Çift nokta MARCM kullanılması Hücre Lineage Analizleri ve Gen Fonksiyonu Çalışmaları
2 Mart 2017
Burada, iki ayrı renk ortak bir progenitör hücreden türetilen nöron görselleştirme izin veren bir mozaik etiketleme tekniği için bir protokol mevcut. Bu, farklı bireylerin aynı nöronlarda doğum kalma bireysel nöronların kapasitesi ve eğitim gen fonksiyonu ile sinir soy analizi kolaylaştırır.
Bu ikiz noktalı MARCM protokolünün genel amacı, yüksek çözünürlüklü hücre soy analizleri ve daha iyi gen fonksiyonu çalışmaları yapmaktır. Beyin dokusu çok sayıda farklı nörondan oluşur, nöronların gelişim sırasında nasıl bir araya geldiğinin altında yatan mekanizmayı incelemek zordur. Bu tekniğin temel avantajı, ortak nöron progenitörlerinden türetilen nöronları iki farklı renkte etiketlemektir.
Bu, bireysel nöronların bilgilerinin doğumunun geri alınmasına izin verir. Bu nedenle, bu teknik, araştırmacıların nöral gelişimin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmayı keşfetmelerine yardımcı olabilir. Bugün prosedürü gösteren Pei-Chi Chung olacak.
Profesör Yu'nun laboratuvarından bir teknisyen. İkiz noktalı MARCM hazır erkek ve dişileri bir sinek yemi şişesinde ve şişede taze maya ile birleştirerek başlayın. Döllenmiş yumurtaları toplamadan önce çiftleşme şansını artırmak için çapraz çift noktalı MARCM hazır sineklerini iki gün boyunca 25 santigrat derecede tutun.
Larvalar yumurtadan çıktığında aşırı kalabalığı önlemek için, çapraz çift noktalı MARCM hazır sineklerine hafifçe vurun ve taze mayalı şişelere aktarın. İkiz noktalı MARCM yavrularını, istenen gelişim aşamasına ulaşana kadar kültürleyin. Burada, larva aşamasındaki sinekler, flippase ifadesini indüklemek için ısı şokuna tabi tutulacaktır.
Flippase ifadesi için en uygun ısı şokunu belirlemek için sinek şişelerini 10, 20, 30, 40 ve 50 dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosuna aktarın. İlgilenilen çift noktalı MARCM klonlarını oluşturmak için. Isı şokunun zamanlaması, temizleme üretiminin aşamasını belirlerken, ısı şoku periyodu, kaç tane açıklığın oluşturulacağını tanımlar.
İstenen gelişim aşamasına kadar 25 santigrat derecede ısı şoku verilen ikiz noktalı MARCM hayvanlarını kültürleyin. Ardından boyamaya ve montaja devam edin. Forseps koruma kaplarına PBS ekleyin.
Ardından, ikiz noktalı MARCM hayvanlarını bulaşıklara aktarın. Bir diseksiyon mikroskobundan bakarken, ikiz noktalı MARCM hayvanlarının beyinlerini incelemek için forseps kullanın. İlk olarak, kafayı sineğin vücudundan çıkarın.
Ardından beyne zarar vermeden kütikülü nazikçe çıkarın. Daha sonra, beyaz renkli lifler olarak görünen trakeaları dikkatlice çıkarın. Beyinleri% 4 formaldehit ve PBS içeren bir cam spot plakaya aktarın.
Ve oda sıcaklığında 20 dakika sabitleyin. Sinek beyinlerini %1 PBT ile üç kez durulayarak boyama işlemine başlayın. Ve sonra üç kez% 1 PBT ile yıkayın.
Her seferinde 30 dakika çalkalayarak. Sinek beyinlerini, gece boyunca dört santigrat derecede veya oda sıcaklığında dört saat boyunca birincil antikorların bir karışımı ile inkübe edin. Sinek beyinlerini her biri% 1 PBT ile üç kez durulayın ve daha önce olduğu gibi çalkalayarak yıkayın.
Daha sonra sinek beyinlerini ikincil antikorların bir karışımı ile oda sıcaklığında dört saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Beyinleri daha önce olduğu gibi duruladıktan ve yıkadıktan sonra, beyinleri bir söndürme önleyici reaktif içeren bir mikro slayt üzerine monte edin. Ve sonra sinek beyinlerini örtmek ve korumak için bir kapak camı yerleştirin.
Mikro kapak camının kenarlarını kapatın ve şeffaf oje kullanarak mikro kaydırın. Son olarak, tercih edilen konfokal mikroskopi sistemini kullanarak numunelerden ikiz noktalı MARCM klonlarının floresan görüntülerini yakalayın. Bu şekil, flippas indüksiyonu ile türetilen bir VL2p antero dorsal koku alma projeksiyon nöronları olan ikiz nokta MARCM klonunun sonuçlarını göstermektedir.
Embriyonik aşamada adPN nöro blastında mitotik rekombinasyona aracılık etmek. Bu ilk diyagram nörojenez modelini göstermektedir. Beynin bu konfokal mikroskop görüntüsünde, VL2p adPN'leri yeşil renkle gösterilmiştir ve macenta rengindeki çok hücreli nöro blast adPN'leri ile ilişkilidir.
Bu görüntü, yanal boynuzdaki hücreleri göstermektedir. Anten lobunun nöronal morfolojisi burada görülür. Bu resimde DL1 adPN'lere ait veriler gösterilmektedir.
Burada görüldüğü gibi, DL1 adPN'leri, VL2p adPN'lerinden daha sonra geliştirme aşamasında ortaya çıkar. DC3 adPN'lerin ikiz noktalı MARCM klonlarının indüksiyonu, bu nöronal tipin gelişimin ilerleyen dönemlerinde ortaya çıktığını göstermektedir. Bu görüntü, ikiz nokta MARCM olayının, adPN soyu içindeki bir GAL4 negatif nöronda meydana geldiğini göstermektedir.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik araştırmacıların nöral soyu analiz etmelerine ve nöronları nöroblast klonundan ayırt etmek için farklı belirteçler sağlamalarına yardımcı olabilir. Ayrıca, ikiz noktalı MARCM, moleküler mekanizmayı keşfetmek için homozigot mutant klonlar üretebilir. Heterozigot bir genetik arka planda.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, nöronlarda yüksek çözünürlüklü hücre soy analizlerine ve gen fonksiyonu çalışmalarına yönelik olarak tasarlanmış bir iki noktalı MARCM protokolü sunmaktadır. Araştırmacılar, ortak progenitör hücrelerden nöronları iki farklı renkte etiketleyerek, bireysel nöronların gelişimini ve doğum tarihini etkili bir şekilde izleyebilirler.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Gelişimsel Biyoloji
Arka Plan
- Beyin dokusu çeşitli nöronlardan oluşmaktadır.
- Gelişim sırasında nöron birleşimini anlamak karmaşıktır.
- Mevcut teknikler, soy izleme için yeterli çözünürlük sağlamayabilir.
- Bu protokol bu zorlukları ele almayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Ayrıntılı hücre soy analizlerin gerçekleştirilmesi.
- Nöronlarda gen fonksiyonu üzerindeki çalışmaların geliştirilmesi.
- Nöral gelişimdeki hücresel ve moleküler mekanizmaların keşfedilmesinin kolaylaştırılması.
Kullanılan Yöntemler
- Nöron etiketleme için iki noktalı MARCM protokolü.
- Soy izleme için farklı renk markerlerinin kullanımı.
- Yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri.
- Nöronel gelişim ve gen fonksiyonunun analizi.
Ana Sonuçlar
- Ortak progenitörlerden nöronların başarılı bir şekilde etiketlenmesi.
- Bireysel nöronların doğum bilgilerinin alınabilmesi.
- Nöral soy ve gelişim hakkında gelişmiş anlayış.
- Farklı bireylerde gen fonksiyonunu incelemede potansiyel uygulamalar.
Sonuçlar
- İki noktalı MARCM protokolü, sinirbilim araştırmaları için değerli bir araçtır.
- Nöronel soy ve gen fonksiyonunun detaylı analizini sağlar.
- Bu teknik, nöralde gelişimi anlamamızı önemli ölçüde geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding neural lineage and gene function in model organisms provides foundational insights for target validation in neurotherapeutic development. The twin-spot MARCM technique enables high-resolution mapping of neuronal birth order and phenotypic analysis of genetically identical neurons across individuals, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach enhances predictive confidence by linking developmental mechanisms to functional outcomes in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracing neuronal lineage from common progenitors to assess gene function in defined cell populations.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through phenotypic analysis of homozygous mutant clones in heterozygous backgrounds, reducing mechanistic ambiguity.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing quantitative lineage data that correlates with neurodevelopmental disease mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated, color-coded neuronal systems suitable for downstream compound screening in disease-relevant neural circuits.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via inducible, stage-specific clonal generation controlled by heat shock duration.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple neuronal subtypes (e.g., adPN lineages) for comparative phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Supports disease-relevant system modeling by enabling birth-order analysis of neurons implicated in neurodevelopmental disorders.
- Mechanistic De-risking: Allows phenotypic analysis of identical neurons across animals to distinguish genetic from stochastic variability in gene function studies.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery and validation by providing lineage-resolved data for target engagement and pathway modulation studies.
Pipeline & Workflow Integration
The twin-spot MARCM method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical mechanistic studies, particularly for neurodevelopmental indications where neuronal origin and connectivity are critical.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking gene perturbation to lineage-specific neuronal phenotypes.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible neuronal preparations with quantitative outputs based on clonal birth timing and marker expression.
- Analytics: Enables comparative analysis of neuronal morphology and gene expression across developmental stages using dual-color readouts.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by providing lineage-aligned models for biomarker-aligned target modulation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for generating standardized neuronal cohorts across projects and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing lineage-related confounding in gene function studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through controlled clonal induction and standardized staining/mounting protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of lineage-specific phenotypic effects, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing mechanistic clarity on neuronal targets in heterogeneous tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, clonal labeling techniques, and confocal microscopy for accurate lineage interpretation.
- Dependent on instrumentation including heat shock apparatus, dissection microscopes, and confocal imaging systems for clonal induction and visualization.
- Necessitates cross-team standardization of heat shock timing, staining protocols, and imaging parameters to ensure clonal consistency across users.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different neuronal lineages or developmental stages beyond the adPN model shown.
- Includes practical limitations such as clonal efficiency dependence on heat shock duration and the need for optimization per target lineage, as noted in the protocol.
