Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

Bu protokolün genel amacı, insan plasenta oluşumu ve fonksiyonunun erken olaylarını incelemek için kemik morfojenik 4 ve aktif ve nodal sinyal yollarının inhibitörlerini kullanarak insan pluripotent kök hücrelerini insan trofoblastik hücrelerine farklılaştırmaktır. Bu yöntem, trofoblastik hücre fonksiyonlarının ve bu hücrelerin nasıl oluştuğunun incelenmesindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, genetik de dahil olmak üzere çok çeşitli uygulamalar için bol miktarda trofoblastik hücre üretebilmesi ve hücre fonksiyon analizlerine izin vermesidir.

Deneye başlamak için, hücre dışı matrisin bir kısmını buz üzerinde üç ila dört saat boyunca çözdürün. Buz gibi soğuk uçlar, bir soğuk 50 mililitre konik tüp ve Dulbecco'nun modifiye edilmiş eşit ortamı veya DMEM F12 ortamı kullanarak, iki miligram hücre dışı matrisi 24 mililitre buz gibi soğuk DMEM F12'ye aktarın. 50 mililitrelik konik boruyu hemen buza aktarın ve dört santigrat derecede saklayın.

Doku kültürü plakalarını kaplamak için, altı oyuklu bir plakanın oyuğu başına bir mililitre seyreltilmiş hücre dışı matris ekleyin. Kuyucukları kaplamak için plakayı döndürün ve plakayı oda sıcaklığında en az bir saat inkübe edin. Hücre dışı matrisi yeni plakadan aspire edin ve fare embriyonik fibroblast şartlandırılmış ortam veya bFGF içeren MEFCM ekleyin.

Kazınmış hücresel kelepçeleri MEF plakasından aktarmak için bir pipet kullanın ve bunları hücre dışı matris kaplı plakaya ayırın. Sonra plakayı inkübe edin. Bir kuyucuk için iki mililitre ortam kullanarak MEFCM'yi her gün bFGF ortamıyla değiştirmeden önce farklılaşmış hücreleri bir Pasteur pipeti ile kazıyın.

Koloniler mikroskop altında büyük ve parlak göründüğünde, her altı ila yedi günde bir hESC'leri geçin. Besleyicisiz hücreler geçişe hazır olduğunda, ortamı çıkarın ve bir pipet kullanarak bir mililitre PBS ekleyerek hücreleri yıkayın. PBS'yi aspire edin ve bir pipetle mililitre önceden ısıtılmış dispas başına 0,5 miligram ile değiştirin.

Hücreleri 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, kuyucuk başına iki mililitre PBS ekleyerek hücreleri PBS ile yıkayın ve PBS'yi aspire edin. Oyuk başına bir mililitre CM ekleyin ve beş mililitrelik bir pipetin ucunu kullanarak hücreleri manuel olarak küçük kümeler halinde kazıyın.

Daha sonra, askıya alınmış hücre kümelerini yeni hücre dışı matris kaplı plakalara yerleştirin. Farklılaşma ortamını hazırlayın. CM'yi bFGF olmadan kullanın ve kullanmadan önce yeni inhibitörler ekleyin.

%5 oksijene ayarlanmış bir inkübatör içinde kültürlenmiş bir geçiş için hücre dışı matris kaplı plakalar üzerinde büyüyen besleyici içermeyen hESC'ler kullanın. Hücre dışı matris kaplı plakalara ilk geçişten sonra, hücrelerin 24 saat boyunca bağlanmasına izin verin. Ertesi gün, bFGF içeren CM'yi çıkararak ve altı oyuklu bir plakada oyuk başına iki mililitre ile BMP4 / A / P içeren CM ile değiştirerek farklılaşmayı başlatın.

% 4 oksijen seviyelerini kullanarak hücreleri kültürlemeye devam edin. BMP4 / A / P içeren CM'yi iki günde bir eski ortamı aspire ederek ve BMP4 / A / P içeren yeni ortam ekleyerek değiştirin. İstenilen zaman noktalarında hücreleri toplayın.

hESC'leri, bFGF içeren hESC ortamı ile MEF'lerden aktardıktan sonra hücre dışı matris üzerinde iki pasaj için kültürleyin. Yüksek hücresel birleşme önemlidir, bu nedenle hESC'leri bire bir yeni bir plakaya bölün, bu da ertesi gün en az %50 birleşme sağlayacaktır. Hücreleri gece boyunca düşük oksijenli inkübatörde inkübe edin.

Ertesi gün, ortamı, farklılaşma ortamının oyuğu başına iki mililitre ile değiştirin. Hücreleri gece boyunca düşük oksijenli bir inkübatöre yerleştirin. Transfeksiyondan önce, jelatin bir tabağa %0.1 jelatin ekleyerek bir tabağı kaplar.

Tabağı kaplamak için tabağı döndürün, ardından tabağı oda sıcaklığında bırakın. 20 dakika sonra jelatini çıkarın. İstenen zaman noktasına kadar hücreleri ayırt edin.

Transfeksiyondan bir gün önce, hücreleri beş dakika boyunca% 0.05 tripsin kullanarak tripsinize edin. Hücreleri jelatin kaplı plaka üzerine istenen birleşim noktasına kadar kaplayın. bFGF içermeyen BMP4 / A / P içeren CM ekleyin ve kültürü gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, hücrelere taze farklılaşma ortamı ekleyin. Bir siRNA transfeksiyon reaktifi kullanarak siRNA'ları transfekte edin. Plazma DNA'sı için uygun bir lipofektamin reaktifi kullanın.

Her bir transfeksiyon reaktifi için açıklandığı gibi ürün protokolünü izleyin. siRNA lipofektamin komplekslerini her bir hücre kuyusuna veya plakasına aktarın ve hafifçe karıştırın. Daha sonra hücreleri gece boyunca düşük oksijenli bir inkübatörde kültürleyin.

Ertesi gün, medyayı yeni farklılaştırma medyası ile değiştirin. Kantitatif RT-PCR kullanarak gen bozulma verimliliğini kontrol etmek için hücreleri istenen zaman noktalarında hasat edin. Son olarak, hücreleri hasat etmek için, oyuk başına bir mililitre% 0.05 tripsin ekleyin ve hücreleri inkübe edin.

Tripsini nötralize etmek için kuyu başına beş mililitre MEF ortamı ekleyin. Hücreleri beş dakika boyunca 200 kez g'de döndürün ve hücre peletini RNA izolasyonu için kullanın. Bu tekniği kullanarak, morfolojik değişiklikler açıkça görülür.

Farklılaşmanın birinci günündeki hücreler, sıfırıncı günkü hücrelerden daha büyüktür. Farklılaşma ilerledikçe, hücreler bölünür ve koloninin merkezinden dışarı doğru genişler, dışa doğru büyür. Bireysel koloniler, beşinci günde farklılaşma ile bir araya gelir ve hücreler birbiri üzerinde büyür.

QRT-PCR analizi, pluripotent C-marker NANOG'un nispi ekspresyon seviyelerinin, hücreler BMP4 ile kültürlendiğinde bir günlük farklılaşmadan sonra %75 oranında azaldığını ve BMP4/A/P varlığında %90 oranında azaldığını ortaya koymaktadır. İkinci gün farklılaşmaya göre, NANOG seviyeleri, tek başına BMP4'te veya BMP4 / A / P'de kültürlenen hücreler için, beta FGF içeren hESC CM ortamındakilere kıyasla çok düşüktür. Bir GFP plazmidi kullanılarak gerçekleştirilen ve birinci ve üçüncü gün farklılaşma gününde BMP4 / A / P ile muamele edilen hücrelere sokulan transfeksiyonlar, transfeksiyondan 24 saat sonra% 30 ila% 50 transfeksiyon verimliliği elde etti.

Bu videoyu izledikten sonra, insan pluripotent hücrelerinin in vitro trofoblastik hücrelere nasıl ayırt edileceğini ve gen ekspresyonunu manipüle etmek için DNA yapılarının nasıl tanıtılacağını iyi anlamış olmalısınız.