Name: Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Öğrenin, insan pluripotent kök hücrelerini trofoblastik hücrelere farklılaştırma yöntemini. BMP4 ve sinyal yolu inhibitörleri kullanılarak plasenta oluşumunun erken olayları incelenir. Bu teknik genetik manipülasyon için yeterli hücre sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Pennsylvania Sağlık Araştırma Formülü Fonu tarafından desteklenmiştir.

NOT: trofoblast atalarıdır içine ya hESC veya hiPSCs farklılaşma için, fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) üzerinde yetiştirilen hPSCs BMP4 / A / P ile farklılaşmayı başlamadan önce iki pasaj koşullarını serbest besleyici geçişi yapılır. Bu işlem, farklılaşmış hücre MEF kontaminasyonu ortadan kaldırır. Burada, HESC farklılaşması için bir protokol mevcut ve aynı protokol hiPSCs uygulanabilir. 1. Kültür ve Işınlanmış Fare Embriyonik Fibroblastlar üzerinde hESC Kurtarma (MEFS) (preparatlar) <ol><li> MEF&#39;ler gama-radyasyon <ol><li> % 10 FBS, 2 mM L-glutamin, 1 x penisilin / streptomisin (pen / strep) ile DMEM, ve 0.1 mM esas olmayan amino asitleri (NEAA) MEFS kültürlenmesi için ortam 500 ml olun. </li><li> Birincil MEFS bir şişe çözülme ve hücrelerin kültürlenmesi için MEF orta kullanın. MEF kültür ortamı kullanılarak 30 plakalara birincil MEFS genişletin. NOT: oksijen konsantrasyonları bu aşama için kritik öneme sahip değildir, bu yüzdenHer iki kuvöz içinde (% 4), fizyolojik ya da ortam (% 20) koşullar kullanılabilir. </li><li> MEFS hasat. plakalardan MEFS çıkarmak ve konik tüp hücrelerin aktarımı için% 0.25 tripsin kullanın. Bir ışınlama aracı haline MEFS yerleştirin ve 3.500 griler hücreleri maruz bırakmaktadır. NOT: süre ışınlayıcı ünitesi içindeki kaynağın etkinliği bağlıdır. </li><li> MEF kültür ortamı ile ışınlanmış MEFS tekrar süspansiyon ve hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısını. </li><li> Bir santrifüj kullanılarak MEFS Pelet,% 50 MEF kültür ortamı ve ortam (% 80 FBS ve% 20 MEF kültür ortamı) dondurma% 50 hücre ilave edin. Kısım şişe başına 1 x 10 6 hücre. </li><li> bir gecede -80 ° C derin dondurucuda ışınlanmış MEF şişeleri yerleştirin ve sonra uzun süreli depolama için sıvı nitrojen aktarabilirsiniz. </li></ol></li><li> Kültür için dondurulmuş MEFS ve hESC çözülme <ol><li> HESC ortamının 500 ml yapmak: DMEM / F-12,% 20 serum Replacası, 0.1 mM NEAA, 2 mM L-glutamin, 10 ng / ml bFGF, 0.1 mM beta-merkaptoetanol ve 1 x Pen / Strep. </li><li> hESC çözülme önce MEFS bir gün bir şişe çözülme. Kat her bir 1 ml kullanılarak,% 0.1 jelatin ile bir 6 yuvalı plaka. Oda sıcaklığında, en az 20 dakika süreyle inkübe edilir ve daha sonra jelatin çıkarın. </li><li> Sıvı azot içinde depolama MEF&#39;ler bir şişe çıkarın ve 37 ° C su banyosu içinde şişeyi bırakın. sadece küçük buz kristalleri kalır aralıklı kadar flakon izleyin. Hızla 15 ml konik tüp içinde MEF ortamın 9 ml flakon içeriğini aktarmak. </li><li> 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüj hücreleri Pelet. Süpernatantı aspire ve MEF ortamında hücre pelletini. 6 yuvalı bir plaka uzerinde eşit MEFS kısım. gece boyunca 37 ° C düşük oksijen (% 4) inkübatör içine plaka koyun. </li></ol></li><li> MEFS üzerinde hESC rutin kültür <ol><li> sıvı azot bir HESC şişe çıkarın ve hızlı bir şekilde 3 ile flakon çözülme7 ° C su banyosu. Yavaşça HESC ortamın 9 ml içeren 15 ml konik bir tüp içine hESC pipet ve 5 dakika 200 x g&#39;de aşağı doğru döndürün. Ortamı çıkarın ve HESC ortamı, 1 ml ile tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Aşama 1.2.4 hazırlanan levhadan MEF orta aspire ve HESC ortamının 1 ml. HESC ortamına Kaya önleyicisi Y-27632 (10 uM) ekleyin. MEFS üzerine hESC aktarın. </li><li> gece boyunca 37 ° C düşük oksijenli (% 4) inkübatör içine hücreleri yerleştirin. Günlük HESC orta yerine. 4X de dik bir mikroskop altında görüntülendi Pasteur pipeti ile farklılaşmış hücreleri kazımak. </li><li> Geçiş HESC her 4-6 günde hücre konfluent ve HESC kolonilerinin boyutuna bağlı olarak değişebilir. Pasajlanması gün önce MEFS bir tabak hazırlayın. Hücreler geçit hazır olduğunuzda, HESC orta kaldırmak ve 1 ml PBS ile iyice yıkayın. </li><li> 1 mg / ml kollajenaz ekleme (37 ° C önceden ısıtılmış), 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin ve kolajenaz çıkarın. W, Hücrelerin PBS ile kül oyuk başına HESC ortamın 1 ml ekleyin ve elle 5 ml pipet ucu kullanarak, küçük topaklar içine hücreleri kazıyın. Yeni MEF kaplı iyi (ler) içine askıya hücre kümeleri aktarın. </li></ol></li></ol> MEF&#39;lerden HESC 2. Geçiş besleyici-hücre dışı matris ile kaplanmış plakalar üzerinde Koşulları <ol><li> Hazırlayın MEF Orta (CM) Buzdolabı <ol><li> % 90-100 confluency T75 şişesi içinde ışınlanmış MEFS Plaka; MEF&#39;ler yoğun kaplanır önemlidir. onlar şişenin dibine bağlı olup olmadığını belirlemek için bir mikroskop kullanılarak hücrelerin uyun (MEFS kaplama veya ertesi gün sonra yaklaşık 6 saat ekleyiniz). NOT: Bir mikroskop kullanılarak gözlenen Bekâr hücreler ortamda yüzer. Ertesi gün, MEF orta kaldırmak ve B-FGF eksik hESC orta 25 ml ekleyin. </li><li> inkübasyondan 24 saat sonra koşullu ortam toplanır. 12 günlük bir süre boyunca her gün taze ortam ile değiştirin. </li&gt; <li> 0.22 um bir filtre ile toplanmıştır cm filtre. Önce kullanmak CM taze B-FGF ekleyin. Not: CM, -80 ° C&#39;de dondurulmuş ve 1 yıla kadar depolanabilir. Seçenek olarak ise, 2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de CM saklayın. </li></ol></li><li> Geçiş MEFS üzerinde kültür hESC besleyici serbest hücre dışı matriks kaplı plakalar. <ol><li> Kaplama doku kültürü plakaları için hücre dışı matrisin hazırlanması <ol><li> Buz üzerinde hücre dışı matrisin bir kısım (yaklaşık 3-4 saat) çözülme. buz soğukluğunda ipuçları, tek bir soğuk 50 ml konik tüp, ve DMEM / F12 ortamı transfer buz soğukluğunda DMEM 24 ml hücre dışı matrisin 2 mg kullanarak / F-12 (dilüsyon Sunucunun hücre dışı matris konsantrasyonuna bağlıdır ). </li><li> Hemen buz 50 ml konik tüp transferi ve 4 ° C&#39;de saklayın. Kaplama doku kültürü plakaları için, oyuk seyreltilmiş hücre dışı matrisin uygun miktarda (örneğin, 6-oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına 1 mi). plakayı kaplamak için girdap ve en az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li></ol></li><li> B-FGF (10 ng / ml) ihtiva eden CM kullanılarak MEF&#39;lerden (adım 1.3 gibi) Geçiş HESC. <ol><li> Aspire yeni plakadan ekstraselüler matriks kaldırmak ve B-FGF içeren CM ekleyin. Bir pipet kullanarak MEF plaka kazınmış hücresel kümeleri aktarın ve hücre dışı matriks kaplı plaka içine bölmeyin. gece boyunca 37 ° C&#39;de, düşük oksijen inkübatörde inkübe edin. </li><li> günlük B-FGF orta CM değiştirin; ortamın miktarı, kültür şişesi boyutuna bağlı olacaktır. bir 6-iyi de için orta 2 ml kullanın. Pasteur pipeti ile farklılaşmış hücreleri kazımak. </li><li> Geçiş hESC mikroskop altında bakıldığında koloniler parlak her 6-7 gün. Not: hücre dışı matris ile kaplanmış plakalar üzerinde büyütülmüş HESC koloniler, MEF-kültürlenmiş hücrelerden daha büyük bir büyür. </li><li> besleyici içermeyen hücreler geçiş hazır olduğunuzda, reklama göre yıkayın, orta kaldırmakPBS kaldırmak için bir pipet, aspirat kullanılarak PBS Ding 1 mi, ilave 0.5 mg / ml dispaz bir pipetle (37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış) ve 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> oyuk başına 2 ml PBS ilave edilmesi ve daha sonra aspire hücrelerin PBS ile yıkayın. kuyu başına CM 1 ml ekleyin ve elle 5 ml pipet ucu kullanarak küçük öbekler içine hücreleri kazıyın. </li><li> Yeni hücre dışı matris kaplı tabak içine askıya hücre kümeleri Plate; Hücreler 24 saat sonra uymalıdır. </li></ol></li></ol></li></ol> BMP4 / A / P Kullanma hESC 3. Farklılaşma <ol><li> farklılaşma ortamı hazırlayın. Kullanım CM (B-FGF eksik) ekleyin (taze) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 uM) ve PD173074 (0.1 uM). kullanımdan önce CM bu inhibitörleri ekleyin. </li><li> % 4 oksijen ayarlanmış bir inkübatör içinde kültürlendi 1 geçişi için hücre dışı matris ile kaplanmış plakalar üzerinde büyüyen besleyici içermeyen hESC kullanın. hücre dışı matris ile kaplanmış plakalar üzerine ilk geçişten sonra,Hücreler 24 saat takmak edelim. Sonraki gün, farklılaşma başlatır. (B-FGF ihtiva) cm çıkarın ve BMP4 / A / P (6 çukurlu bir levha içinde çukur başına 2 mi) ihtiva eden CM ile değiştirin. % 4 oksijen seviyelerini kullanarak hücrelerin kültürlenmesi devam edin. </li><li> BMP4 / A / P ihtiva eden cm (2 ml / oyuk bir 6-yuvalı plaka) 2 günde değiştirin. Aspire eski orta kaldırmak ve bir pipet kullanarak yeni CM ekleyin. B-FGF (kabul farklılaşma gün 2) BMP4 ekleme ve kaldırdıktan sonra ikinci gününde, hücre morfolojisi, bir mikroskop kullanılarak gözlenen büyük görünen değişecektir. NOT: Parlak yuvarlak kenarları sergileyen farklılaşmamış hücreler, mevcut olmayacaktır. </li><li> İstenen zaman noktalarında hücreler toplanır. Farklılaştırılmış hücreler yaklaşık 2 hafta sonra bölünmesi durur. Bu süre içinde Transfect hücreleri (bir sonraki bölüme bakınız). </li></ol> siRNA&#39;lar veya plazmid DNA ile trofoblastik hücrelerin 4. transfeksiyonu <ol><li> Transfeksiyon için, trofoblastik hücrelerin hazırlanması </strong&gt; <ol><li> MEFS bunları aktardıktan sonra ekstrasellüler matriks iki pasaj Kültür hESC (adım 2.2). B-FGF içeren HESC ortamı kullanın. </li><li> farklılaşma önce yeni bir hücre dışı matriks plakası bir gün üzerine hESC bölün. Ertesi gün en az% 50 confluency sağlayacak olan, iyi / yeni bir plaka üzerine 1: Yüksek hücresel confluency önemlidir, bu nedenle hücreler 1 ayrıldı. düşük oksijenli gece boyunca inkübatör içinde inkübe hücreleri. Not: HESC Bu adım sırasında sayılmasına gerek yoktur. </li><li> Sonraki gün, farklılaştırma ortamının orta yerine (CM 6 plaka ml / oyuk BMP4 / A / P ihtiva eden B-FGF eksik 2 kullanılarak). Aspirasyon ile eski orta alın ve bir pipet kullanılarak, yeni, orta (2 mi) aktarın. gece boyunca, düşük oksijen inkübatör (% 4 oksijen) hücreleri yerleştirin. </li></ol></li><li> Transfections gen bozulması için siRNA&#39;lar kullanarak veya plazmid DNA kullanılarak <ol><li> İstenilen zaman-kadar hücreleri ayırt(Gün 1 ve 14 arasında) işaret etmektedir. Transfeksiyondan bir önceki gün, 5 dakika için% 0.05 tripsin kullanılarak Hücreleri tripsinize edin. Bir jelatin kaplı plaka üzerine istenen confluency (transfeksiyon reaktif protokolüne bağlı olarak) bunları Plakalı (kaldırmak için 20 dakika ve aspirat için bir doku kültürü plakası% 0.1 jelatin ekleyin). (B-FGF eksik) BMP4 / A / P içeren CM ekleyin ve gece inkübe edin. </li><li> Sonraki gün, hücrelere taze farklılaşma orta ekleyin. Bir siRNA transfeksiyon ayıracı kullanılarak transfeksiyonu siRNA&#39;lar. Plazmid DNA, bir uygun lipofektamin reaktif kullanın. </li><li> Her transfeksiyon reaktifi için tarif edildiği gibi ürün, protokol takip edin. düşük oksijen inkübatör içinde gece boyunca hücrelerin, hücrelerin her bir / plaka siRNA lipofektamin kompleksleri transfer yavaşça karıştırın ve kültür. NOT: Bazı transfeksiyon ayıraçları CM Kalem / Strep eksik gerektiren antibiyotikler tarafından inhibe edilir. </li><li> Ertesi gün, taze farklılaşma medya ile değiştirin. </li><li> arzu hücreleri Hasatd zaman noktaları (örneğin, 24 saat, 48 saat ve 72 saat) kantitatif RT-PCR kullanılarak gen bozulması verimliliğini kontrol etmek. hasat hücreleri için, oyuk başına 1 ml ilave edilmesi ve 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca inkübe,% 0.05 tripsin kullanın. Tripsin nötralize etmek için, göz başına MEF ortamın 5 ml ekleyin. 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de hücreleri Spin ve RNA izolasyonu için hücre pelletini kullanın. </li></ol></li></ol> Trofoblastik Hücreleri 5. Patojen Enfeksiyon: Sendai Viral Enfeksiyon <ol><li> Farklılaşması için hESC hazırlanması <ol><li> MEF&#39;lerden transferinden sonra ekstrasellüler matriks iki pasaj Kültür hESC (adım 2.2). B-FGF içeren HESC ortamı kullanın. </li><li> farklılaşma önce yeni bir hücre dışı matriks plakası bir gün üzerine hESC bölün. Ertesi gün, en az% 50 konfluent sağlayacak yeni bir plaka / çukur üzerine 1: Yüksek hücre birbirine karışmaya önemli için ayrı hücreler 1 olduğu. düşük oksijen inkübatör (% 4 oksijen) &#39;de bir gece boyunca inkübe hücreleri. &lt;Br /&gt; Not: HESC Bu adım sırasında sayılmasına gerek yoktur. </li><li> Sonraki gün, düşük oksijenli bir inkübatör (% 4 oksijen) farklılaşma madde (ihtiva BMP4 / A / P ve eksik B-FGF) ve gece boyunca kültür ortamı değiştirin. </li></ol></li><li> Trofoblastik hücrelerin Sendai viral enfeksiyon <ol><li> Bir gün istenen farklılaşma bir gün önce, 5 dakika boyunca% 0.05 tripsin kullanılarak (tek hücre) ayırt Hücreleri tripsinize edin ve jelatin kaplı plaka aktarın. farklılaşma ortamı ilave edin ve düşük oksijenli inkübatör içinde bir gece boyunca inkübe edilir. </li><li> Sonraki gün, (bu virüs ile ilgili olarak değişir), enfeksiyon için orta ekleyin. 6 oyuklu plakanın bir kuyu için 0.5 ml kullanılarak BMP4 / A / P ihtiva eden Pen / Strep eksik kullanımı CM. MOI, düşük oksijen inkübatör 8 saat 1. inkübe for = Sendai virüsü ekleyin. </li><li> ek zaman noktaları gerekli ise, 4 saat sonra virüs içeren orta kaldırmak ve BMP4 / A / P CM ile değiştirin. hücreleri toplayınRNA izolasyonu için bir hücre kazıyıcı kullanarak. </li><li> Viral cevap 18 yer alan genlerin QRT-PCR gerçekleştirilerek viral enfeksiyonun etkinliğini belirler. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Rugg-Gunn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+features+of+the+mouse+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+biomedicine+online%22%5BJournal%5D)">Epigenetic features of the mouse trophoblast.</a> Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).</li>
<li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+development%3A+lessons+from+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Placental development: lessons from mouse mutants.</a> Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).</li>
<li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty-four+fertilized+human+ova%2C+good%2C+bad+and+indifferent%2C+recovered+from+210+women+of+known+fertility%3B+a+study+of+biologic+wastage+in+early+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy.</a> Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).</li>
<li>Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v229/n5280/abs/229132a0.html">Human blastocysts grown in culture.</a> Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).</li>
<li>Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placenta+as+a+barrier+to+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The placenta as a barrier to viral infections.</a> Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).</li>
<li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+trophoblast+cell+differentiation%3A+physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+aspects+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li>
<li>Bilban, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+trophoblast+invasion-related+genes%3A+heme+oxygenase-1+controls+motility+via+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma.</a> Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).</li>
<li>Xu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP4+initiates+human+embryonic+stem+cell+differentiation+to+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast.</a> Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).</li>
<li>Amita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+and+unidirectional+conversion+of+human+embryonic+stem+cells+to+trophoblast+by+BMP4%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).</li>
<li>Genbacev, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+trophoblast+progenitor+cell+lines+from+the+chorion%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion.</a> Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).</li>
<li>Marchand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+signature+of+trophoblast+differentiation+in+a+human+embryonic+stem+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+reproduction%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model.</a> Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).</li>
<li>Hyslop, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+NANOG+induces+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+extraembryonic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages.</a> Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).</li>
<li>Harun, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotrophoblast+stem+cell+lines+derived+from+human+embryonic+stem+cells+and+their+capacity+to+mimic+invasive+implantation+events%5BTitle%5D)+AND+%22Human+reproduction%22%5BJournal%5D)">Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events.</a> Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).</li>
<li>Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP10+as+a+potent+inducer+of+trophoblast+differentiation+in+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).</li>
<li>Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast+lineage+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Biochemical and biophysical research communications. , (2013).</li>
<li>Roberts, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+trophoblast+cells+from+human+embryonic+stem+cells%3A+to+be+or+not+to+be%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be?</a> Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).</li>
<li>Sarkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin%2Fnodal+signaling+switches+the+terminal+fate+of+human+embryonic+stem+cell-derived+trophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).</li>
<li>Penkala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRHOXF1%2C+a+Long+Noncoding+RNA+from+the+X+Chromosome+That+Suppresses+Viral+Response+Genes+during+Development+of+the+Early+Human+Placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta.</a> Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).</li>
<li>Penkala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRHOXF1%2C+a+Long+Noncoding+RNA+from+the+X+Chromosome+That+Suppresses+Viral+Response+Genes+during+Development+of+the+Early+Human+Placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta.</a> Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
<li>Bernardo, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRACHYURY+and+CDX2+mediate+BMP-induced+differentiation+of+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells+into+embryonic+and+extraembryonic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages.</a> Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+BMP-4+treatment+initiates+mesoderm+induction+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells.</a> Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).</li>
<li>Vallier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cell+fate+decisions+of+human+embryonic+stem+cells+and+mouse+epiblast+stem+cells+are+controlled+by+the+same+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways.</a> PloS one. 4 (6), e6082(2009).</li>
<li>Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+fibroblast+growth+factor+%28FGF%29+receptor+2+suggests+a+role+for+FGF+signaling+in+pregastrulation+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).</li>
<li>Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF2+sustains+NANOG+and+switches+the+outcome+of+BMP4-induced+human+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation.</a> Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).</li>
<li>Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+inhibition+directs+BMP4-mediated+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+syncytiotrophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+and+development%22%5BJournal%5D)">FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast.</a> Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).</li>
<li>Bischof, P., Irminger-Finger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+cytotrophoblastic+cell%2C+a+mononuclear+chameleon%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).</li>
<li>Cole, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycosylated+hCG%2C+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Hyperglycosylated hCG, a review.</a> Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).</li>
<li>Apps, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+leucocyte+antigen+%28HLA%29+expression+of+primary+trophoblast+cells+and+placental+cell+lines%2C+determined+using+single+antigen+beads+to+characterize+allotype+specificities+of+anti-HLA+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies.</a> Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Biz trofoblast atalarıdır içine hESC ayırt etmek için temel adımları sundu. Bu protokol, en son trofoblastik hücrelerin farklılaşmasını arttırmak ve tipik haliyle, tek başına BMP4 tedavisi ile gözlenir mezoderm progenitörlerle üretilmesini önlemek hızla Aktivin / Düğüm sinyal inhibitörleri ilavesiyle hESC ayırt etmek için optimize edilmiştir. BMP4 model sistem insan trofoblast soy şartname ve genişleme erken aşamalarında incelenmesi için izin verir. Buna ek olarak, bu BMP4 modeli sistemi, koryokarsinom hücre hatları ve ...

Plasenta gebelik sırasında fetusun büyüme ve hayatta kalmak için gerekli ve maternal ve fetal dolaşıma arasında gaz, besin, atık ürünleri ve hormonların alışverişini kolaylaştırır. Memeli Embriyogenez sırasında oluşan ilk organ 6-7 days insanlarda post-anlayışı ve fareler 1, 2, 3, 4 3,5-4,5 gün geliştirmeye başladı plasenta vardır. Trofoblastik hücreler plasenta en önemli hücrelerdir ve bu hücreler memeli embriyosunun ilk soy farklılaşma olaylardan biri temsil etmektedir. Onlar preimplantasyon blastosist dış ekstra embriyonik trofoektoderm hücrelerden kaynaklanır. plasenta gelişiminin erken aşamalarında bilgimiz erken insani gelişme modelleme etik ve lojistik kısıtlamalar ile sınırlıdır. embriyonik implantasyon, trofoblastlar sırasındaanne epitel istila ve özel progenitör hücrelerin 5 farklılaşırlar. Sitotrofoblastlar (CTBS) sigorta ve sinsityotrofoblastlarda (SYNs) ve extravillous invaziv trofoblastlar (EVTs) içine ayırt, farklılaşmamış atalarıdır, tek çekirdekli hangi çapa rahim plasenta. SYNs, gebeliği sürdürme için gerekli hormonları sentezlemek terminal açıdan farklılaşmış hücreleri çok çekirdekli edilir. Trofoblastik hücrelerde bozukluklar düşük, pre-eklampsi ve intrauterin gelişme geriliği, 1 sonuçlanır olarak EVTs ve SYN isteklerini oluşturmak erken farklılaşma olayları, plasental oluşumu için gereklidir. Geliştirilen insan trofoblast hücre hatları tipleri CTBS ve plasental hormonlar ve ekran invaziv özellikleri 6 üretmek koryokarsi-, ölümsüzleşti içerir. İnsan ilk trimester plasenta primer trofoblastik hücreler izole ama hücreler hızla dif olabilirfarklılaştıran ve in vitro çoğalan dur. Önemlisi, dönüştürülmüş ve birincil hücre hatları tümörijenik ve ölümsüzleştirdi trofoblast hücre hatları doğru birincil trofoblast 7 temsil edemez belirten farklı gen ekspresyon profillerini var. Ayrıca, bu çizgiler üçüncü trimesterde üzerinden ilk sonra aşamalı türetilen çünkü plasental trofoblast kök hücre atalarıdır benzemeye olası değildir. Plasenta oluşumu ve işlevi erken olayları incelemek için başlangıç aşamasında, insan trofoblast in vitro kültür sistemi içinde sağlam bir ihtiyaç vardır. preimplantasyon embriyo iç hücre kütlesi ile özelliklerini paylaşan İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC), sıklıkla erken plasenta oluşumu da dahil olmak üzere, erken insan gelişimi modellemek için kullanılır. Hem insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) ve HESC Kemik Mor kullanılarak in vitro trofoblast olarak ayırt edilebilirphogenic Proteinler 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. BMP4 kullanarak trofoblastik hücrelerin pluripotent hücrelerin Bu dönüşüm, insan hücreleri için özeldir ve erken insan embriyosunun 9, 16 erişimi gerektirmez, çünkü yaygın erken insan plasenta gelişimini incelemek için kullanılır. Son zamanlarda, keşfedildi inhibitörleri çok A83-01 (A) ve SMAD2 / 3 ve MEK1 / 2 sinyal yollarının bloke PD173074 (P), trofoektoderm benzeri progenitörleri, esas olarak Syns halinde hPSC farklılaşma verimini artırır ve mezoderm, endoderm, ya da ektoderm hücreleri 9, 17 kapsamlı nesil olmadan EVTs, </sus&gt;. 12 gün, insan blastosist aşamasında embriyoların izole tropo-ektoderm hücrelerini benzer gen ekspresyon profillerine sahip ve çeşitli plasental spesifik büyüme hormonu salgılayan bu ortam şartları kullanılarak, HESC Bu in vitro model sistemi 9, 11 geçerliliğini destekleyen farklı. Burada, BMP4 / A / P kültür ortamı kullanılarak insan trofoblast progenitörlerde hPSCs in vitro farklılaşması için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu koşullar, lipofeksiyon aracılı transfeksiyon kullanılarak RNA sekanslama, gen bozulması siRNA&#39;lar kullanılarak patojen enfeksiyonu ve genetik modifikasyonunu da içeren uygulamalarda, çok çeşitli hücrelerin, bol sayıları üretir.

<table><tbody><tr><td>DMEM / F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Knock Out Serum Replasmanı</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>Bu, bu protokolde "serum replasmanı" olarak adlandırılır.</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>İnvitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>İnvitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>İnvitrogen</td><td>15140-155</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>B-FGF</td><td>Kırlangıç</td><td>GF-003</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>İnvitrojen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip IV</td><td>İnvitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Kaya inhibitörü Y27632</td><td>Calbiochem</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>Işınlanmış CF1 MEF'ler</td><td>GlobalStem</td><td>6001G</td><td>MEF'ler embriyonik gün 13.5 embyosundan üretilebilir ve ışınlanabilir.</td></tr><tr><td>0.22 ve mikro; m şırınga filtresi</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150i düşük oksijenli inkübatör</td><td>Heracell/VWR</td><td>89187-192</td><td>Oksijen konsantrasyonlarını düzenleme kapasitesine sahip herhangi bir doku kültürü inkübatörü yeterlidir.</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>314-BP-01M</td><td></td></tr><tr><td>A 83-01</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>PD173074</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>3044/10</td><td></td></tr><tr><td>RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td>Trizol, toplam RNA'yı izole etmek için kullanılır.</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Bu, bu protokolde "hücre dışı matriks" olarak adlandırılır.</td></tr></tbody></table>

insan pluripotent İn vitro farklılaşma trofoblastik hücreleri içine kök hücreler

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Plasenta embriyogenez sırasında geliştirmek için ilk organdır ve gelişmekte olan embriyonun yaşam için gereklidir. Plasenta preimplantasyon blastosist ekstra embriyonik trofoektoderm hücrelerinden ayırt çeşitli trofoblastik hücrelerin oluşur. Bu nedenle, insan plasenta erken farklılaşma olayları anlayışımız nedeniyle insan embriyogenez izolasyon ve manipülasyon etik ve yasal kısıtlamaların sınırlıdır. Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) insani gelişmeyi araştırmak için sağlam bir model sistem ve aynı zamanda çeşitli trofoblastik hücre tiplerinin işaretleri ifade trofoblastik hücrelerin içine in vitro ayırt edilebilir. Burada, kemik morfojenik protein 4 ve Aktivin / Düğüm sinyal yollarının inhibitörleri kullanan trofoblastik hücrelerin içine hPSCs ayırt etmek için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu protokol, siRNA&#39;lar ile transfekte edilebilir, çeşitli trofoblastik hücre tipleri oluştururkayıp-fonksiyon fenotipleri soruşturma veya patojenler ile enfekte olabilir için. Ayrıca, hPSCs genetiği değiştirilmiş olabilir ve daha sonra fonksiyon-kazanç analizleri için trofoblast atalarıdır ayrışmıştır. HPSCs başlayarak insan trofoblast üretmek için bu in vitro farklılaştırma yöntemi erken insan embriyosunun ile çalışma etik ve yasal kısıtlamalar üstesinden gelir ve bu sistem ilaç keşfi ve kök hücre araştırmaları da dahil olmak üzere, çeşitli uygulamalar için de kullanılabilir.

HPSCs İn Vitro Farklılaşma Bakış Bu in vitro farklılaştırma protokolü bir pasaj (Şekil 1A) şartlarını serbest besleyici geçişi yapılır MEFS yetişen farklılaşmamış hESC ile başlar. Bu protokolde hESC farklılaşma tarif ederken, başarılı trofoblastik hücrelerin içine hiPSCs ayırt etmek için bu protokolü kullanılır. ekstraselüler matriks geçiş insan trofoblastik hücrelerin saf popülasyonları gerekti...

Burada, kemik morfojenik protein 4 ve Aktivin/Nodal yolların inhibitörlerini kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinden verimli bir şekilde insan trofoblastik hücreleri üretmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, insan pluripotent kök hücrelerinin verimli bir şekilde farklılaşması için uygundur ve genetik manipülasyon için büyük miktarlarda hücre üretebilir.

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Bu protokolün genel amacı, insan plasenta oluşumunun ve işlevinin erken evrelerini incelemek amacıyla, kemik morfogenetik protein 4 ve aktif ve nodal sinyal yolu inhibitörlerini kullanarak insan pluripotent kök hücrelerini insan trofoblastik hücrelerine farklılaştırmaktır. Bu yöntem, trofoblastik hücre işlevlerinin incelenmesi ve bu hücrelerin nasıl oluştuğuna dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, genetik dahil olmak üzere çok çeşitli uygulamalar için bol miktarda trofoblastik hücre üretebilmesi ve hücre işlev analizlerine olanak tanımasıdır.Deneye başlamak için, ekstraselüler matriksin bir alikotunu buz üzerinde üç ila dört saat boyunca çözdürün. Buz gibi soğuk uçlar, bir adet soğuk 50 mililitre konik tüp ve Dulbecco modifiye eşit besiyeri veya DMEM F12 besiyeri kullanarak, iki miligram ekstraselüler matriksi 24 mililitre buz gibi soğuk DMEM F12 içine aktarın. 50 mililitre konik tüpü hemen buza aktarın ve dört santigrat derecede saklayın.Doku kültürü plaklarını kaplamak için, altı kuyucuklu bir plağın her kuyucuğuna bir mililitre seyreltilmiş hücre dışı matrisi ekleyin. Kuyucukların kaplanması için plağı dairesel hareketlerle sallayın ve plağı oda sıcaklığında en az bir saat inkübe edin. Yeni plaktaki hücre dışı matrisi aspire edin ve bFGF içeren fare embriyonik fibroblast kondisyonlu ortam veya MEFCM ekleyin.Sıyırılan hücresel kümeleri MEF plakasından aktarmak için bir pipet kullanın ve bunları ekstrasellüler matris ile kaplanmış plakaya paylaştırın. Ardından plakayı inkübe edin. MEFCM'yi her gün bFGF medyumu ile değiştirmeden önce, bir kuyu için iki mililitre medyum kullanarak, farklılaşmış hücreleri bir Pasteur pipeti ile sıyırarak temizleyin.Koloniler mikroskop altında büyük ve parlak göründüğünde, hESC'leri her altı ila yedi günde bir pasajlayın. Besleyici hücresiz (feeder-free) hücreler pasajlamaya hazır olduğunda, medyumu uzaklaştırın ve bir pipet kullanarak bir mililitre PBS ekleyip hücreleri yıkayın. PBS'yi aspire edin ve bir pipet yardımıyla yerine önceden ısıtılmış 0,5 mg/mL dispase ekleyin.Hücreleri 37 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, her kuyucuğa iki mL PBS ekleyerek hücreleri PBS ile yıkayın ve PBS'yi aspire edin. Her kuyucuğa bir mL CM ekleyin ve beş mL'lik bir pipet ucu kullanarak hücreleri manuel olarak kazıyıp küçük kümeler haline getirin.Ardından, süspansiyon halindeki hücre kümelerini yeni hücre dışı matris kaplı plaklara ekleyin. Diferansiyasyon besiyerini hazırlayın. bFGF içermeyen CM kullanın ve kullanımdan önce taze inhibitörler ekleyin.İnkübatörde %5 oksijen altında kültüre edilen, hücre dışı matris kaplı plaklarda tek pasaj boyunca büyütülmüş feeder-free hESC'ler kullanın. Hücre dışı matris kaplı plakalara yapılan ilk pasajdan sonra, hücrelerin tutunması için 24 saat bekleyin. Ertesi gün, bFGF içeren CM'yi uzaklaştırıp yerine altı kuyucuklu plakada kuyucuk başına iki mililitre olacak şekilde BMP4/A/P içeren CM ekleyerek farklılaşmayı başlatın.Hücreleri %4 oksijen seviyelerinde kültüre etmeye devam edin. Eski medyumu aspire ederek ve BMP4/A/P içeren yeni medyum ekleyerek, BMP4/A/P içeren CM'yi iki günde bir yenileyin. Hücreleri istenen zaman noktalarında toplayın.MEF'lerden aktarıldıktan sonra, bFGF içeren hESC ortamı ile hücre dışı matris üzerinde hESC'leri iki pasaj boyunca kültüre edin. Yüksek hücresel konfluens önemlidir, bu nedenle hESC'leri, ertesi gün en az %50 konfluens sağlayacak şekilde yeni bir plakaya bire bir oranında bölün. Hücreleri düşük oksijenli inkübatörde gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, besiyerini kuyuk başına iki mililitre diferansiyasyon besiyeri ile değiştirin. Hücreleri gece boyunca düşük oksijenli bir inkübatöre yerleştirin. Transfeksiyon öncesinde, bir kaba %0,1 jelatin ekleyerek kabı jelatin ile kaplayın.Plakayı kaplamak için kabı dairesel hareketlerle sallayın, ardından plakayı oda sıcaklığında bekletin. 20 dakika sonra jelatini uzaklaştırın. Hücreleri istenen zaman noktasına kadar farklılaştırın.Transfeksiyonun bir gün öncesinde, hücreleri %0.05 tripsin kullanarak beş dakika boyunca tripsiniz edin. Hücreleri, istenen konfluense ulaşacak şekilde jelatin kaplı plakaya ekleyin. bFGF içermeyen, BMP4/A/P içeren CM ekleyin ve kültürü gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, hücrelere taze diferansiyasyon ortamı ekleyin. siRNA'ları bir siRNA transfeksiyon reaktifi kullanarak transfekte edin. Plazmid DNA için uygun bir lipofectamine reaktifi kullanın.Her bir transfeksiyon reajanı için açıklanan ürün protokolünü uygulayın. siRNA lipofektamin komplekslerini her bir kuyucuğa veya hücre plağına aktarın ve nazikçe karıştırın. Ardından hücreleri düşük oksijenli bir inkübatörde gece boyunca kültüre edin.Ertesi gün, medyayı taze farklılaşma medyası ile değiştirin. Gen bozunma verimliliğini kantitatif RT-PCR kullanarak kontrol etmek için hücreleri istenen zaman noktalarında toplayın. Son olarak, hücreleri toplamak için kuyuk başına bir mililitre %0,05 tripsin ekleyin ve hücreleri inkübe edin.Tripsini nötralize etmek için kuyuk başına beş mililitre MEF medyumu ekleyin. Hücreleri 200 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve RNA izolasyonu için hücre peletini kullanın. Bu teknik kullanıldığında, morfolojik değişiklikler net bir şekilde görülür.Diferansiyasyonun birinci günündeki hücreler, sıfırıncı gündeki hücrelerden daha büyüktür. Diferansiyasyon ilerledikçe hücreler bölünür ve koloninin merkezinden dışarıya doğru genişleyerek büyürler. Beşinci diferansiyasyon gününe gelindiğinde, hücrelerin üst üste büyümesiyle bireysel koloniler birbirleriyle birleşir.QRT-PCR analizi, hücreler BMP4 ile kültüre edildiğinde pluripotent C-markörü NANOG'un bağıl ekspresyon seviyelerinin diferansiyasyonun birinci gününden sonra %75 oranında azaldığını ve BMP4/A/P varlığında %90 oranında azaldığını ortaya koymaktadır. Diferansiyasyonun ikinci gününde, sadece BMP4 veya BMP4/A/P ile kültüre edilen hücrelerdeki NANOG seviyeleri, beta FGF içeren hESC CM ortamındaki hücrelere kıyasla oldukça düşüktür. Diferansiyasyonun birinci ve üçüncü günlerinde BMP4/A/P ile işlem görmüş hücrelere bir GFP plazmidi kullanılarak gerçekleştirilen transfeksiyonlarda, transfeksiyondan 24 saat sonra %30 ila %50 arasında transfeksiyon verimliliği elde edilmiştir.Bu videoyu izledikten sonra, insan pluripotent hücrelerinin in vitro ortamda trofoblastik hücrelere nasıl farklılaştırılacağı ve gen ekspresyonunu manipüle etmek için DNA konstrüktlarının nasıl tanıtılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

in-vitro-differentiation-human-pluripotent-stem-cells-into

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video, fare blastosist blastosist trofoblast kök hücrelerinin izolasyonu ve derivasyon göstermektedir. Ayrıca kök hücre özelliği yanı sıra kültür farklılaşma indüksiyonu için bakım koşulları açıklar.

Blastosist Fare trofoblast Kök Hücre türetilmesi

Bu protokol, biz bir Percoll gradyanı kullanılarak trofoblast hücrelerinin izolasyonu takiben gebelik d10.5 üzerinde fare plasenta diseksiyonu tarif. Daha sonra bir Matrigel işgali tayininde izole hücrelerin kullanımını göstermektedir.

Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu

Geleneksel iki boyutlu hücre kültür teknikleri genellikle farklılaşma belirteçleri, sitokinler ve büyüme faktörleri açısından değişmiş özellikleri. Extravillous trofoblast hücre hattı ile burada gösterildiği gibi dönen hücre kültür sistemi Üç boyutlu hücre kültürü (RCC), bu faktörlerin çoğunun ifade yeniden kurar.

İnsan Hücre Kültürü Döner Hücre Kültür Sistemleri: Bir Model Olarak İnsan trofoblast Hücreleri

Bu el yazması, hipoksi/reoksijenasyon altında kültürlenen, immün olarak saflaştırılmış insan villöz sitrofoblast hücrelerinin benzersiz bir in vitro modelini sunmaktadır. Bu model, melatonin gibi umut verici tedavilerin, artmış oksidatif stres ve değişmiş plasenta fonksiyonu ile ilişkili gebelik komplikasyonları üzerindeki koruyucu etkilerini incelemek için uygundur.

İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması

Burada, murin embriyonik fibroblastlarının, Tfap2c, Gata3, Eomes ve Ets2'nin on günlük aşırı ekspresyonu ile tamamen işlevsel ve stabil trofoblast kök hücrelerine doğrudan dönüştürülmesi için bir protokol sunuyoruz.

Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

Trofoblast dev hücreleri (TGC'ler), sağlıklı bir hamilelik sağlamak için plasentada anahtar bir rol oynar. İmplantasyon sonrası embriyoların kriyostat kesitleri veya embriyonik 7. gün ektoplasental konilerin kısa süreli kültürleri üzerinde yeni ortaya çıkan floresan in situ hibridizasyon ile TGC'lerdeki genlerin transkripsiyonel durumunu değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz.

ve Doğan RNA FISH ile kopyalanma Analizi<em&gt; İn Vivo</em&gt; Trofoblast Dev Hücreler ya da<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ectoplacental Koni Eksplantlarından kısa vadeli Kültürler

Burada, üç tüp bebek deneyleri kullanarak insan Trofoblast hücreleri hücre hareketinde değerlendirmek için son derece erişilebilir bir iletişim kuralı mevcut: sıfırdan tahlil, transwell istila tahlil ve Hücre proliferasyonu tahlil.

Vitro deneyleri içinde geçiş, işgal ve ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları yaygın değerlendirmek için

Burada, vitrifiye insan blastosistlerinin ısınması, in vitro implantasyon dönemi boyunca ekinde, tek hücrelere sindirilmesi ve daha fazla araştırma için erken trofenlast hücrelerinin toplanması için bir yöntem tanımlıyoruz.

Peri-implantasyon Aşamasında Trophoblast Hücrelerinin Tek Hücre Li Hücre Koleksiyonu İnsan Embriyoları

Verimli, zamanında ve sırayla blastosist benzeri hücreler üreten insan blastoidlerinin oluşumunu özetleyen bir protokol.

İnsan Blastoidlerinin Modellenmesi Blastosist Gelişimi ve İmplantasyonu için Protokol

Mevcut protokol, trofoblast hücreleri gibi hücrelerin, hücre dışı bazal membran matrisinin bir tabakası üzerinde kılcal benzeri yapılar halinde organize olduğu klasik in vitro anjiyogenez-tüp oluşum testinde oluşan tüp benzeri yapıların geri kazanılmasına izin verir. Geri kazanılan yapılar, çeşitli biyokimyasal analizler için RNA ve protein izolasyonu için kullanılır.

Farklılaşma İşaretleyici İfade Analizi için Anjiyogenez-Tüp Oluşum Testinden Trofoblast Hücre Geri Kazanımı

Öğrenin, insan pluripotent kök hücrelerini trofoblastik hücrelere farklılaştırma yöntemini. BMP4 ve sinyal yolu inhibitörleri kullanılarak plasenta oluşumunun erken olayları incelenir. Bu teknik genetik manipülasyon için yeterli hücre sağlar.

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

Daha fazla video keşfet