Name: Geliştirilmesi Metarhizium anisopliae Bir Mycoinsecticide Olarak: İzolasyondan Saha Performansına (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: Keşfedin, Metarhizium anisopliae kullanarak yerel izolatların izolasyonu, tanımlanması ve böcek biyosuayları ile etkili bir mycoinsecticide geliştirme yöntemlerini. Bu sürdürülebilir biyokontrol yaklaşımı tarımsal zararlı yönetiminde sentetik pestisitlere olan bağımlılığı azaltır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Yeni Delhi ve İsviçre, Berne, Kalkınma ve İşbirliği İsviçre Ajansı&#39;nın Biyoteknoloji Bölümü&#39;ndeki Hint-İsviçre İşbirliği Biyoteknolojideki İşbirliği (ISCB) programındaki işbirlikçilerinin katkısını kabul ediyor. Vandana Ghormade, Pallavi Nahar, Priya Yadav, Shuklangi Kulkarni, Manisha Kapoor, Santosh Chavan, Ravindra Vidhate, Shamala Mane ve Abhijeet Lande dahil olmak üzere mikozinsit geliştirilmesine katılan proje öğrencilerinin ve çalışanların katkıları kabul edilmektedir. EKP ve SGT araştırma bursları için sırasıyla Üniversite Hibeler Komisyonu, Hindistan ve Bilimsel ve Endüstriyel Araştırma Konseyi (CSIR), Hindistan&#39;a teşekkür ederler. MVD, Emeritus Scientist Scheme için Yeni Delhi Sanayi ve Bilimsel Araştırma Konseyi&#39;nin desteğini onayladı. Yazarlar ISCB ve SBIRI programları kapsamında maddi destek için Yeni Delhi, Hindistan Biyoteknoloji Bölümü&#39;ne minnettarlar. Teşekkür ederizOnların girdileri için yorumcular.

1. Entomopatojenik Mantarların İzolasyonu <ol><li> Toprak seyreltme yöntemi <ol><li> Farklı mahsul alanlarından toprak numunelerini ve bitkisel böcekleri toplayın ( Tablo 1 ). Toprak seyreltme kaplama yöntemi 8 kullanarak toprak numunelerinden entomopatojen mantarları izole edin. Not: Bu çalışmada, Pune&#39;dan (18 ° 31&#39;13&#39;&#39;N; 73 ° 51&#39;24&#39;&#39;) ve Buldana&#39;da (19 ° 58&#39;36&#39;&#39;N 76 ° 30&#39;30&#39;&#39;E ) Ilçeleri, Maharashtra, Hindistan. </li><li> Her toprak örneğinden 10 g tartın ve bunları 90 ml steril% 0.1 (w / v) Tween-80&#39;e ayrı ayrı ilave edin. </li><li> Toprak parçacıklarına yapışan sporları serbest bırakmak için numuneleri 60 dakika boyunca manyetik bir karıştırıcı kullanarak iyice karıştırın. </li><li> Karıştırıldıktan sonra, her bir numuneden 100 ila 200 uL&#39;lik bölümler, (g / L) içeren seçici ortam üzerine yayılır: pepton, 10; Glukoz, 20; Agar, 18; Streptomisin, 0.6; Tetrasiklin, 0.05; cycLoheksamid, 0.05; Ve dodin, 0.1 mL; PH 7.0 9 . Plakaları 28 ° C&#39;de 3-7 gün inkübe edin. </li><li> Saf kültürler elde etmek için aynı ortamdaki bireysel sporlaşan kolonileri seçin ve altkültür edin. </li></ol></li><li> Kasık böceklerinden <ol><li> Sahadaki mikroskobik böcekleri toplayın. Not: Sert larval bir vücuda muhtemelen entomopatojenik mantar bulaşmış olabilir. Bakteri veya virüs enfeksiyonu ile ölü böcek vücudu yumuşaktır. </li><li> Anormal davranış, kötü eşgüdüm ve sarsıntılı hareketlerle canlı böcekleri toplayın. </li><li> Ölene kadar böcekleri tutun ve daha sonra 28 ° C ve% 70-80 RH&#39;de daha fazla mikoz ve sporülasyon için nemli odacıklara aktarın. </li><li> Sporları sporüle edici kadavrandan yukarıda bahsedilen seçici ortam üzerine çizin ve aynı ortamda 2-3 kez daha alt kültürleyerek saf kültürler elde edin. </li></ol></li><li> Bait yöntemi <ol><li> İçinde60 g toprak örneği içeren şişe (3.85 x 6.0 cm), 4 adet pirinç güvesi larvası ( Corcyra cephalonica ) ekleyin ve ampulleri 25 ± 2 ° C&#39;de 14 gün süreyle saklayın. </li><li> Şişeleri ters çevirin her gün. 14 gün sonra, toprak örneklerinde, mızraklı pirinç güvesi larvalarının varlığı açısından tarama yapın. Seçici ortamda sporüle edici kadavraklardan sporlar çizerek entomopatojenik mantarları izole edin. </li><li> Saf kültürler elde ettikten sonra izolatları patates dekstroz agar (PDA) eğimlerine aktarın ve sporülasyona izin vermek için 28 ° C&#39;de ve% 70-80 RH&#39;de 7 gün inkübe edin. Sporlamayı takiben, ana kültürleri kullanıma kadar 8 ° C&#39;de muhafaza edin. </li></ol></li></ol> 2. Entomopatojenik Mantarların Tanımlanması <ol><li> Morfolojik özelliklerini gözlemleyerek, entomopatojenik mantarları tanımlayın ( örn., Eşeysiz spor boyutu ve şekli ile sporların konidyoforlar üzerindeki düzenlenmesi); 3 ana cins izolatı, Metarhizium , Beauv<html> Eria ve Nomuraea , tespit edilebilir. </li><li> Metarhizium suşlarının moleküler tanımlanması için bir DNA izolasyon kiti kullanarak misel biyokütlenin genomik DNA&#39;sını çıkarın; Üreticinin talimatlarını izleyin (Malzeme Tablosuna bakın). % 0.8 agaroz jel üzerinde elektroforez uygulayarak genomik DNA&#39;nın kalitesini kontrol edin. <ol><li> ITS1-5.8S-ITS2 ve 26S rDNA bölgesinin PCR ile çoğaltılması. Genetik DNA&#39;yı şablon olarak kullanın, ITS1 ileri (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) ve ITS4 ters (TCCTCCGCTTATTGATATGC) primerlerle 10 . </li><li> Jel-elute ve bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak beklenen boyut amplikonları saflaştırmak; Üreticinin talimatlarını izleyin (Malzeme Tablosuna bakın). Saflaştırılmış amplikon ve sekansı nicelleştirin. </li><li> Yazılımı kullanarak dizileri okuyun ve düzenleyin ve yakın homolojiyi analiz etmek için NCBI GenBank veri kitaplığında nükleotid dizilerinin BLAST araması yapın= &quot;Xref&quot;&gt; 11. </li><li> Erişim numaralarını almak için tanımlanmış entamopatojenik izolatların dizilerini NCBI GenBank veritabanına yatırın. </li></ol></li></ol> 3. Metarizyum İzolatlarının H. armigera&#39;ya Karşı Taranması <ol><li> Böcek yetiştirme <ol><li> Tarladan böceklerin sağlıklı larva ve pupalarını toplayarak H. armigera&#39;nın ilk kültürünü oluşturun. </li><li> Yetiştirme için, 10 dakika için 12 (3.85 x 6.0 sm 50 ml kapasiteli) steril polipropilen şişelerde ayrı ayrı% 0.5 ile dezenfekte bamya parçalarını ihtiva eden (h / h) sodyum hipoklorit larvası yetiştirme. </li><li> Yetiştirme sırasında döşenen böcek yumurtalarını toplayın ve% 0.5 (h / h) sodyum hipoklorit ile yüzey sterilize edin. </li><li> Larvaları 25 ± 2 ° C ve% 65 ± 5 RH&#39;de muhafaza edin. </li></ol></li><li> Böcek biyolojik tahlil Not: Böcek biyolojik tahlilinde, sporların üretimi,Ve tarla performansı araştırmalarında, aksi belirtilmedikçe, mycosed H. armigera larvalarından Metarhizium suşlarının ilk alt kültürleri kullanılmıştır. <ol><li> Böcek biyolojik tahlilleri için, H. armigera&#39;nın III instar larva&#39;larını kullanın . </li><li> 5 saniye için, tek tek Metarhizium izolatların (canlılık&gt;% 90, 1 x 10 7 spor / aksi belirtilmedikçe, mL) içindeki bir 10-mL spore süspansiyonu içine üç kopya halinde 30 larva bir dizi batırın. </li><li> Tedaviden sonra, yamyamlıktan kaçınmak için her larva ayrı ayrı, steril bir şişeye ayrı ayrı aktarılmalıdır. Her bir şişeye nemli Whatmann filtre kağıdı No.1 ve yem olarak dezenfekte edilmiş bir bamya ekleyin. Kağıtları değiştirin ve alternatif günlerde besleyin. </li><li> Larvaları 25 ± 2 ° C, 65 ± 5% RH ve 16: 8 ışıkta karanlık olarak 14 gün boyunca veya ölene kadar tutun. </li><li> Ölü larvaları, nemli pamuklu çubuk içeren steril Petri plakalarına aktarın ve 3-6 gün boyunca 28 ° C&#39;de ve% 70-80 RH&#39;de muhafaza ederek mikseri ve sporu sağlayınKadavra üzerinde oluşum. </li><li> Bir kontrol için steril damıtılmış su içinde% 0.1 (w / v) Tween-80 ile üçlü bir grup 30 larva tedavi edin. </li><li> Tüm deneyleri taze hazırlanmış spor süspansiyonlarını kullanarak üçer defa uygulayın. Ortalama değerleri elde etmek için üç deneyden yüzde mortalite verileri toplayın ve havuzlayın. Abbott&#39;un formülünü kullanarak düzeltilmiş yüzde ölüm oranını hesaplayın 13 . </li><li> Denemeleri, her muamele üçlü olarak 30 larvanın bir setini içeren randomize tam blok tasarımı (RCBD) düzeni kullanarak gerçekleştirin. H. armigera&#39;ya karşı yüzde ölüm oranına dayanarak, ticari üretim için en iyi izolatın daha fazla taranması için Metarhizium izolatlarını seçin. </li><li> H. armigera III instar larvalarına karşı&gt;% 90 mortalite gösteren izolatları seçin. Not: Burada, 12 izolat seçildi. </li><li> Bu izolatların LT 50 değerlerini belirleyin ve izolat demonst&#39;u seçinEn hızlı öldürmeyi derecelendirin (daha kısa sürede). Not: Burada, en güçlü 12 izolattan 5 izolat seçildi. </li><li> Seçilen izolatların LC 50 değerlerini spor süspansiyonunun dört farklı konsantrasyonu (örn. 1 x 10 3 , 1 x 10 5 , 1 x 10 7 ve 1 x 10 9 spor / mL) kullanarak belirleyin. </li><li> Tek bir doz kullanıldığında saptanamayacak kadar yüksek mortalite değerlerine sahip izolatların virülansındaki farkı tanımlama imkânını artırmak için Metarizyum izolatlarının LC 50&#39;sini H. armigera&#39;nın III talent larvalarına karşı belirler. </li></ol></li></ol> 4. Alan Performansı Çalışmaları İçin Bir Metarhizium İzolatının Sporlarının Üretilmesi <ol><li> SSF tarafından Metarhizium sporlarının üretimi <ol><li> SSF için, inokulumu Metarhizium izolatlarının 2 x 10 7 sporunu ekleyerek hazırlayın.200 mL YPG (% 0.3 maya ekstraktı,% 0.5 pepton ve% 1.0 glikoz) ortamı. Şişeleri 28 ° C&#39;de çalkalayarak (180 dev / dak) 48 saat inkübe edin. </li><li> Sporların SSF tarafından seri olarak üretilmesi için, aksi belirtilmediği sürece pirinci bir substrat olarak kullanın. </li><li> SSF için, 2 kg pirinçle otoklav torbalarını (tip / 14, 0.5 μm&#39;lik tek bir mikroventli filtre ile; 2 kg kapasiteli; 64 x 36 cm) doldurun. Çantalardaki pirincin içine 1.000 mL damıtılmış su ilave edin ve gece boyunca 14 ° C&#39;de bekletin. 45 dakika için 15 121 ° C&#39;de batırılmış pirinç çanta otoklava. </li><li> Çantaları 48 saat yaşlı miselyum aşı ile (% 10 inokülum, 2 kg pirinç için 200 mL) inoküle edin ve 28 ° C&#39;de ve% 70-80 RH&#39;de 14 gün boyunca inkübe edin. </li><li> Sporları% 0.1 Tween-80 kullanarak sıvı ekstraksiyonu ile hasat edin. Bunun için torbanın içeriğini% 0.1 Tween-80&#39;e (1 kg pilav başına 3 L) ilave edin, iyice karıştırın, sporları santrifüjleyerek sıvıdan ayırın ve 2 gün boyunca 37 ° C&#39;de kurutun. &lt;<html> / Li&gt; <li> Alternatif olarak, nem içeriğini (&lt;% 20) azaltmak için, pilav içeren poşetleri sporlar ve bazı miselyum ile 37 ° C&#39;de 2 gün kurutun. Mikro biçerdöver veya titreşimli elek kullanarak sporları toplayın. </li></ol></li><li> Canlılık çalışmaları <ol><li> Farklı yöntemleri kullanarak hasat edilen sporların canlılık yüzdelerini belirleyin 15 . Bunun için, spor süspansiyonlarını% 0.1 (w / v) Tween-80&#39;de hazırlayın ve sayımı 1 x 10 3 spor / mL&#39;ye ayarlayın. </li><li> Spor süspansiyonlarını (0.1 mL) üç kez PDA plakalarına yayın ve 72 saat boyunca 28 ° C ve% 70-80 RH&#39;de inkübe edin. </li><li> İzole edilmiş kolonileri manuel olarak sayın ve ilgili numunenin toplam canlı sayımını belirleyin. </li></ol></li><li> Spor çökelme hızı <ol><li> Tekdüze bir dozaj için, homojen spor süspansiyonu gereklidir; Tarif edildiği gibi Metarhizium izolatlarının spor çökme oranlarını belirleyebilir&quot;Xref&quot;&gt; 16. Sporların 0.2 M amonyum sülfat ve% 0.1 Tween-80&#39;deki sedimentasyon hızlarını kontrol edin. </li><li> 540 nm&#39;de 0.6 bir başlangıç emicilik elde etmek için yaklaşık 7 x 10 7 spor / mL&#39;ye spor süspansiyonu sayısını ayarlar. Sporların yerleşmesi için küvetler 6 saat boyunca rahatsız edilmemelidir. </li><li> Emicili 6 saate kadar kaydedin. Sedimentasyon oranını yüzde cinsinden ifade edin ve% 50 sedimantasyon için gereken süreyi hesaplayın (ST 50 ). Deneyi, taze hazırlanmış spor süspansiyonlarını kullanarak üç kez tekrarlayın. </li></ol></li></ol> 5. Seçilmiş M. anisopliae İzolatının Güvercin Bezelye&#39;lerinde H. armigera&#39;ya Kontrol Yeteneğinin Alan Performansı Çalışmaları <ol><li> M. anisopliae M 34412 sporlarının ıslanabilir toz formülasyonu <ol><li> Sporları talk ile karıştırarak% 2.5-5 ıslanabilir toz formülasyonunu hazırlayın. </li><li> Son canlı sayımı (TVC) 1 x 10 12 spoya ayarlayınFormülasyonun kilogramı başına res. </li></ol></li><li> M. anisopliae M 34412 sporlarının tarla performansı çalışmaları <ol><li> Seçilen M. anisopliae izolatının güvercin bezelye suyunda H. armigera istilasını kontrol etme becerisinin saha performansı araştırmaları için, dört kez tekrarlanan bir RCBD kullanın. Not: Burada, Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth (MPKV), Rahuri&#39;de (19.3927 ° N, 74.6488 ° E) gerçekleştirildi. </li><li> İki farklı sprey formülasyonu, spor yağ formülasyonu (5 x 10 12 spor / 3 L dizel: ayçiçek yağı, 7: 3) ve Tween 80&#39;de sulu bir formülasyon (% 0.1) kullanın. Yağ formülasyonunu süngerli formülasyona sırt çantalı bir püskürtücü (5 x 10 12 spor, 500 L / ha) ile ultra düşük hacimli (ULV) püskürtücülerle (70 dak; 3 L / ha) püskürtün. Not: Burada, larval popülasyonlar spreyden bir gün önce ve her spreyin uygulanmasından 3 ve 7 gün sonra rasgele seçilen 5 bitkiye kaydedildi. Toplam nüfus tIstatistiksel analiz için n + 1 kareköğüsüne ransformed. <ol><li> Güvercin bezelye mahsülünün tarımsal uygulamalarına göre, ilk yumurta döşeme işleminden 10 ve 15 gün sonra ve 14 gün aralıklarla 2 kez daha püskürtün. Püskürtmeyi 16:00 ila 18:00 saatleri arasında gerçekleştirin. Rüzgar yönünü izleyin ve sporların bitişik arazilerde sürüklenmesini önlemek için gerekirse bez perdeleri kullanın. </li></ol></li><li> Karşılaştırma yapmak için, kimyasal böcek öldürücüleri bir el sıkıştırmalı püskürtücüyle püskürtün. </li><li> Püskürtmeden sonra 0, 3, 5, 7 ve 14. günlerdeki H. armigera larvalarını toplayarak alandaki inokülumun ısrarını belirleyin. </li><li> Bu larvaları 14 gün süreyle gözlem altında tutun ve ölümden sonra, nemli filtre kağıdını içeren bir plastik şişeye aktarın. Mikozu gözlemlemek için 25 ± 2 ° C&#39;de ve% 70 ± 10 RH&#39;de inkübe edin. </li><li> Larva popülasyonu üzerindeki inokülumun p&#39;ye dayanılarak kalıcılığını belirleyin<html> Püskürtme sonrası tarladaki larvaların ölüm verileri. </li><li> Yüzde etkinlik 17 , yüzde gözenek hasarı ve yüzde verimi 18 ile alan çalışmalarını değerlendirin. Not: Burada, sıcaklık, nem, rüzgar hızı (km / s), güneş ışığı (h), yağış (mm), yağışlı günler ve buharlaşma (mm) gibi parametreler için veriler bir deneme süresince Tarım üniversitesi (Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth, Rahuri, 19.3927 ° N, 74.6488 ° E). </li></ol></li><li> Çiftçilerin katılım programı <ol><li> Gösterim denemeleri için çiftçilerin sayısını seçin. Güvercin bezelye tohumlarını (BSMR - 736) çiftçilere gübre ile birlikte tedarik edin. Not: Bu çalışmada 20 çiftçi katılmıştır. Köy: Deolali Pravara, (19.473 ° N 74.6 ° E). </li><li> Adım 5.2&#39;deki ile aynı sprey formülasyonlarını ve sprey sayısını kullanın. </li></ol></li></ol>Tle &quot;&gt; 6. Hedef Olmayan Organizmalar Üzerindeki Etki <ol><li> Güvercin bezelye yapraklarında varsa mycoinsecticide sprey etkisine dikkat edin. </li><li> Muamele edilmemiş parsellerdeki ve M. anisopliae ile işlem gören parsellerdeki her muameleden 1 gün sonra toprakta yaşayan eklembacaklıları ve yaprak içinde yaşayan böcekleri toplayın. </li><li> Tedaviden 24 saat sonra çukurluk tuzakları olan toprakta yaşayan eklem bacaklı toplayın ve tedaviyi takiben sabahı yaprak içinde yaşayan böcekleri bir tarama ağıyla toplamayın ( yani, muameleden yaklaşık 15-18 saat sonra). </li><li> Tek tek silindir plastik kutularda tutun. Çubuk çapları 3,5 cm ve yüksekliği 4,0 cm&#39;dir. Günlük böcekleri enfeksiyon açısından kontrol edin ve uygun gıdalarla besleyin. </li><li> M. anisopliae&#39;nin varlığını kaydedin ve eğer mantarın izole edilmesi. </li></ol> 7. Kalite kontrol parametrelerinin tanımlanması <ol><li> PDA&#39;daki spor çimlenmesinin 28 ° C&#39;de ölçülmesiyle spor canlılığını kontrol edinC. </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi 15 , YPG ve kitin ortamında üretilen kütinaz, kitin deasetilaz, kitozanaz, proteaz ve lipaz gibi kütikül degradasyon enzim aktivitelerini ölçün. </li><li> Laboratuvar biyolojik tahlilinde H. armigera&#39;nın ölüm yüzdesini belirleyin 15 . </li><li> M. anisopliae&#39;nin virulans öznitelikleri olarak, PCR-RFLP paterninde Chitinases ( Chit 1 , 2 ve 4 ) ve proteazın ( Pr1A ) genleri gibi moleküler işaretleyicileri kullanın. <ol><li> DNA izolasyon kiti 15 kullanarak mikroskobik biyolojik kütleden genomik DNA&#39;yı çıkarın. Chit1 ve Chit2 gen parçalarını Chit1F / Chit1R (CTCTGCAGGCCACTCTCGGT / AGCCATCTGCTTCCTCATAT) primat çiftleri ve Chit2F / Chit2R (GACAAGCACCCGGAGCGC / GCCTTGCTTGACACATTGGTAA) ile şablon olarak genomik DNA kullanarak amplifiye edin. Chit4 için Chit4F / Chit4R primer çifti kullanın (ATCCGGCAGCACGGCTAC / CTTGGATC CGTCCCAGTTG). </li><li> Pr1A geninin amplifikasyonu için, METPR2 ve METPR5 primer çifti (AGGTAGGCAGCCAGACCGGC / TGCCACTATTGGCCGGCGCG) kullanın. </li><li> Chit1 geninin 19 sınırlama sindirimini BsaJI , BstUI ve ScrFI ile gerçekleştirin ; AluI, HpyCH4IV ve HpyCH4V, ve BstUI, Haelll ve MboI ile Chit4 geninin Chit2 geninin. Pr1A geninin hazmı için Rsal, DdeI ve MspI 20 kullanımı. </li><li> En öldürücü suşlar için her bir gen için elektroforez ile% 1.5 agaroz jel üzerinde kısıtlama fragmanı uzunluğu polimorfizm (RFLP) örneğini izleyin (&gt;% 90 mortalite); Bu, M. anisopliae&#39;nin seçimi için bir virulans markörü olarak kullanılabilir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Aktar, M. W., Sengupta, D., Chowdhury, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+pesticides+use+in+agriculture%3A+their+benefits+and+hazards%5BTitle%5D)+AND+%22Interdisciplinary+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards.</a> Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).</li>
<li>Dhaliwal, G. S., Jindal, V., Mohindru, B. <a target="_blank" href="http://www.indianjournals.com/ijor.aspx?target=ijor:ije&volume=77&issue=2&article=012">Crop losses due to insect pests: Global and Indian scenario.</a> Indian J Entomol. 77 (2), 165-168 (2015).</li>
<li>Popp, J., Peto, K., Nagy, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13593-012-0105-x">Pesticide productivity and food security. A review.</a> Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2015).</li>
<li>van Lenteren, J. C., Manzaroli, G. Evaluation and use of predators and parasitoids for biological control of pests in greenhouses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+Lenteren%2C+JC+%22Integrated+pest+and+disease+management+in+greenhouse+crops%22">Integrated pest and disease management in greenhouse crops</a>. Albajes, R., Gullino, M. L., van Lenteren, J. C., Elad, Y. , Kluwer. Dordrecht, The Netherlands. 183-201 (1999).</li>
<li>Charnley, A. K., Collins, S. A. Entomopathogenic fungi and their role in pest control. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCharnley%2C+AK+%22The+Mycota+IV%3A+Environmental+and+Microbial+Relationships%22">The Mycota IV: Environmental and Microbial Relationships</a>. Kubicek, C. P., Druzhinina, I. S. , 2nd, Springer-Verlag. Berlin. 159-187 (2007).</li>
<li>Deshpande, M. V., et al. Comparative evaluation of indigenous fungal isolates, Metarhizium anisopliae M34412, Beauveria bassiana B3301 and Nomuraea rileyi N812 for the control of Helicoverpa armigera (Hüb.) on pulses. <a target="_blank" href="null">Proceeding of the international workshop on entomopathogenic fungi - a valuable alternative to fight against insect pests</a>. MV, D. eshpande , National Chemical Laboratory. Pune, India. 51-59 (2004).</li>
<li>Roberts, D. W., Hajek, A. E. Entomopathogenic fungi as bioinsecticides. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoberts%2C+DW+%22Frontiers+in+industrial+mycology%22">Frontiers in industrial mycology</a>. Leathan, G. F. , Chapman & Hall. New York, NY. 144-159 (1992).</li>
<li>Goettel, M., Inglis, G. D. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/book/9780124325555">Fungi: Hyphomycetes. Manual of techniques in insect pathology</a>. Lacey, L. A. , Academic Press. USA. 213-245 (1996).</li>
<li>Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1023646207455">Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae.</a> BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).</li>
<li>White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+TJ+%22PCR-Protocols%3A+A+guide+to+methods+and+applications%22">PCR-Protocols: A guide to methods and applications</a>. Innis, M. A., et al. , Academic Press, Inc. San Diego. USA. 315-322 (1990).</li>
<li>Basic Local Alignment Search Tool. , 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST ">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST </a> (2017).</li>
<li>Ignoffo, C. M., Futtler, B., Marston, N. L., Hostetter, D. L., Dickerson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022201175902943">Seasonal incidence of the entomopathogenic fungus Spicaria rileyi associated with noctuid pests of soybeans.</a> J Invertebr Pathol. 25 (1), 135-137 (1975).</li>
<li>Abbott, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+computing+the+effectiveness+of+an+insecticide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Econ+Entomol%22%5BJournal%5D)">A method for computing the effectiveness of an insecticide.</a> J Econ Entomol. 18 (2), 265-267 (1925).</li>
<li>Nahar, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development+of+biocontrol+agents+for+the+control+of+pests+in+agriculture+using+chitin+metabolism+as+target%22">Development of biocontrol agents for the control of pests in agriculture using chitin metabolism as target</a>. , PhD thesis submitted to Department of Microbiology, University of Pune 137(2004).</li>
<li>Kulkarni, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/09583150802366475?journalCode=cbst20">Comparison of Metarhizium isolates for biocontrol of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in chickpea.</a> Biocontrol Sci Tech. 18 (8), 809-828 (2008).</li>
<li>Jeffs, L. B., Khachatourians, G. G. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/m97-004#.WNVDdDvyuUk">Estimation of spore hydrophobicity for members of the genera Beauveria, Metarhizium, and Tolypocladium by salt-mediated aggregation and sedimentation.</a> Can J Microbiol. 43 (1), 23-28 (1997).</li>
<li>Henderson, C. F., Tilton, E. W. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jee/article-abstract/48/2/157/2205826/Tests-with-Acaricides-against-the-Brown-Wheat-Mite?redirectedFrom=fulltext">Tests with acaricides against the brow wheat mite.</a> J Econ Entomol. 48 (2), 157-161 (1955).</li>
<li>Hassani, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development+and+proving+of+biocontrol+methods+based+on+Bacillus+thuringiensis+and+entamopathogenic+fungi+against+the+cotton+pests+Spodoptera+littoralis%2C+Helicoverpa+armigera+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29+and+Aphis+gossypii+%28Homoptera%3A+Aphididae%29%22">Development and proving of biocontrol methods based on Bacillus thuringiensis and entamopathogenic fungi against the cotton pests Spodoptera littoralis, Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae)</a>. , PhD thesis submitted to Justus-Liebig-University Giessen, Germany (2000).</li>
<li>Enkerli, J., Ghormade, V., Oulevey, C., Widmer, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19682457">PCR-RFLP analysis of chitinase genes enable efficient genotyping of Metarhizium anisopliae var. anisopliae.</a> J Invert Pathol. 102 (2), 185-188 (2009).</li>
<li>Bidochka, M. J., Melzer, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11142404">Genetic polymorphism in three subtilisin-like protease isoforms (Pr1A, Pr1B and Pr1C) from Metarhizium strains.</a> Can. J. Microbiol. 46 (12), 1138-1144 (2000).</li>
<li>McCoy, C. W., Samson, R. A., Boucias, D. G. Entomogenous fungi. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCoy%2C+CW+%22Handbook+of+natural+pesticides%2C+Microbial+insecticides%2C+Part+A.+Entomogenous+protozoa+and+fungi%22">Handbook of natural pesticides, Microbial insecticides, Part A. Entomogenous protozoa and fungi</a>. Ignoffo, C. M., Mandava, N. B. , CRC Press. Boca Raton, FL. 151-236 (1988).</li>
<li>Nahar, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/09583150801935650">Effect of repeated in vitro sub-culturing on the virulence of Metarhizium anisopliae against Helicoverpa armigera (Lepidoptera Noctuidae).</a> Biocontrol Sci Tech. 18 (4), 337-355 (2008).</li>
<li>Kapoor, M., Deshpande, M. V. Development of mycoinsecticide for the control of insect pests: Issues and challenges in transfer of technology from laboratory to field. Kavaka. 40, 45-56 (2013).</li>
<li>Deshpande, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycopesticide+Production+by+Fermentation%3A+Potential+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycopesticide Production by Fermentation: Potential and Challenges.</a> Crit Rev Microbiol. 25 (3), 229-243 (1999).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

<html> 1880&#39;li yıllarda, ilk girişim, bok böreği böcekleri, Anisoplia austriaca ve şeker pancarı curculio Cleonis punctiventris 21 kontrol etmek için Metarhizium kullanmaya yapılmıştır. Bu protokolde ön koşullardan biri, ya topraktan ya da enfekte böceklerden oluşan bir öldürücü zararı izole etmekti. Aslında, LC 50 , LT 50 ve ST 50 gibi diğer parametreler, ürünün 22 , 23</s...

<html> Hindistan&#39;da 1940 yılında organik klorlu pestisit tanıtımı itibaren pestisit kullanımı ekin zararlıları hala tarımsal üretimde verim kaybı açısından yıllık rupi 2 milyarlarca mal olan, birçok kat 1 artmıştır. Sentetik pestisitlerin yaygın ve bilinçli kullanılmaması, çevreye ve insan sağlığına sürekli bir tehdittir 1 . Pestisitlerin ayrımsız kullanımı, topraktaki kalıntılara ve doğal zararlı yırtıcı hayvanların tükenmesine yol açar. Aynı zamanda, haşere popülasyonunun genetik yapısını değiştiren, direnç gelişmesine yol açan güçlü bir seçim basıncı olarak işlev görür 1 . Gübreler ve böcek zehirleri gibi yüksek girdileri gerektiren yeşil devrimin büyük yararlarina ragmen zararlılar büyük biotik kısıtlama olmaya devam ediyor. Hindistan ve dünya genelinde kaydedilen yıllık mahsul kayıplarının genel bir tahmini 12 milyar ABD dolarıdırEf &quot;&gt; 2 ve 2 milyar ABD dolar&gt; 3&#39;tür . Kimyasal böcek ilacı böcek zararlılarını kontrol etmek için kullanıldığında zararlı etkilere sahip olduğunda, ekolojik açıdan sağlam, güvenilir, ekonomik ve sürdürülebilir alternatif yöntemler aramak zorunlu hale gelir. Biyolojik kontrol, uygun bir alternatif sunar ve parazitler, predatörler ve mikrobik patojenler 4 içerir . Örneğin fungusların, lepidopteranlar, hymenopteranlar, coleopteranlar ve dipteranlar da dahil olmak üzere geniş bir yelpazede böcek zararlılarını enfekte ettiği bilinir ve çoğu zaman doğal epizootiklere neden olur. Bundan başka, diğer bakteriyel ve viral böcek kontrol maddelerinden farklı olarak, böcek patojen mantarların etki biçimi temasla olur 5 . Bu mantarlar, farklı böcekler arasında yaklaşık 750 tür bildirilen, 100&#39;den fazla cinsiyete sahip heterojen bir gruptan oluşur. Önemli mantar patojenler: Metarhizium sp., Beauveria ss., Nomuraea rileyi, Lecanicillium lecanii ve Hirsutella sp., 6 birkaç isim. M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin, biyokontrolde en çok kullanılan ikinci entomopatojen mantaktandır. 200 böcek türüne 7 saldırı düzenlendiği bilinmektedir 7 . Bu çalışmada M. anisopliae kullanan bir mikropestiditin bilgi temelli gelişiminde yer alan farklı aşamalar sunulmuştur. Bu, şunları içerir: 1) bir kaynak tanımlanması (örn, virülan entomopatojenlerin, 2) entomopatojene tanımlanması ve seçimi için, toprak ya da mycosed böcekler) ya da, 3) stratejileri, laboratuar, biyo deneme içinde ve bu alanda 4 Virütik doğası ve etkinliğini sağlamak için ) Enfektif propagüllerin maliyet-etkin formülasyonu, 5) zararlı preparasyon için eşsiz kalite kontrol parametrelerinin geliştirilmesi ve 6) biyolojik inceleme ve katma ilavesi.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Hi-Media</td><td>RM666</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Amonyum sülfat&nbsp;</td><td>Thomas Baker</td><td>11645</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>DNA analizörü</td><td>Uygulamalı biyosistem</td><td>ABI prizması 3730&nbsp; &nbsp;</td><td>enstrüman</td></tr><tr><td>DNA islasyon kiti</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Dodine</td><td>Sigma</td><td>45466</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Jel ekstraksiyon kiti</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Hi-Media</td><td>GRM077</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Knapsac sparyer</td><td>Kaypee</td><td>HY-16L (1004)</td><td>Enstrüman</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Hi-Media</td><td>RM006-500G</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Polipropilen şişeleri&nbsp;</td><td>Laxbro</td><td>SV-50</td><td>Plastik Eşya Patates</td></tr><tr><td>dekstroz agar (PDA)&nbsp;</td><td>Hi-Media</td><td>M096-500G</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>SRL</td><td>28940</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Ultra düşük hacimli sparyer</td><td>Matabi</td><td>INSECDISK</td><td>Enstrüman</td></tr><tr><td>Unicorn-çantalar&nbsp;</td><td>Unicorn</td><td>UP-140024-SMB</td><td>Otoklaval çanta SSF</td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Hi-Media</td><td>RM027-500G</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Chromas 2.1</td><td></td><td></td><td>yazılımı</td></tr></tbody></table>

geliştirilmesi<em&gt; metarhizium anisopliae</em&gt; bir mycoinsecticide olarak: İzolasyondan saha performansına

Development of Metarhizium anisopliae as a Mycoinsecticide: From Isolation to Field Performance

Ticari mycoinsecticides geliştirirken önemli bir endişe, kimyasal insektisitlere kıyasla öldürme hızıdır. Bu nedenle, hızlı etkili, oldukça öldürücü, entomopatojenik bir mantar seçimi için izolasyon ve tarama önemlidir. Temas halinde hareket eden Metarhizium, Beauveria ve Nomurea gibi entomopatojen mantarlar, böcek zararlıları tarafından alınması gereken Bacillus thuringiensis veya nucleopolyhedrosis virüsünden (NPV) daha uygundur. Mevcut çalışmada, toprakta seyreltme ve yem yöntemi kullanarak enfekte böceklerden 68 Metarhizium suşunu izole ettik . İzolatlar, ITS1-5.8S-ITS2 ve 26S rDNA bölgesinin amplifikasyonu ve sekanslanması ile tanımlandı. En zararsız Metarhizium anisopliae türü, Helicoverpa armigera&#39;nın III instar larvalarına karşı böcek biyolojik tahlillerinde elde edilen ortalama öldürücü konsantrasyon (LC 50 ) ve zaman (LT 50 ) temel alınarak seçilmiştir .Seçilen suş tarafından sporların seri olarak üretilmesi, 14 gün süreyle pirinç kullanılarak bir katı hal fermantasyonu (SSF) ile gerçekleştirildi. Sporlanan spor kütlesi spor ortamından% 0.1 tween 80 kullanılarak ekstrakte edildi ve sporların farklı formülasyonları hazırlandı. Güvercin bezelyelerinde bir H. armigera istila kontrolü için formülasyonların saha denemeleri randomize blok tasarımı ile gerçekleştirildi. Yağ ve sulu formülasyonlar ile elde edilen istila kontrol seviyeleri (sırasıyla% 78.0 ve% 70.9) kimyasal pestisit ile elde edilen% 63.4&#39;ten daha iyi idi.

Araştırmalar sırasında, Metarhizium, Beauveria ve Nomuraea çeşitli tipleri Metarhizium suşları gibi, 14, H. armigera, pals 6 korkunç vebası, 14 kontrol daha etkili olduğu tespit edilmiştir (veriler gösterilmemiştir) 6, çeşitli izolasyon yöntemleri ile izole edilmiştir , Farklı tarlalardan ve böceklerden Metarhizium suşlarını izole etmek için daha fazla izolasy...

Burada, tarımdaki böcek zararlılarının kontrolü için &quot;en uygun&quot; entomopatojenik mantar Metarhizium anisopliae&#39;nin izolasyonu, belirlenmesi, taranması ve seçimi de dahil olmak üzere etkin bir mikozinsektisid&#39;in bilgi temelli gelişiminde farklı aşamaları bildiriyoruz .

Geliştirilmesi<em&gt; Metarhizium anisopliae</em&gt; Bir Mycoinsecticide Olarak: İzolasyondan Saha Performansına

A major concern when developing commercial mycoinsecticides is the kill speed compared to that of chemical insecticides. Therefore, isolation and ...

Sentetik pestisitlerin bilinçsizce kullanımı, çevre ve insan sağlığı için sürekli bir tehdittir. Bakteriler, virüsler ve funguslar kullanılarak yapılan biyolojik kontrol, tarımdaki çeşitli böcek zararlılarını kontrol etmek için uygun bir alternatiftir. Bakterilerin ve virüslerin aksine, böcek patojeni funguslar temas yoluyla etkili olurlar.Metarhizium türleri, en etkili böcek patojeni mantarlardan biridir. 200'den fazla zararlı böcek türüne saldırdığı bilinmektedir. Yerli Metarhizium izolatlarının sporlarını kullanarak bir mikoinsektisit geliştirmiş bulunmaktayız.Bu video size yerel fungal izolatların izolasyonu ve tanımlanması, daha etkili suşların taranması ve seçilmesi için böcek biyotestleri, seçilen Metarhizium suşlarının spor üretimi ve saha uygulamaları için maliyet etkin bir mikoinsektisit formülasyonu oluşturma protokollerini gösterecektir. Ticari üretim sırasında alınması gereken kalite kontrol önlemleri de vurgulanacaktır. Entomopatojenik fungusların izolasyonu üç yöntemle gerçekleştirilebilir.Öncelikle, topraklardan elde edilir. Metarhizium, çoğu toprakta doğal olarak bulunan bir mantardır. Geniş bir izolat çeşitliliği elde etmek için, farklı ürünlerin yetiştirildiği tarlalardan ve birbirinden uzak bölgelerden toprak örnekleri toplanır.Toprak örneği, yüzeyin dört ila altı inç altından alınır. Sahadan alınan örnekler etiketli torbalarda toplanır ve daha sonra laboratuvarda, her örnekten 10 gram viallere aktarılır. Metarhizium, toprak dilüsyon plak yöntemiyle izole edilir.Toprak örneğinin 10 gramı, 90 ml steril %0,1 Tween 80'e aktarılır. Süspansiyon, manyetik karıştırıcı ile 60 dakika boyunca karıştırılır. Bu sırada, seri dilüsyon için 900 mikrolitrelik Tween 80 alikotları hazırlanır.Süspansiyondan elde edilen süpernatan, Tween 80 alikotları ile seri olarak seyreltilir. Her bir örnekten alınan 100 µL'lik alikotlar, Keller ve arkadaşları tarafından tanımlanan besiyerine ekilir. Plakalar 28 °C'de üç ila yedi gün boyunca inkübe edilir.Tekil sporülasyon gösteren koloniler, saf kültürler elde etmek için daha sonra aynı besiyerine alt kültüre aktarılır. Entomopatojenik fungusları izole etmek için tarlalardan ölü böcekler toplanır. Mikozlu kadavralardan gelen sporlar, Tween 80'e aktarılarak ve ardından vorteksleyerek ayrıştırılır.Ardından spor süspansiyonu bir agar plakasına ekilir. Aynı besiyerinde yeniden alt kültürler oluşturularak saf kültürler elde edilir. Topraktaki entomopatojenik fungusları çekmek için pirinç maltı larvaları kullanılır.60 gram toprak örneği içeren bir flakona dört adet pirinç malt larvası eklenir. Flakonlar 28 °C'de inkübe edilir. Bu larvalar normalde toprağın derinliklerine indiği için, larvaların toprak içerisindeki fungal sporlarla temasını kolaylaştırmak amacıyla flakonlar 14 güne kadar her gün ters çevrilir.Ölü larvalar zaman zaman çıkarılır ve sporülasyon için bir nem inkübatöründe tutulur. Mantarın izolasyon süreci, böcek kadavraları için kullanılan süreçle aynıdır. Saf kültürler elde edildikten sonra, izolatlar PDA eğik yüzeylerde muhafaza edilir ve ana kültürler kullanıma kadar sekiz derece santigrat sıcaklıkta saklanır.Mantarların tanımlanması için miselyal biyokütleden genomik DNA ekstrakte edilir. Metarhizium izolatlarının tanımlanması için kullanılan primerler 5', 3', ITS1 ve ITS4'tür. Beklenen boyuttaki amplikonlar jelden elüe edilir, miktarları belirlenir ve sekanslanır.Ardından, izolatların tür düzeyinde tanımlanması için diziler NCBI GenBank Veritabanı ile karşılaştırıldı. Hindistan'ın Maharashtra eyaletinin Pune ve Buldana bölgelerinden toplanan toprak örnekleri ve ölü böceklerden 68 farklı Metarhizium izolatı elde edildi. Bunların 58'i topraklardan, 10'u ise böceklerden izole edildi.55 tanesi Metarhizium anisopliae, sekizi Metarhizium flavoviridae ve beşi Metarhizium robertsii idi. Eğik tüplerden alınan sporlar 10 ml Tween 80 içine eklenir ve vortekslenir. Böcek biyolojik testi için spor sayısı bir hemositometre kullanılarak ölçülür.Ve sayım, ml başına 10⁷ spor olacak şekilde ayarlanır. Üç tekrarlı 30'lu larva setleri, her bir Metarhizium izolatının 10 ml'lik spor süspansiyonuna beş saniye boyunca tek tek daldırılır. Böcek biyolojik analizleri için Helicoverpa armigera'nın geç ikinci veya erken üçüncü instar larvaları kullanılır.İşlemden sonra, her larva, nemli bir numaralı Whatman filtre kağıdı ve besin olarak dezenfekte edilmiş bir bamya parçasının bulunduğu steril bir flakona aktarılır. Steril distile suda %0,1 Tween 80 ile üç tekrarlı olarak işleme tabi tutulan 30 larvalık bir set kontrol grubu olarak kullanılır. Larvalar ölene kadar tutulur ve 14 güne kadar izlenir.Bu adımlar tüm 68 izolat için tekrarlanmıştır. Ölüm yüzdesi, ölü ve canlı larvaların sayılmasıyla hesaplanır. Ölü larvalar, pamuklu çubuklar içeren steril Petri plaklarına aktarılır ve mikoz ve sporülasyon için 28 °C'de ve %70 ila %80 bağıl nemde üç ila yedi gün boyunca bekletilir.Üç deneyden elde edilen yüzde mortalite verileri, ortalama değerleri hesaplamak için bir araya getirilmiş ve ardından Abbott formülü kullanılarak düzeltilmiştir. Helicoverpa armigera'nın üçüncü instar larvalarına karşı medyan öldürücü süreyi belirlemek için, %90'ın üzerinde mortalite gösteren 12 Metarhizium izolatı seçilmiştir. LT 50 değerlerine dayanarak, böcekleri daha hızlı öldüren beş izolat tanımlanmıştır.Tanımlanan beş izolat için medyan öldürücü konsantrasyonlar, spor süspansiyonunun dört farklı konsantrasyonu kullanılarak belirlenmiştir. LC 50 değerlerine dayanarak, katı faz fermantasyonu ile spor üretimi için üç Metarhizium izolatı seçilmiştir. YPD besiyeri hazırlanmış ve 121 °C'de 20 dakika boyunca otoklavlanarak sterilize edilmiştir.Agar eğiklerinden alınan sporlar %0.1 Tween 80'e aktarılır. Seçilen üç Metarhizium izolatının spor süspansiyonları YPD besiyerine eklenir. Ardından flasklar çalkalayıcıda inkübe edilir.İki kilogram pirinçle doldurulmuş otoklavlanabilir Unicorn torbaları, bir litre distile suda gece boyunca bekletilir ve ardından 121 °C'de 45 dakika boyunca otoklavlanır. Katı faz fermantasyonu pirinç, sorgum, mısır ve buğday gibi substratlar üzerinde test edilmiştir. Test edilen substratlar arasında pirinç, Metarhizium izolatlarının maksimum sporülasyonunu desteklemiştir.Torbalar, 48 saatlik %10 miselyal biyokütle ile inoküle edilir. Bu karışım iyice karıştırılır ve 14 gün boyunca inkübe edilir. Sporlar farklı yöntemler kullanılarak hasat edilebilir.Mycoharvester ve Vibrosifter kullanılarak yapılan izolasyon için, sporlanmış miselyum içeren torbalar, nem içeriğini %20'nin altına düşürmek amacıyla iki gün boyunca 37 °C'de kurutulur. Sıvı ekstraksiyonu daha verimli bir yöntemdir. Sporlu pirinçler büyük kaplara konur. Kaplara %0.1 Tween 80 dökülür ve karışım iyice karıştırılır.Herhangi bir pirinç partikülünü uzaklaştırmak için süpernatant filtrelenir. Sporlar, santrifügasyon ile konsantre edilir ve ayrıştırılır. Sporlar daha sonra 37 °C'de iki gün boyunca kurutulur.Bu sporlar, kullanıma kadar -80 °C'de saklanabilir. Saklama sırasında raf ömrünü uzatmak için sporlara talk pudrası eklenir ve karıştırılır. Etkili olabilmeleri için sporların canlı olması gerekir, bu nedenle maksimum sayıda canlı spor veren izolatın belirlenmesi gerekmektedir.Spor süspansiyonları %0,1 Tween 80 içerisinde hazırlanır ve sayım ml başına 10⁷ spor olacak şekilde ayarlanır. 10 µL spor süspansiyonu PDA lamlarına üç paralel şeklinde yayılır ve ardından inkübe edilir. 12 saat içinde, canlı sporlar çimlenmeye başlar.12 saat sonra, çimlenme borusu oluşturan sporlar mikroskobik olarak sayılır. Sporların hidrofilik özelliği, mantarın böcek kütikülüne tutunabilmesi açısından önemlidir. Amonyum sülfat ve Tween 80 içerisindeki bir spor süspansiyonu, bir küretle alınır.Spor içermeyen diğeri kontrol olarak alınır. Spor süspansiyonunun sayımı, 540 nanometrede 0,6'lık bir başlangıç absorbansı elde etmek amacıyla ml başına yaklaşık yedi ile 10⁷ spor olacak şekilde ayarlanır. Sporların çökelmesi için küvetler yaklaşık altı saat boyunca hareketsiz bırakılır.Absorbans kaydedilir ve %50 besleme için geçen süre hesaplanır. Sonuçlara dayanarak, saha uygulamaları için bir suş seçilmiştir. Diğer iki suş ise yedek suşlar olarak kullanılmıştır.Seçilmiş Metarhizium izolatı M34412 sporlarının, güvercin bezelyesi ürünündeki Helicoverpa armigera istilasını kontrol etmedeki saha performansı, dört tekrarlı randomize blok desenle gerçekleştirilmiştir. İki farklı püskürtme formülasyonu bulunmaktadır. %0,1 Tween 80 içindeki formülasyon, sırt tipi püskürtücü ile uygulanır.Sporların bir yağ formülasyonu, ultra düşük hacimli bir püskürtücü ile uygulanır. Püskürtme işlemi sabah veya akşam saatlerinde gerçekleştirilir. İlk püskürtme çiçeklenme evresinde yapılır ve 14 günlük aralıklarla iki kez daha tekrarlanır.Helicoverpa armigera örnekleri, ilaçlamadan sonraki sıfırıncı, üçüncü, beşinci, yedinci ve 14. günlerde toplanmış ve mikoz için bir nem odasında tutulmuştur. Güvercin bezelyesinde Helicoverpa armigera kontrolüne yönelik saha denemeleri sırasında, Metarhizium anisopliae M34412 ile %70'in üzerinde etkinlik elde edilmiştir. Metarhizium anisopliae uygulanan parsellerdeki pod hasarının, kimyasal pestisit uygulanan parsellere ve işlem görmemiş kontrol parsellerine kıyasla en düşük düzeyde olduğu belirlenmiştir.Mikoinsektisitin dizel ayçiçek yağı formülasyonunun etkilerini incelemek için güvercin bezelyesi yaprakları gözlemlenmiştir. Metarhizium anisopliae ile işlem görmüş parsellerden toprakta yaşayan artropodlar ve yaprakta yaşayan böcekler toplanmıştır. Hedef dışı hiçbir artropod üzerinde zararlı bir etkiye rastlanmamıştır.Gösterim denemeleri, 20 çiftçinin katılımıyla doo-lally-pra-va-da köyünde gerçekleştirilmiştir. Formülasyon; yağlı toprak kurdu, benekli bakla kurdu, unlu bit, yünlü afitler ve sivrisinekler gibi diğer böcek zararlılarına karşı da etkilidir. Deneyler, mikoinsektisitlerin üretimindeki temel kalite kontrol parametrelerinin belirlenmesini sağlamıştır.Spor çimlenmesi olarak ölçülen spor canlılığı, 28 °C ve %70 ila %80 bağıl nemde 16 saat boyunca PDA üzerinde %90'ın üzerinde olmalıdır. Laboratuvar biyodeneyinde, 10⁷ spor ile Helicoverpa armigera mortalitesi %90'ın üzerinde olmalıdır. Yapay laboratuvar ortamında tekrarlanan alt kültürleme işlemleri sırasında, organizma virülansını kaybeder.Mantarın kitin ortamında 72 saat boyunca kültüre edilmesinin ardından kitinaz, kitin deasetilaz, kitozanaz, proteaz ve lipaz gibi kütikül degrade eden enzimlerin aktiviteleri ölçülür. Bunlar virülans için biyokimyasal belirteçler olarak hizmet eder. Kitinaz genlerinin sindirimi için üçerli dört farklı restriksiyon enzimi seti kullanılmıştır.%90'dan fazla mortalite gösteren izolatlar, her üç gen için de spesifik patern sergilemiştir. Bu paternler, Metarhizium izolatları tarafından hücre dışı üretilen kütikül degrade edici enzim profilleriyle anlamlı bir korelasyon göstermektedir. İlk kez, kitinaz enzim aktivitesini ve kitinaz geninin PCR paternini virülans markörleri olarak önermekteyiz.Bunlar, ticari ölçekli üretim için kalite göstergeleri olarak hizmet edebilir. Ürünü daha maliyet etkin hale getirmek için miselyum biyokütle çekirdek bitki kökü gelişimini kullanabiliriz. Ayrıca sağlık hizmetleri uygulamaları için kitozanaz izolasyonunda da kullanılabilir.Bu katma değerli ürünler, Metarhizium tabanlı bu mikoinsektisiti daha karlı hale getirecektir.

development-metarhizium-anisopliae-as-mycoinsecticide-from-isolation

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Bu protokol mantar entomopatojenin tanıtmak için iki aşılama yöntemleri...

Endophytes olarak Mantar Entomopatojenlerin Kurulması: Endofitik Biyolojik Kontrol Doğru

Burada, toprak örneklerinden entomopatojenik mantarların (EPF) izole edilmesi ve seçilmesi için kullanılan yemek kurdu (Tenebrio molitor)-yem sistemine dayanan bir protokol sunuyoruz. Sahada zararlı mikrobiyal kontrolü için fizyolojik özelliklere göre yüksek strese dayanıklı EPF seçmek için etkili bir konidia sayısı (ECN) formülü kullanılır.

Toprak Örneklerinden İntomopatojenik Mantarların İzolasyonu ve Seçimi ve Böcek Zararlılarına Karşı Mantar Virülansının Değerlendirilmesi

Entomopatojenik mantarlar tarımsal böcek zararlılarının biyolojik kontrol ajanları olarak önem kazanmıştır. Bu çalışmada, hem Metarhizium robertsii hem de M. pinghaense'nin Güney Afrika izolatlarının yeterli sayıda dirençli enfektif propagülünün böcek zararlılarına karşı ticari uygulama için seri üretimi, tarımsal tahıl ürünleri kullanılarak başarıyla gerçekleştirilmiştir.

Entomopatojenik Mantarların, Metarhizium robertsii ve Metarhizium pinghaense'nin Böcek Zararlılarına Karşı Ticari Uygulama İçin Seri Üretimi

Entomopatojenik mantar kolonileri, Tenebrio yemi, Galleria yemi ve seçici yapay ortam, yani kloramfenikol, tiyabendazol ve sikloheksimid (CTC ortamı) ile desteklenmiş maya özü ile zenginleştirilmiş patates dekstroz agarı kullanılarak tropikal toprak örneklerinden izole edilir.

Entomopatojenik mantarları toprak örneklerinden izole etme yöntemlerinin karşılaştırılması

Bu protokol, partenogenetik bir böcek olan hardal yaprak bitine (Lipaphis erysimi (Kalt.)) karşı entomopatojenik mantarların (EPF) etkinliğini değerlendirmek için optimize edilmiş bir müstakil yaprak biyo-tahlil sistemi sunar. Yöntem, Petri kabı deneyleri sırasında veri toplama sürecini özetleyerek, araştırmacıların EPF'nin hardal yaprak bitlerine ve diğer partenogenetik böceklere karşı virülansını tutarlı bir şekilde ölçmelerini sağlar.

Entomopatojenik Fungusların Partenogenetik Böcek, Hardal Yaprak Biti, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Burada, bir orman odun kurdundan entomopatojenik mantarlar elde etmek için bir protokol ve bir Coleopteran model böcek kullanarak entomopatojenik aktivitelerini değerlendirmek için ikame edici bir yol sunuyoruz. Bu yöntem, doğal ormanlardaki odun delici böcek zararlılarından entomopatojenik mantar kaynaklarını keşfetmek için etkili ve kullanışlıdır.

Bir Orman Ağaç Kurdundan Entomopatojenik Mantarların İzolasyonu, Davranışsal Tanımlama ve Patojenite Değerlendirmesi

Lake ötrofikasyon kritik besin kaynaklarını belirlemek ve kontrol etmek gerek yapım, dünya çapında bir su kalitesi konudur. Sediment çekirdeklerinden fosfor salınım oranlarının belirlenmesi Laboratuvar iç fosfor yükleme rolünü belirleyen ve yönetim kararlarını yönlendirmek için değerli bir yaklaşımdır.

Göl tortulları Laboratuvar belirlenen Fosfor Flux İç Fosfor Yükleniyor bir tedbir olarak

Burada, uzak deniz ortamlarında organik ve inorganik besin mevcudiyetini ve mikrobiyal ve viral toplulukların bolluğunu ve yapısını değerlendirmek için kapsamlı bir protokol sunuyoruz.

Su Kimya ve Deniz Mikrobiyoloji A Field Guide - Okyanusu&#39;nda gaybı Oyuncular çözülüyor

Detaylı yöntemler ticari Isochrysis mikroalglerden değerli birlikte-olarak alkenones co-izolasyonu ile birlikte biyodizel üretimi için sunulmuştur.

Ticari dan Eş Çarpımların olarak Alkenones izolasyonu ile Biyodizel Üretimi için Deneysel Protokolü<em&gt; Isochrysis</em&gt; Alg Biyokütle

ürünlerde eklembacaklı bolluk değerlendirilmesi nüfus dinamikleri ve türlerin etkileşimleri araştırmak için kritik öneme sahiptir. Burada pirinç eklembacaklılar emme örneklemesi için bir yaprak üfleyici-vac değiştirilmesini ve uygulanmasını açıklar.

Modifikasyon ve Arthropodların Saha Örnekleme için bir Yaprak Blower-vac Uygulama

Keşfedin, Metarhizium anisopliae kullanarak yerel izolatların izolasyonu, tanımlanması ve böcek biyosuayları ile etkili bir mycoinsecticide geliştirme yöntemlerini. Bu sürdürülebilir biyokontrol yaklaşımı tarımsal zararlı yönetiminde sentetik pestisitlere olan bağımlılığı azaltır.

Geliştirilmesi

Daha fazla video keşfet