabilir, siteye özgü nükleazların, son tempolu katılım (CA) sistemler 4, genom mühendisliği hPSCs de dahil olmak üzere, organizmalar ve hücreler geniş bir aralık içinde bir çok daha kolay bir görev haline anlamına gelir. Bu gen düzenleme araçları gibi Cas9 endonükleaz olarak kimerik nucleaseleri ya non-homolog etkinleştirmek için, kesin yerlerde çift sarmallı sonları (DSBs) indükleyen endojen DNA onarım makineleri tetikleyerek genetik modifikasyon bir dizi izin gerçeği yararlanmak (NHEJ) katılmadan sona erdirmek veya homoloji yönettiği onarım (HDR). Her iki mekanizma da eith indükleyerek genetik manipülasyonu için faydalanılabilirER rastgele sokma ve silme mutasyonu (indeller; NHEJ ile), bir insan hastalığı modelleme hasta mutasyonlar özetlemek için veya gen terapisi için, hastalığa neden olan mutasyon düzeltmek için, gen alellerini ya da (HDR ile) hassas nükleotid ikameleri geçersiz kare kaymalı mutasyonlar yaratmak . DNA hedef tanıma belirten DNA bölünme ve değişken CRISPR RNA (crRNA) ve trans-aktive (tracrRNA) dubleks için gerekli sabit RNA güdümlü Cas9 endonükleaz: CRISPR / Cas-aracılı genom mühendislik iki bileşen gerektirir. CrRNA / tracrRNA dupleks daha verimli 5, 6, 7 iş bulunmuştur tek kimerik kılavuz RNA (gRNA) ile ikame edilmiş olabilir. CRISPR / Cas9 sistemi en deneysel organizma ve hücre çizgileri, Cas9 ve gRNA önemli ölçüde farklılık gösterir teslimatı ve ifade için uyarlanmıştır ve ihtiyacı olsa da daha achi için optimize edilmesihPSCs 8 dahil olmak üzere birçok sistemlerinde, arife verimli genom düzenleme. Verimli bir genom düzenleme platformu, iCRISPR, hPSCs 5 kurulmuştur. Bu sistemde, bir TALEN aracılı yaklaşım (TRE ters tetrasiklin kontrollü transaktivatör (M2rtTA) ve bir tetrasiklin tepki elemanı diğer trans, tek bir allel &quot;transgen güvenli liman lokusu&quot; AAVS1 iki alellerini hedeflemek için kullanılmıştır ) hPSCs bölgesindeki Cas9 (iCas9 ekspresyonunu) tahrik etmek. Kurulan klonal hatları (iCas9 hPSCs) &#39;de, Cas9 yüksek doksisiklin tedavisi ile ifade edilmektedir. Öte yandan, küçük boyutu (100 nt), tek ya da çoklu gRNAs kolayca yüksek verimle iCas9 hPSCs içine taşınabilir ve HDR aracılı hem de verimli NHEJ-aracılı gen bozulmasını sağlayan siteye özgü bölünme için Cas9 yönlendirebilir kısa tek bağlı DNA (ssDNA) verici şablonları mevcudiyetinde hassas nükleotid değişiklikleri. iCRISPR sistem olabilirbaşarılı bir şekilde, 9 önemli bir gelişim genlerin 5 bialelik (homozigot ya da heterozigot) ya da heterozigot-kaybı fonksiyonu mutasyonlu hastalık taklit hPSC soylarının bir paneli oluşturmak için kullanılır. Bir takım uzmanlar, hPSCs CRISPR / Cas kullanılarak etkin gen düzenleme rapor ederken, başarılı teknolojik usta laboratuarlarının az sayıda sınırlı kalmaktadır. ICRISPR platformu farklı beceri düzeylerinin araştırmacılar tarafından rutin gen düzenleme için etkin henüz basit bir çözüm sunar ve zaten bizim grup ve diğerleri 9, 10, 11, 12 ile yayınlanmış çalışmaların bir dizi kullanılır olmuştur. Bu yaklaşım, aynı zamanda daha dCas9-KRAB 13 sentezlenmesi göre uyarılabilir susturulması uzatıldı. genom düzenleme tekno ilerleme ile birliktelogy, önemli gelişmeler de hPSC bakım ve yönetmenliğini farklılaşma elde edilmiştir. HPSCs Kültür koşulları ışınlanmış fare embriyonik fibroblast (IMEF) besleyici bağımlı tanımlanan hücre dışı matris bileşenleri üzerinde besleyici içermeyen koşullarına ve karmaşık medya formülasyonları kimyasal olarak tanımlanmış orta şartlarda 14 evrimleşmiş. Bu gibi gelişmeler IMEF hazırlanması ve nakavt Serum değiştirme bileşenleri partiden partiye farklılıklar nedeniyle hPSCs değişkenlik azalır ve böylece hPSC farklılaşması için bir daha tekrarlanabilir bir ortam sağlar var. Bu arada, yüksek verimli ilaç gösterimleri insan embriyonik gelişmeyi yöneten yollar, yanı sıra keşifler sinyalizasyon geliştirilmiş bilgi, gelişmiş farklılaşma protokolleri 15, 16, 17, 18 yol açmıştır. Bu protokoller daha yakından viv taklito gelişimsel adımlar yakından in vivo meslektaşları özetlemek hücre tiplerini oluşturur ve. Pankreas soy içine hPSC farklılaşma, ilk protokoller nispeten iyi ama sonunda olgunlaşmamış cenin fenotip ve glikoz uyarısına kötü yanıt polyhormonal β hücreleri oluşturulan erken pankreas gelişimini taklit etti. Son gelişmeler 16, 17, 19, 20 gibi oluşumu ve monohormonal β hücrelerin daha da olgunlaşması gibi daha sonraki olayları incelemek için sağlayacak glükoz duyarlı pankreatik β-benzeri hücrelerin üretilmesi için mümkün hale gelmiştir. Burada, detay glikoz duyarlı pancr doğru hPSC tabanlı in vitro farklılaşma platformu ile iCRISPR sistemini birleştirerek pankreas gelişim çalışmaları için genom modifiye hatları uygulamasıeatic β-benzeri hücreler. Geliştirilmiş bir hPSC farklılaşma protokolü ile güçlü genom düzenleme araçları Bu bağlantı hastalık nedensellik doğrulamak için artan talebi karşılamak için gerekli hız ve ölçek sunuyor, ama aynı zamanda normal gelişimini ve hastalık 9 yatan transkripsiyonel kontrolü içine daha fazla mekanik araştırmalar için gelişmiş genetik manipülasyonlar sağlar sadece .

<table><tbody><tr><td>Kimyasal olarak tanımlanmış ortam (E8)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>Esansiyel 8 bazal ortam ve Esansiyel 8 takviyesi dahildir</td></tr><tr><td>Vitronektinin kesik rekombinant insan formu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitörü Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>Ayrışma reaktifi (TrypLE Select enzimi)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563029</td><td>1x, hayvansal kökenli içermeyen, rekombinant enzim</td></tr><tr><td>G418 Sülfat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10131035</td><td>Geneticin Seçici Antibiyotik</td></tr><tr><td>Puromisin dihidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>Puromisin Seçici Antibiyotik</td></tr><tr><td>DNA Polimeraz (Herculase II Fusion)</td><td>Agilent Technologies</td><td>600679</td><td>PCR kiti</td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 Transkripsiyon kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Transkripsiyon Temizleme Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>Doksisiklin hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM ortamı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>31985062 Azaltılmış Serum Ortamı</td></tr><tr><td>Lipofektamin RNAiMAX Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>13778150</tr><tr><td>DNeasy Kan & Doku Kiti</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td>Genomik DNA ekstraksiyon kiti</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 orta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>BLAR orta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Yayınlanmış bir formülasyonla ısmarlama (Rezania et al., 2014)</td></tr> <tr><td>L-glutamin takviyesi (GlutaMAX)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>LAMPIRE Biyolojik Laboratuvarları</td><td>7500855</td><td>Yağ asidi içermez</td></tr><tr><td>GDF8</td><td>PeproTech</td><td>120-00</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Kök</td><td>04-0004</td><td>GSK-3 inhibitörü</td></tr><tr><td>L-Askorbik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>C Vitamini</td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R & D Sistemleri</td><td>251-KG</td><td></td></tr><tr><td>SANT1</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1974</td><td>Kirpi inhibitörü</td></tr><tr><td>RA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td>Retinoik asit</td></tr><tr><td>LDN</td><td>Stemgent</td><td>04-0019</td><td>BMP inhibitörü</td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3533</td><td>Wnt antagonisti ve nbsp;</td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>TPB</td><td>EMD Millipore</td><td>565740-1MG</td><td>PKC aktivatörü</td></tr><tr><td>3,3 ', 5-Triiyodo-L-tironin (T3)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>ALK5i II</td><td>Enzo Yaşam Bilimleri</td><td>ALX-270-445</td><td>ALK5 inhibitörü II</td></tr><tr><td>ZnSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0251</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>GSiXX EMD</td><td>Millipore</td><td>565789</td><td>Gama sekretaz inhibitörü XX, NOTCH sinyal inhibitörü</td></tr><tr><td>N-Cys (N-asetil sistein)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>EMD Millipore 648471</td><td></td><td>E Vitamini analogu</td></tr><tr><td>R428</td><td>Selleck Kimyasalları</td><td>S2841</td><td>AXL reseptörü tirozin kinaz inhibitör</td></tr><tr><td>24 mm Corning</td><td>Yaşam Bilimleri</td><td>3414</td><td></td></tr><tr><td>Gen Pulser Xcell Elektroporasyon Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>0,4 cm Elektroporasyon Küvetleri</td><td>Bio-Rad</td><td>1652081</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-TALEN-L</td><td>Addgene</td><td>59025</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-TALEN-R</td><td>Addgene</td><td>59026</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-Neo-M2rtTA</td><td>Addgene</td><td>60843</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-Puro-iCas9</td><td>Addgene</td><td>58409</td><td></td></tr><tr><td>T7 Endonükleaz I</td><td>NEB</td><td>M0302L</td><td></td></tr><tr><td>Tampon 2</td><td>NEB</td><td>B7002S</td><td>NEBuffer 2</td></tr><tr><td>Uzun oligonükleotid</td><td>Eton Bioscience veya IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOX17 antikoru</td><td>R& D Sistemleri</td><td>AF1924</td><td>1:500</td></tr><tr><td>FOXA2 antikoru</td><td>Millipore</td><td>07-633</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CXCR4-APC antikoru</td><td>R& D Sistemleri</td><td>FAB170A</td><td>1:25</td></tr><tr><td>PDX1 antikoru</td><td>R& D Sistemleri</td><td>AF2419</td><td>1:500</td></tr><tr><td>NKX6.1 antikoru</td><td>DSHB</td><td>F55A12</td><td>1:500</td></tr><tr><td>NKX2.2 antikoru</td><td>DSHB</td><td>74.5A5</td><td>1:100</td></tr><tr><td>NEUROD1 antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-1084</td><td>1:100</td></tr><tr><td>İnsülin antikoru</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>1:2.000</td></tr><tr><td>C-peptit antikoru</td><td>DSHB</td><td>GN-ID4-c</td><td>1:2.000</td></tr><tr><td>Glukagon antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2654</td><td>1:1,000</td></tr></tbody></table>

İnsan pankreas geliştirme lineage belirleyicileri sorgulanması için genom düzenleme ve hpscs arasında yönetmen farklılaşma

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

kendini sürekli yenileyen veya insan pluripotent kök hücrelerin ayırt (hPSCs) &#39;de sorgulanması gen fonksiyonu insani gelişmeyi anlamak ve bir tabak hastalık mekanizmalarını diseksiyon yönelik değerli bir platform sunuyor. Bu potansiyel uygulama yararlanmak için yakın in vivo meslektaşları özetlemek hastalığa, ilgili hücre tiplerini üretmek için hastalıkla ilişkili genlerin hPSC mutantları, aynı zamanda, in vitro hPSC farklılaşma protokolleri oluşturmak için etkin bir genom düzenleme araçları gerektirir. ICRISPR isimli hPSCs için etkili bir genom düzenleme platformu AAVS1 lokusunda bir Cas9 sentezleme kasetinin TALEN aracılı hedefleme yoluyla geliştirilmiştir. Burada, kimyasal olarak tanımlanmış bir ortam ve bir besleme içermeyen durumda kültür hücreleri kullanılarak uyarılabilir Cas9 hPSC serilerinin jenere edilmesi için protokolleri açıklanmıştır. n yoluyla ya gen nakavt veya hPSCs hassas genetik değişiklikler için iCRISPR sistemini kullanmak için ayrıntılı prosedürler,on-homolog (NHEJ) katılmadan ucu veya bir homoloji yönettiği onarım (HDR) şablonu kullanarak kesin nükleotid değişiklikler yoluyla, sırasıyla dahildir. Bu teknik prosedürleri tasarım, üretim açıklamaları ve CRISPR kılavuz RNA&#39;lar (gRNAs) aktarıldığı arasında; T7E1 veya RFLP tahlilleri ile CRISPR mutasyon hızının ölçülmesi; kurulması ve klonal mutant hatların geçerlilik ve. Son olarak, in vivo pankreas embriyonik gelişme taklit ederek glikoz duyarlı pankreas β-benzeri hücrelere hPSC farklılaşma için biz kronik prosedürleri. yönlendirilmiş hPSC farklılaşma ile iCRISPR teknolojisini birleştiren pankreas gelişimi ve diyabet hastalığının mekanizmaları anlayışımızı ilerletmek için gen fonksiyonu sistematik incelenmesini sağlar.

<html> hPSC Kimyasal Tanımlı ve Besleyici serbest Kültür Adaptasyon ve Bakım IMEF besleyiciler kültüre hPSCs hızlı besleyici içermeyen kültür durumda VTN kaplı plakalara adapte edilebilir. Normal IMEF besleyici kültür aynı bölme oranları uyarlanması sırasında kullanılabilir. Şekil 1A KSR bazlı bir ortam ve besleyici içermeyen bir ortam içinde, bir VTN kaplı yüzeye IMEF besleyiciler üzerine hPSCs tipik morfolojileri gösterir. Şekil 1B tipik bir morfolojik değişime ve uyum (4 gün) ilk geçişi sırasında hPSC kolonilerinin büyümesini göstermektedir. Hücreler daha geçişli veya gelecekteki deneyler için donmuş olabilir. farklılaşma deneyler başlamadan önce adaptasyon kültürünün 3 pasajları - 2 yürütmek. Biz adaptasyon aşamasında karyotip anomalileri görülmez rağmen Karyotipleme da, adaptasyon sonra tavsiye edilir. &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; yoluyla iCas9 hPSC Hatlarının Üretimi Talen aracılı AAVS1 Hedefleme Daha önce gösterildiği gibi, hPSCs AAVS1 TALEN plasmidler ve Cas9 ve M2rtTA plazmid 5 bir çift elektroporatlanmıştır. Şekil 2A ve B tasarım ve iCas9 hPSC klonal hatları oluşturmak için tüm prosedürü hedefleme ayrıntılı donör vektörünü göstermektedir. (- Şekil 2C, 12 gün elektroporasyon sonra 10) antibiyotik seçimi sonrasında, yeterli büyüklükte ve tipik hPSC morfolojisi sergileyen tek hücre kökenli klon çekilecek hazırdı. Güney (Şekil 2D) 5 blot tarafından doğrulanmadı olarak genellikle ~ klonların% 50 doğru, rastgele entegrasyonlar olmadan hedeflenir. Rasgele entegrasyon doksisiklin tedavi yokluğunda Cas9 sızdıran ifade neden olabilir. Verimli Genetik MiCRISPR Platformu Kullanma hPSCs içinde odification kurulan iCas9 hPSCs yılında Cas9 doksisiklin tedavisi ile ifade edilir ve DSBs üretir transfekte gRNAs tarafından hedef mahaline yönlendirilmelidir. Onarım şablonunun yokluğunda, NHEJ aracılığıyla gerçekleştirilen DNA onarımı genellikle Gen bozma ya nakavt neden indeller oluşturur. Onarım şablon (örneğin, bir ssDNA donör) varlığında HDR bir vahşi tip hPSC arka bir hastaya özgü mutasyon oluşturma veya hastaya bir hastalık ile ilişkili genetik varyant düzeltilmesi kadar kesin genetik değişiklikler için kullanılabilecektir türetilmiş iPSCs (Şekil 3A). Bu iCRISPR sistemini kullanarak klonal mutant hatları oluşturmak için 1 ay ~ alır. iCas9 indüksiyon ve gRNA transfeksiyon sonrası T7EI ve / veya RFLP analizleri Cas9 kesme verimliliğini değerlendirmek için kullanılmıştır, ve transfekte hücreler, daha sonra ~ düşük yoğunluklu (10 cm&#39;lik kaplar içine tek hücreler olarak 500 tohumlanmıştır - 2, 000hücre / 10 cm çanak). 10-12 gün sonra, tek hücreden türetilmiş klon genişleme ve daha fazla karakterizasyon (yani, genotipleme ve Western lekeleme yolu) (Şekil 3B) 96 çukurlu bir levhanın gözleri içine yerleştirildi. ICRISPR-aracılı gen nakavt yüksek verimli olduğu için, herhangi bir seçim işlemi yer almaktadır ve genellikle 20-50% bialelik mutantlar kolay (Şekil 3C) 5 elde edilebilir. verimli ve hassas genetik değişiklikler için, gRNAs (genom dizisinin küçük ama belirli bir değişiklik için) belirli bir dizi değişiklik taşıyan bir ssDNA verici ile birlikte transfekte edilir. Çoğu zaman, tadil edilmiş allellerinde yeniden kesilmesini önlemek için, veya PAM sekansını (Şekil 3B) &#39;de yakın sessiz bir mutasyona dahil edilmesi önerilmektedir. Bu sistem ile, ~ iki allel ek değişiklikler olmadan istenen HDR aracılı genom modifikasyonu taşıyan klonların% 10 (Şekil 3E) elde edilir. Hızlı ve piCRISPR platformu kullanarak hPSC genomunun recise modifikasyonu bize hızlı ve verimli insan gelişimi ve hastalık eğitimi için model olarak hizmet hPSC çizgiler yapmak için izin verir. Glukoz duyarlı β-benzeri hücrelere karşı hPSCs etkin Farklılaşma hPSC pankreas farklılaşma son ilerlemeler yakından pankreas embriyo gelişimini özetlemek protokollerin geliştirilmesini sağladı. Ayrım hPSCs ilk önce PDX1 + erken pankreas progenitörlerin (PP1) ve PDX1 + NKX6.1 + sonra pankreatik progenitör hücreleri (PP2) içerisine kesin endoderm olarak ve son olarak, 20 glikoz-tepkimeli β-benzeri hücreler 16, 17, 19 ayrışmıştır , 23, 24. Bu protocOLS daha güvenilir bir PDX1 + NKX6.1 + pankreas progenitörlerin ve glukoz-duyarlı β-benzeri hücreler 9 oluşturmak için optimize edilmiştir. Şekil 4A farklılaşma her aşamasında kullanılan detaylı kimyasal takviyeleri gösterir. Genellikle, 2 gün, ilk Hücre Ekimi takip eden yaklaşık% 80 konflüansa HUES8 hPSCs (Şekil 4B) farklılaşmasını başlangıç için idealdir. birkaç farklı ekme yoğunluğunun test yüksek oranda, her özel hücre hattı için optimize durum keşfetmek için tavsiye edilir. Genellikle, en az% 75 FOXA2 + PP2 aşamasında DE aşaması ve% 40 PDX1 + NKX6.1 + hücreleri ve + hücreleri elde edilebilir SOX17 (Şekil 4C). S5 aşamasında hücre agrega etrafında bir aura gibi şekil mevcudiyeti NKX6.1 + CPEP + glikoz-tepkimeli β-benzeri hücreler (Şekil 4D daha fazla farklılaşması için önemli olan hücre iyi bir hayatta kalma, bir göstergesidir ). Bu protokol, insan pankreatik d araştırılması için de faydalıdıdr<html> Bir tabak evelopment ve hastalık. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55267/55267fig1.jpg" /> Şekil 1. hPSC Kimyasal Tanımlı ve Besleyici serbest Bakım ve IMEF Besleyiciler gelen Kültür Adaptasyon. (A) hPSCs Temsilcisi görüntüler, 4. günde VTN IMEF besleyici ya da split hazır kültüre. (B) bir IMEF besleyiciden besleyici içermeyen kültür içine uyum ilk geçişi sırasında hPSCs tipik morfolojisi. IMEF besleyiciler kültüre Gün 4 hPSCs ROCK inhibitörü ile kimyasal olarak tanımlanmış ortam içinde VTN kaplı plakalar üzerinde bölünmüş ve ekildi. bölme oranı IMEF besleme koşullarında kültürü için her zaman bölme oranı ile aynı olmuştur. orta ROCK inhibitörü olmadan her gün değiştirildi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55267/55267fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <html> 1 &quot;&gt;:&quot; keep-together.within sayfa = fo &quot;ve_content <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55267/55267fig2.jpg" /> ICas9 hPSC Hatları Şekil 2. Nesil. (A) iCas9 hPSC serilerinin jenere edilmesi için bir strateji hedefleme. Puro-Cas9 verici ve neo-M2rtTA donör AAVS1 TALENS bir çift insan AAVS1 lokusuna hedeflenmiştir. Elektroporasyon, antibiyotik seçimi, koloni toplama ve genişleme ve hücre hattı karakterizasyonu dahil olmak üzere tüm hedefleme işlemi, (B) Şemalar. Elektroporasyon sonra 12 gün - (C) Temsilci tek hücre klonu hazır yaklaşık 10 at çekilecek. (D) iki donör plazmid ek entegrasyon olmadan doğru hedeflenmiş klonları tanımlamak için Southern blot örnekleri. Doğru klonlar kırmızı olarak işaretlenmiştir. (A) ve (D) izni ile, Referans 5 uyarlandı.ig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55267/55267fig3.jpg" /> ICRISPR Sistemi Kullanarak hPSCs Şekil 3. Verimli Genetik Modifikasyon. Gen knockout mutant ya iCRISPR sistemi kullanılarak hassas gen modifikasyon üretimi için (A) Şemalar. (B) Hedefleme prosedürü ve klonal çizgi kurulması. HPSCs 9 NHEJ (C) içinden gen nakavt verim. Belirli bir nükleotid modifikasyonu taşıyan bir ssDNA&#39;nın (D) tasarımı. P, kırmızı: hastaya özgü mutasyon; Yeşil X: sessiz mutasyon. (E) HDR-aracılı kesin nükleotid değişiklik Verimlilik. GATA6 lokusunda (belirli bir nükleotid C&gt; T mutasyonu nedeniyle) kesin bir R456C mutasyon iCRISPR sistemi kullanılarak tanıtıldı.(Daha detaylı bilgi için 5 Referans bakınız). (C) ve (E) izinlerine sahip, sırasıyla Referans 9 ve Referans 5, uyarlandı. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55267/55267fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55267/55267fig4.jpg" /> Glikoz-duyarlı Pankreas β-benzeri hücreler içine Şekil 4. Yönetmen hPSC Farklılaşma. Farklılaşma her aşamasında takviye kimyasallarla detaylı farklılaşma protokolünün (A) Şemalar. farklılaşma sırasında ya aktive edilir sinyal yolları sırasıyla yeşil veya kırmızı vurgulanır. CHIR: GSK3 inhibitörü; GDF8: büyüme farklılaşması faktörü 8&#39;in veya miyostatin, bir TGF-beta protein ailesi üyesi; HH: Kirpi; DE: Kesin endoderm; PP1:PDX1 + erken pankreatik progenitör; PP2: PDX1 + NKX6.1 + sonra pankreas progenitör. (B) Tipik confluency - hPSCs 48 (70% 80) h hazır olduğunda farklılaşma başlatılması için tohumlama sonra. (C), kesin bir endoderm başarılı farklılaşmasını gösteren Örnek immünofloresan boyama ve görüntüler (DE) aşaması (FOXA2 ve SOX17 eş boyama), pankreatik progenitör aşaması (PP2: PDX1 ve NKX6.1 ko-boyama) ve glikoz-tepkimeli β- hücre aşama (NKX6.1 ve C-peptid ko-boyama) gibi. Genel olarak, β-benzeri hücre aşamasında% 10&#39;dan fazla NKX6.1 + CPEP + hücreler elde en az% 75 FOXA2 + SOX17 + DE hücreleri ve% 40 PDX1 + NKX6.1 + PP2 hücreleri karşılık gelen bir aşamada talep edilmektedir. (D), hava-sıvı arayüzü kültüründe bir uç filtre zarı S5 aşamasında, bir hücre agrega tipik morfolojisi. Hayatta kalan hücreler (karanlıkta) agreganın merkezine göç ve kenarında bir aura benzeri bir yapı bırakmıştır. (A </strong&gt;) ve (D) izinleri ile Referans 9 uyarlandı. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55267/55267fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> plazmid </td><td> Tutar </td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN-L </td><td> 5 ug </td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN-R </td><td> 5 ug </td></tr><tr><td> AAVS1-Puro-iCas9 </td><td> 40 ug </td></tr><tr><td> AAVS1-neo-M2rtTA </td><td> 40 ug </td></tr></tbody></table> tablo 1 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> astar boya </td><td> Sıra </td></tr><tr><td>T7F </td><td> TAATACGACTCACTATAGGG </td></tr><tr><td> TracrR </td><td> AAAAGCACCGACTCGGTGCC </td></tr></tbody></table> Tablo 2 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Tutar </td></tr><tr><td> GKD 2 O </td><td> 35.5 uL </td></tr><tr><td> 5x PCR reaksiyon tamponu </td><td> 10 uL </td></tr><tr><td> dNTP karışımı (25 mM) </td><td> 0.5 uL </td></tr><tr><td> T7F (10 uM) </td><td> 1.25 uL </td></tr><tr><td> TracrR (10 uM) </td><td> 1.25 uL </td></tr><tr><td> T7-gRNA IVT şablonu (250 nM) </td><td> 1 pL </td></tr><tr><td> DNA polimeraz </td><td> 0.5 uL </td></tr><tr><td> Toplam PCR reaksiyon karışımı </td><td> 50 uL </td></tr></tbody&gt; </table> Tablo 3 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4"> PCR çevrim koşulları </td></tr><tr><td> Çevrim numarası </td><td> doğasını değiştirmek </td><td> tavlamak </td><td> uzatmak </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 94 ºC, 2 dak </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2-31 </td><td> 94 ºC, 20 s </td><td> 60 ºC, 20 s </td><td> 72 ºC, 1 dak </td></tr><tr><td> 32 </td><td></td><td></td><td> 72 ºC, 2 dak </td></tr></tbody></table> Tablo 4 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td><strong&gt; Tutar </td></tr><tr><td> T7 ATP </td><td> 2 uL </td></tr><tr><td> T7 CTP </td><td> 2 uL </td></tr><tr><td> T7 GTP </td><td> 2 uL </td></tr><tr><td> T7 UTP </td><td> 2 uL </td></tr><tr><td> T7 10x tampon </td><td> 2 uL </td></tr><tr><td> T7 enzim karışımı </td><td> 2 uL </td></tr><tr><td> PCR ile çoğaltılan şablonu </td><td> 8 uL </td></tr><tr><td> Toplam in vitro gRNA transkripsiyon karışımı </td><td> 20 uL </td></tr><tr><td> gece boyunca 6 saat boyunca 37 ° C de kuluçkaya bırakılır </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 5 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Tutar (ul) </td></tr><tr><td> Saflaştırılmamış PCR Ürünü </td><td> 8 </td></tr&gt; <tr><td> Tampon 2 10x </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Damıtılmış su (dH 2 O) </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tablo 6 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> DNA denatürasyonu ve hibridizasyon döngü koşulları </td></tr><tr><td> Sıcaklık </td><td> süre </td><td> termosikler koşulları </td></tr><tr><td> 95 ° C </td><td> 10 dakika </td><td></td></tr><tr><td> 85 ° C </td><td> 1 dakika </td><td> 2 ° C / s 85 ° C Rampa </td></tr><tr><td> 75 ° C </td><td> 1 dakika </td><td> 0.3 ° C / s 75 ° C Rampa </td></tr><tr><td> 65 ° C </td><td> 1 dakika </td><td> 0.3 ° C / s 65 ° C Rampa </td></tr><tr><td> 55 ° C &lt;/ Td&gt; <td> 1 dakika </td><td> 0.3 ° C / s 55 ° C Rampa </td></tr><tr><td> 45 ° C </td><td> 1 dakika </td><td> 0.3 ° C / s 45 ° C Rampa </td></tr><tr><td> 35 ° C </td><td> 1 dakika </td><td> 0.3 ° C / s 35 ° C Rampa </td></tr><tr><td> 25 ° C </td><td> 1 dakika </td><td> 0.3 ° C / s 25 ° C Rampa </td></tr><tr><td> 4 ° C </td><td> Ambar </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 7 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> sahne </td><td> Gün </td><td> medya </td><td> ek </td><td></td></tr><tr><td rowspan="3"> S1 </td><td> d0 </td><td> S1 </td><td> GDF8 100 ng / ml </td><td> CHIR-99.021 3 uM </td></tr><tr><td> d1 </td><td> S1 </td><td> GDF8 100 ng / ml </td><td> CHIR-99.021 0.3 uM </td></tr><tr><td> d2 </td><td> S1 </td><td> GDF8 100 ng / ml </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> S1 ortamı: MCDB 131 + 1 x L-glutamin ilave +% 0.5 BSA + 1.5 g / l NaHCO 3, 10 mM Glukoz </td></tr></tbody></table> Tablo 8 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> sahne </td><td> Gün </td><td> medya </td><td colspan="8"> ek </td></tr><tr><td> S2 </td><td> d3-d4 </td><td> S1 </td><td> SAA 0.25 mM </td><td> FGF7 50 ng / ml </td><td> IWP-2 2.5 uM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td&gt; S3 </td><td> D5-d6 </td><td> S3 </td><td> SAA 0.25 mM </td><td> FGF7 50 ng / ml </td><td> SANT-1 0.25 uM </td><td> RA 1 uM </td><td> LDN 100 nM </td><td> TPB 200 nM </td><td> ITS-X 1: 200 </td><td></td></tr><tr><td> S4 </td><td> D7-D9 </td><td> S3 </td><td> SAA 0.25 mM </td><td> FGF7 2 ng / ml </td><td> SANT-1 0.25 uM </td><td> RA 0.1 uM </td><td> LDN 200 nM </td><td> TPB 100 nM </td><td> ITS-X 1: 200 </td><td> IWP-2 2.5 uM </td></tr><tr><td colspan="11"> S3 ortamı: MCDB 131 + 1 x L-glutamin ilave +% 2 BSA + 2.5 g / L NaHCO 3, 10 mM Glukoz </td></tr></tbody></table> Tablo 9 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> sahne </td><td> Gün </td><td> medya </td><td colspan="8"> ek </td></tr><tr><td> S5 </td><td> d10-d12 </td><td> S5 </td><td> T3 1 uM </td><td> ALK5i II 10 uM </td><td> SANT-1 0.25 uM </td><td> RA 0.05 uM </td><td> LDN 100 nM </td><td> ITS-X 1: 200 </td><td> ZnSO4 10 uM </td><td> Heparin 10 ug / ml </td></tr><tr><td> S6 </td><td> d13- d19 </td><td> S5 </td><td> T3 1 uM </td><td> ALK5i II 10 uM </td><td> GSiXX 100 nM </td><td></td><td> LDN 100 nM </td><td> ITS-X 1: 200 </td><td> ZnSO4 10 uM </td><td> Heparin 10 ug / ml </td></tr><tr><td> S7 </td><td> d20- D33 </td><td> S5 </td><td> T3 1 uM </td><td> ALK5i II 10 uM </td><td> N-Cys 1mM </td><td> Trolox 10 uM </td><td> R428 2 iM </td&gt; <td> ITS-X 1: 200 </td><td> ZnSO4 10 uM </td><td> Heparin 10 ug / ml </td></tr><tr><td colspan="11"> S5 ortamı: BlaR + 1x L-glutamin ilave +% 2 BSA + 1.5 g / l NaHCO 3 + 20 mM glikoz </td></tr></tbody></table> Tablo 10

Protokoller iCRISPR platformu kullanılarak hPSC mutan çizgileri oluşturmak için ve tarif edilen glukoz duyarlı β-benzeri hücrelere hPSCs ayırt etmek. hPSC yönettiği farklılaşma ile genom düzenleme teknolojisini birleştirerek insan gelişimi ve hastalık seyrinde soy belirleyicilerinin rolü sistematik analizi için güçlü bir platform sunmaktadır.

İnsan Pankreas Geliştirme Lineage Belirleyicileri sorgulanması için Genom Düzenleme ve hPSCs arasında Yönetmen Farklılaşma

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Bu protokol, hPSC'lerde hızlı genom düzenlemesi için iCRISPR platformunun nasıl kurulacağını ve insan pankreas gelişimi ile hastalıklarını incelemek amacıyla genomu düzenlenmiş hatların hPSC yönlendirmeli pankreas diferansiyasyonuna nasıl dahil edileceğini göstermektedir. Bu yöntemler, normal pankreas gelişiminin genetik kontrolü ve diyabetin moleküler temeli gibi insan pankreas gelişimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniklerin temel avantajı, hPSC'lerde ilgilenilen genleri verimli bir şekilde modifiye etmemize ve bu modifiye edilmiş hücre hatlarını in vitro insan pankreas gelişimi ve hastalık çalışmalarında kullanmamıza olanak sağlamalarıdır.hPSC'leri, kısaltılmış insan vitronektin kaplı kaplarda, kimyasal olarak tanımlanmış ve feeder-free (besleyici hücresiz) koşullarda kültüre edin. Elektroporasyondan bir gün önce, medya değişimi sırasında 10 micromolar ROCK inhibitörü ekleyin. Elektroporasyon gününde, vitronektin kaplı 10-centimeter kapları önceden hazırlayın.Ardından hücrelerdeki kültür ortamını uzaklaştırın, kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile bir kez yıkayın ve ardından hücreleri 37 °C'de yaklaşık üç dakika boyunca 1X disosiasyon reaktifi ile işleme tabi tutun. Daha sonra, hücreler ayrılmadan önce disosiasyon reaktifini aspire edin ve 10,5 mL tam ortam ekleyin. Santrifüj tüplerine aktarmadan önce tek hücre süspansiyonu oluşturmak için nazik pipetleme yapın.Otomatik bir hücre sayıcı kullanarak 500 µL hücre süspansiyonunda hücre sayımı gerçekleştirin. Ardından hPSC'leri 200 ×g'de beş dakika boyunca pelletleyin. Hücreleri soğuk PBS içerisinde 12,5 × 10⁶ cells/mL konsantrasyonda yeniden süspande edin ve 800 µL'lik hacimler halinde alikotlayın.Plazmidleri her bir 800 µL hPSC süspansiyonuna ekleyin ve iyice karıştırın. Karışımı 0,4 cm'lik bir elektroporasyon küvetine aktarın ve yaklaşık beş dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Hücreleri, bir elektroporasyon sistemi kullanarak 250 V ve 500 µF değerlerinde elektropore edin.Genom düzenleme için sağlıklı ve çoğalan hPSC'lerin kullanılması kritiktir. Elektroporasyondan sonra, hücreleri beş mililitre önceden ısıtılmış tam besiyeri içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve ardından hücreleri pelletleyin. Hücreleri 10 mikromolar ROCK inhibitörü içeren 10 mililitre tam besiyerinde resüspande edin ve her bir elektroporasyondan 1x10⁶, 2,5x10⁶ ve 5x10⁶ hücreyi vitronektin kaplı kaplara ekleyin; böylece kaplardan en az birinde seçme işlemi için yeterli tek hücre kolonisi olacaktır.Hücreleri 37 °C'de kültüre edin. İkinci günde, 500 µg/mL G418 sülfat içeren besiyeri ekleyerek neomisin seleksiyonuna başlayın. Altıncı günde, 1 µg/mL puromisin dihidroklorür içeren besiyeri ekleyerek puromisin seleksiyonuna başlayın.10 ila 12. günlerde, hPSC tek hücreli kolonları bir ila iki milimetre çapra ulaşacaktır. Bu noktada, bir stereo mikroskop altında 12 ila 24 koloni seçin. hPSC kolonlarını 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak mekanik olarak küçük parçalara ayırın ve hücreleri doğrudan vitronectin kaplı 24 kuyucuklu plakalara aktarın.rehber RNA transfeksiyonundan 24 saat önce, iCas9 hPSC'leri mililitre başına iki mikrogram doksisiklin ile işleme tabi tutun. Transfeksiyon gününde, vitronektin kaplı 24 kuyucuklu plakalar hazırlayın ve iCas9 hücrelerini daha önce olduğu gibi 1X disosiasyon reaktifi kullanarak tek hücrelere ayırın. Ardından, hücreleri beş dakika boyunca 200 ×g'de çöktürün ve hücreleri mililitre başına 0,5 × 10⁶ hücre olacak şekilde, iki mikrogram/mL doksisiklin ve 10 µM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş komple medyuma yeniden süspande edin.Resüspande edilen hücrelerin 500 mikrolitresini 24 kuyucuklu plakanın münferit kuyucuklarına ekleyin. Her bir kılavuz RNA için aşağıdaki transfeksiyon karışımlarını hazırlayın. Karışım A: 50 mikrolitre düşük serumlu besiyeri ve bir mikrolitre kılavuz RNA.Karışım B, 50 µL indirgenmiş serumlu besiyeri ile üç µL transfeksiyon reaktifeninin eklenmesidir. Karışım A ve B'yi birleştirerek 100 µL'lik bir karışım hazırlayın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. 24 kuyucuklu plakanın duble kuyucuklarındaki hücrelere 50 µL karışım ekleyin ve iyice karıştırın.Dört gün sonra, genomik DNA'yı ekstrakte edin, kılavuz RNA hedefleme dizilerini çevreleyen hedef bölgeleri PCR ile amplifiye edin ve T7E1 sindirimi kullanarak düzenleme verimliliğini tahmin edin. Hücreler, ekimden iki gün sonra %80 konfluense ulaştığında hPSC hatlarının diferansiyasyonuna başlayın. Diferansiyasyon sıfırıncı gün ortamını ekleyin ve ardından burada gösterilen formülleri kullanarak medyayı her gün değiştirin.10. günde, hücrelerin bir kısmına immunofloresan boyama yaparak geç evre pankreatik progenitör PP2 belirteçleri olan PDX1 ve NKX6.1'i inceleyin. Ardından, önce PP2 hücrelerini dört saat boyunca 10 µM ROCK inhibitörü ile işleyerek hava-sıvı arayüzü kültürüne geçin. İnkübasyon süresi dolduğunda, hücreleri daha önce yapıldığı gibi dissosiye edin.Hücrelerin farklılaşmanın hava-sıvı arayüzü aşamasında ekilmesi için sağkalımı maksimize etmek amacıyla, disosiasyon reaktifi uygulama süresini minimize edin. Hücreler henüz ayrılmadan önce disosiasyon reaktifini aspire edin. Ardından plağa 10 mililitre boo-lah medyumu ekleyin ve PP2 hücrelerini, pipetle nazikçe yukarı-aşağı hareketler yaparak tekil hücreler haline getirin.Tek hücreli süspansiyonu toplayın. Hücre sayısını belirleyin ve hücreleri pellete getirin. Hücre pelletini S5 diferansiyasyon ortamında yeniden süspanse ettikten sonra, bir transwell insert filtresindeki her noktaya beş ila 10 microliters hücre damlatın.Her bir transwell ekleminin altına S5 medyumu ekleyin ve pankreatik endokrin belirteçler immunofloresan boyama ile saptanabilir olana kadar medya değişimleri ile inkübe edin. Bu şekil, hPSC'lerde iCRISPR aracılı non-homolog uç eklemesini göstermektedir. Herhangi bir seçilim süreci gerekmediği için gen nakavtı oldukça verimlidir ve %20 ila %50 oranında biallelik mutantlar kolayca elde edilebilir.Verimli ve hassas genetik değişiklikler için, rehber RNA'lar, kırmızı ile gösterilen spesifik sekans değişikliğini taşıyan tek zincirli bir DNA donörü ile birlikte kotransfekte edilir. Genellikle, modifiye edilmiş alellerde yeniden kesilmeyi önlemek için, burada yeşil ile gösterilen PAM sekansına sessiz bir mutasyon eklenmesi önerilir. Bu sistemle, her iki alelde ek bir değişiklik olmaksızın, istenen homoloji yönlendirmeli onarım aracılı genom modifikasyonunu taşıyan klonların yaklaşık %10'una ulaşılabilir.Yöntem USTalaşıldıktan sonra, yeni bir iCas9 hPSC hattı oluşturmak iki aydan kısa sürer. Bunun ardından, bir ila iki ay içerisinde çeşitli hPSC mutant koloni hatları üretilebilir. hPSC genetik mutant hatlarının üretilmesini takiben, mutant hücre hatlarının in vitro basamaklı olarak pankreatik beta benzeri hücrelere farklılaştırılması, bu mutasyonlardan etkilenen spesifik gelişimsel basamakları incelememize olanak tanır ve bu da temel hastalık mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.

genome-editing-directed-differentiation-hpscs-for-interrogating

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Çalışmada insan embriyonik kök hücreleri pankreas farklılaşma uyarması yönlendirilmiş bir farklılaşma yaklaşım anlatılmaktadır. Büyük önem insülin salgılayan hücrelerin içine pankreas ataları edilen insan embriyonik kök hücre bulma olduğu endotel hücre ko-kültür aracılık olgunlasmasi.

İnsan Embriyonik endotel hücre Co-kültür aracılık Olgunlaşma Bir Yönetmen Farklılaşma Yaklaşım Pankreas insülin üreten hücreler için Kök Hücre

İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) genom düzenlemesi hızlı ve verimli bir şekilde yapılabilir. Burada, EGFP'yi eksprese etmek ve antibiyotik direncini ortaya çıkarmak için AAVS1 güvenli liman lokusunun düzenlenmesiyle örneklendiği gibi, hPSC'leri genetik olarak tasarlamak için sağlam bir deneysel prosedür sunulmaktadır.

Genom düzenlenmiş İnsan Pluripotent Kök Hücre Hatları oluşturulması: İzolasyon hedefleyen Gönderen

Burada, insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültür hPSCs CD34 ayırt etmek için kullanılan iletişim kuralları, mevcut+ hematopoetik ataları. Bu yöntem kurallı WNT ya kesin veya ilkel hematopoetik program sadece hücrelere belirtmek sinyal manipülasyon sahne özgü kullanır.

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

Burada in vitro NKX6-1 + pankreas atalarıdır insan embriyonik kök hücreleri ayırt etmek için 4 aşamalı bir protokol açıklar. Bu protokol, insan pluripotent kök hücre hatları çeşitli uygulanabilir.

Pluripotent Verimli Farklılaşma NKX6-1 için Kök Hücreler<sup&gt; +</sup&gt; Pankreas Progenitörler

Bu iletişim kuralı koşullarda besleyici içermeyen insan pankreas hücreleri ayak izi-Alerjik İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) nesil ayrıntılı olarak anlatılmaktadır kullanarak CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins ve değiştirilmiş karakterizasyonu düzenleyerek takip tek hücre klonlar.

Verimli üretimi ve besleyici-Alerjik IPSCs CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak insan pankreas hücreleri düzenleme

Burada, serbest dalgalı e10.5 ayrışmış pankreas ataları ve ilişkili Mezenşim 3D fare pancreatoids ifade insülin üretmek için bir iletişim kuralı mevcut.

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

Burada, pankreas/oniki parmak bağırsağı homeobox protein 1+ insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) ayırt etmek için ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut (PDX1+) hücreleri pankreas soy nesil için alan koloni sigara türü monolayer büyüme üzerinde tek hücre ayrışmış. Bu yöntem homojen hPSC elde edilen hücreleri, genetik manipülasyon üreten ve eleme için uygundur.

Verimli üretimi, pankreas/oniki parmak bağırsağı Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/pankreas ataları hPSCs yapışma kültürlerde üzerinden

Mevcut protokol, düzlemsel tek katmanlı insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) türetilen pankreas progenitörlerinde PDX1 ve NKX6.1 transkripsiyon faktörlerinin birlikte ekspresyonunu arttırmak için geliştirilmiş bir yöntemi açıklamaktadır. Bu, taze matrisin yenilenmesi, hücre yoğunluğunun manipüle edilmesi ve endodermal hücrelerin ayrışmasıyla elde edilir.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin 2D Kültür Sisteminde Pankreatik Beta Hücre Öncüllerine Farklılaşması

Kök hücrelerin adacık hücrelerine farklılaşması, geleneksel diyabet tedavisine ve hastalık modellemesine alternatif bir çözüm sunar. Bir tabakta insülin salgılayan, kök hücreden türetilen adacıkların üretilmesine yardımcı olmak için ticari bir farklılaşma kitini önceden onaylanmış bir yöntemle birleştiren ayrıntılı bir kök hücre kültürü protokolünü açıklıyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin İnsülin Üreten Adacık Kümelerine Farklılaşması

Bu makale, β hücreli benzeri hücrelerin yönlendirilmiş farklılaşması ve fonksiyonel analizi için bir protokol sunmaktadır. İnsülin üreten pankreas hücreleri oluşturmadan önce insan pluripotent kök hücreleri için optimal kültür koşullarını ve pasajlarını tanımladık. Altı aşamalı farklılaşma, kesin endoderm oluşumundan, glikoza yanıt olarak insülin salgılayan fonksiyonel β hücreli hücrelere doğru ilerler.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Fonksiyonel Pankreas İnsülin Salgılayan Hücreler Üretmek için Optimize Edilmiş Protokol

İnsan kök hücresinden türetilen pankreas kök hücresi adacıklarının immunodefisive farelere in vivo implantasyon ve sonraki analizler için kas içi nakli için minimal invaziv bir protokol sunuyoruz.

Farelerde İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilen Pankreas Endokrin Hücrelerinin Intramusküler Nakli

Keşfedin iCRISPR platformu ile hPSClerde genom düzenleme ve pankreas beta benzeri hücrelere yönlendirilmiş farklılaşma yöntemlerini. Bu teknikler insani pankreas gelişimi ve diyabet hastalık mekanizmalarının incelenmesine olanak tanır.

İnsan Pankreas Geliştirme Lineage Belirleyicileri sorgulanması için Genom Düzenleme ve hPSCs arasında Yönetmen Farklılaşma

Daha fazla video keşfet