Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

Bu prosedürün genel amacı, görüntüleme akış sitometrisi kullanarak T hücresi alloreaktivitesini ölçmektir. Bu yöntem, alıcının T hücrelerinin ne kadarının donör alloantijenlerine karşı reaktif olduğu gibi transplantasyon immünolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, akış sitometrisinin çok parametreli kantitatif gücünü, floresan mikroskobisinin görüntüleme yetenekleriyle birleştirerek, bireysel T hücresi antijen sunan hücre sinapslarının yüksek kapasiteli olarak incelenmesine olanak tanır.

Prosedürü, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Sajad Moshkelgosha gösterecek. İşleme, 96 kuyucuklu bir hücre kültürü plakasının her kuyucuğuna 0,5 × 10⁶ dendritik hücre, ardından 1 × 10⁶ T hücresi ekleyerek ve kuyucuk başına toplam hacmi 50 µL kültür ortamı ile tamamlayarak başlayın.

Soğuk kültürleri 37 °C'de ve %5 karbondioksit altında dört saat boyunca inkübe edin. Ardından, her kuyucuğa kültür hacminin üç katı kadar PBS içinde %1,5 formaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Fiksasyon işlemi sona erdiğinde, her kuyucuktaki hücreleri karşılık gelen 5 mL'lik polistiren tüplere aktarın.

Hücreleri, ışıktan korunarak, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 100 µL yıkama tamponu içerisindeki uygun florokrom konjuge antikorlarla boyayın. Ardından, hücreleri 1 mL yıkama tamponu ile yıkayın ve pelletleri phalloidin FITC içeren perm/yıkama tamponu içerisinde yeniden süspanse edin. Işıktan korunarak oda sıcaklığında 30 dakika daha beklettikten sonra, hücreleri 1 mL taze perm/yıkama tamponu ile yıkayın.

Peletleri, oda sıcaklığında, ışıktan korunarak 30 dakikalık son inkübasyon için perm/yıkama tamponu içindeki ilgili nükleer boyada yeniden süspande edin. Hücreleri bir mililitre perm/yıkama tamponu ile yıkayın ve ardından yalnızca yıkama tamponu ile bir kez daha yıkayın. Daha sonra, hücreleri 50 ila 100 µL taze yıkama tamponu içinde yeniden süspande edin.

Hücreleri kapaklı küçük mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Hücreler arası etkileşimleri analiz etmek için, öncelikle parlak alan görüntüleme için bir kanal ayırın ve ilk kontrol tüpünü yükleyin. Parlak alan kanalı kapalıyken, çalışma alanı penceresinde, kullanılan her kanal için alan üzerinden en-boy oranıyla yeni bir dağılım grafiği oluşturun.

En-boy oranının bire yakın olduğu singletleri kapılayın. Her florokrom için pozitif popülasyonu kontrol edin ve gerektiğinde aydınlatma kutusundaki lazer voltajını ayarlayın. Kanallar kutusunda, boyamada kullanılan florokromlar için uygun kanalları seçin.

Ardından, kaydet (record) düğmesine tıklayın. Olay sayısı belirtilen eşiğe ulaştığında, veri toplama işlemi otomatik olarak duracaktır. Tüm tekli boyama kontrolleri toplandıktan sonra, ilk deneysel örnek tüpünü yükleyin ve parlak alan kanalı da dahil olmak üzere uygun analiz kanalları altında on binlerce olay toplayın.

Bir kompanzasyon matrisi oluşturmak için, tekli boyama kontrol veri dosyalarını kompanzasyon sihirbazına yükleyin ve deney için uygun floresan kanalları seçin. Doğru pozitif popülasyonların seçildiğini onayladıktan sonra, matristeki bir değere çift tıklayın ve her kanal için grafiği analiz alanına ekleyin. Kompanzasyon matrisini bir CTM dosyası olarak kaydetmek için bitir'e tıklayın.

RIF dosyasını uygun analiz yazılımına yükleyin. RIF dosyasını veri analizi DAF dosyasına dönüştürün. İlk örnek dosyasını açın.

Brightfield kanalındaki görüntüleme yoğunluğu değişim hızının karekök ortalamasını grafiğe dökün. Ardından, antijen sunan hücre belirteci için en-boy oranını alana karşı grafiğe dökün. Tek bir antijen sunan hücre içeren dubletleri kapılayın.

T hücresi markörü için en-boy oranını alana karşı grafiğe dökün. Tek bir T hücresi içeren dubletleri kapılayın (gate). Birbirleriyle temas halindeki hücreleri belirlemek için analiz menüsü altındaki maskeler seçeneğini kullanarak maske yöneticisini açın ve yeni maskeyi T hücresi nesne maskesi olarak adlandırın.

İşlev düğmesine tıklayın ve diyalog kutusundan nesneyi seçin. T hücresi belirtecinin saptandığı kanalı seçip Tamam'a tıklayın. Benzer şekilde, uygun kanalda antijen sunan hücre belirteci için bir maske oluşturun. Antijen sunan hücre nesne maskesindeki T hücresi belirteci floresan yoğunluğunu, T hücresi nesne maskesindeki antijen sunan hücre floresan yoğunluğuna karşı grafiğe dökün.

Ardından, yalnızca birbirleriyle temas halindeki hücreleri kapsayan bir kapı (gate) çizin. Son olarak, bu kapı içindeki olayların phalloidin FITC görüntülerini, bu görüntüleri işaretlemek için etiketleme görüntüleri işlevini kullanarak manuel olarak inceleyin ve olgun immün sinapsları basit hücre-hücre temaslarından ayırt edin. Burada, transplantasyon sonrası yedi gün geçtikten sonra B6 kardiyak allogreftlerin tolerize edilmiş ve tolerize edilmemiş alıcılarından elde edilen ve B6 kemik iliği türevli dendritik hücrelerle birlikte inkübe edilen splenik CD4 pozitif T hücreleri için membran temas kapısı gösterilmiştir.

Yeşil artı işaretleri ile belirtilen sinaptik ve sinaptik olmayan olaylarla birlikte. Brightfield ve floresan kanal analizleri, bireysel sinaptik ve sinaptik olmayan olayların görselleştirilmesine de olanak tanır. Nitekim, B6 kalbi nakledilen tolerize edilmemiş ve tolerize edilmiş CDA alıcılarının sinapsları, T hücresi ile antijen sunan hücre arayüzündeki yoğun FITC pozitif sırtların varlığı sayesinde sinaptik olmayan temaslardan kolayca ayırt edilebilir.

Daha fazla geliştirilmesinin ardından, bu tekniğin klinik ortamlarda; örneğin, immünosupresyonun azaltılması veya kesilmesi ya da insan transplant alıcılarında greft sonucunun öngörülmesi gibi alanlarda uygulanabilmesi mümkün olabilir.