Name: Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Öğrenin görüntüleme akım sitometrisi kullanarak T hücresi alloreaktivitesini ölçme yöntemini. Bu teknik, bağışık sinaps oluşumunu inceleyerek transplantasyon immünolojisinde greft sonuçlarını tahmin etmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SCJ bir Uluslararası Kalp Derneği ve Akciğer Nakli Araştırma Bursu ve doktorlar hangi Royal College ve Fellowship.SM Seyahat Kanada Detweiler ait Cerrahlar tarafından desteklendi Kalp ve (SKB&#39;nin kadar) Akciğer Transplantasyonu Kariyer Geliştirme Ödülü için uluslararası bir Society tarafından kısmen desteklenmiştir. SS Sağlık Araştırma Oxford Biyomedikal Araştırma Centre.JH Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir bir Böbrek Araştırma UK Kıdemli Olmayan Klinik Bursu almıştır. Bir Wellcome Trust Programı Grant (082519Z07Z), bir İngiliz Kalp Vakfı Programı Grant (PG / 10 / 62,28504) ve AB Çerçeve Programı 7 (; BioDRIM BİR Çalışması): Bu çalışma AB ve kw aşağıdaki bağışları ile finanse edilmiştir. Yazarlar ImageStream Mark X aletle erişimi ve destek sağlamak için Michael Parsons ve Lunenfeld-Tanenbaum Araştırma Enstitüsü&#39;nde Sitometrisi Çekirdek Tesisi, Sina Sağlık Sistemi, Toronto teşekkür etmek istiyorum.

<ol><li>Cravedi, P., Heeger, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+monitoring+in+transplantation+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Immunologic monitoring in transplantation revisited.</a> Curr Opin Organ Transplant. 17 (1), 26-32 (2012).</li>
<li>Pearson, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assessment+of+transplantation+tolerance+induced+by+anti-CD4+monoclonal+antibody+in+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">The assessment of transplantation tolerance induced by anti-CD4 monoclonal antibody in the murine model.</a> Transplantation. 55 (2), 361-367 (1993).</li>
<li>Strober, S., Benike, C., Krishnaswamy, S., Engleman, E. G., Grumet, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+transplantation+tolerance+twelve+years+after+prospective+withdrawal+of+immunosuppressive+drugs%3A+studies+of+chimerism+and+anti-donor+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Clinical transplantation tolerance twelve years after prospective withdrawal of immunosuppressive drugs: studies of chimerism and anti-donor reactivity.</a> Transplantation. 69 (8), 1549-1554 (2000).</li>
<li>Fussell, S. T., Donnellan, M., Cooley, M. A., Farrell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+precursor+frequency+does+not+correlate+with+either+the+incidence+or+severity+of+graft-versus-host+disease+after+matched+unrelated+donor+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte precursor frequency does not correlate with either the incidence or severity of graft-versus-host disease after matched unrelated donor bone marrow transplantation.</a> Transplantation. 57 (5), 673-676 (1994).</li>
<li>Roelen, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+cytotoxic+alloreactivity+under+different+immunosuppressive+regimens+in+clinical+islet+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Relevance of cytotoxic alloreactivity under different immunosuppressive regimens in clinical islet cell transplantation.</a> Clin Exp Immunol. 156 (1), 141-148 (2009).</li>
<li>VanBuskirk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+allograft+acceptance+is+associated+with+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human allograft acceptance is associated with immune regulation.</a> J Clin Invest. 106 (1), 145-155 (2000).</li>
<li>Poggio, E. D., Clemente, M., Hricik, D. E., Heeger, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panel+of+reactive+T+cells+as+a+measurement+of+primed+cellular+alloimmunity+in+kidney+transplant+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Panel of reactive T cells as a measurement of primed cellular alloimmunity in kidney transplant candidates.</a> J Am Soc Nephrol. 17 (2), 564-572 (2006).</li>
<li>Zitzner, J. R., Tambur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ELISPOT+Assays+in+Risk+Assessment+Pre-+and+Post-Kidney+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Role of ELISPOT Assays in Risk Assessment Pre- and Post-Kidney Transplantation.</a> Cells. 1 (2), 100-110 (2012).</li>
<li>Newell, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+B+cell+signature+associated+with+renal+transplant+tolerance+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans.</a> J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).</li>
<li>Brouard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+peripheral+blood+transcriptional+biomarker+panel+associated+with+operational+renal+allograft+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a peripheral blood transcriptional biomarker panel associated with operational renal allograft tolerance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (39), 15448-15453 (2007).</li>
<li>Sagoo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+cross-platform+biomarker+signature+to+detect+renal+transplant+tolerance+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans.</a> J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).</li>
<li>Halloran, P. F., Famulski, K. S., Reeve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+assessment+of+disease+states+in+kidney+transplant+biopsy+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Molecular assessment of disease states in kidney transplant biopsy samples.</a> Nat Rev Nephrol. 12 (9), 534-548 (2016).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+common+blood+gene+signatures+for+the+diagnosis+of+renal+and+cardiac+acute+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of common blood gene signatures for the diagnosis of renal and cardiac acute allograft rejection.</a> PLoS One. 8 (12), e82153(2013).</li>
<li>Khatri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+rejection+module+%28CRM%29+for+acute+rejection+across+multiple+organs+identifies+novel+therapeutics+for+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A common rejection module (CRM) for acute rejection across multiple organs identifies novel therapeutics for organ transplantation.</a> J Exp Med. 210 (11), 2205-2221 (2013).</li>
<li>Halloran, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+diagnosis+of+antibody-mediated+rejection+in+kidney+transplant+biopsies%3A+an+international+prospective+study+%28INTERCOM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: an international prospective study (INTERCOM).</a> Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).</li>
<li>Mastoridis, S., Issa, F., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+biomarkers+and+functional+assays+to+monitor+cell-therapy-induced+tolerance+in+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Novel biomarkers and functional assays to monitor cell-therapy-induced tolerance in organ transplantation.</a> Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 64-71 (2015).</li>
<li>Miqueu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+peripheral+T-cell+repertoire+in+kidney+transplant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the peripheral T-cell repertoire in kidney transplant patients.</a> Eur J Immunol. 40 (11), 3280-3290 (2010).</li>
<li>Morris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+donor-reactive+T+cells%3A+Evidence+for+clonal+deletion+in+tolerant+kidney+transplant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Tracking donor-reactive T cells: Evidence for clonal deletion in tolerant kidney transplant patients.</a> Sci Transl Med. 7 (272), 272ra210(2015).</li>
<li>Dustin, M. L., Bromley, S. K., Kan, Z., Peterson, D. A., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+receptor+engagement+delivers+a+stop+signal+to+migrating+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Antigen receptor engagement delivers a stop signal to migrating T lymphocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (8), 3909-3913 (1997).</li>
<li>Goldsmith, M. A., Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+signal+transduction+by+the+antigen+receptor+without+commitment+to+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Early signal transduction by the antigen receptor without commitment to T cell activation.</a> Science. 240 (4855), 1029-1031 (1988).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+T+cell-dendritic+cell+interactions+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes.</a> Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).</li>
<li>Juvet, S. C., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+CD4%28%2B%29+T+Cell+Alloreactivity+and+Its+Control+by+Regulatory+T+Cells+Using+Time-Lapse+Microscopy+and+Immune+Synapse+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Quantification of CD4(+) T Cell Alloreactivity and Its Control by Regulatory T Cells Using Time-Lapse Microscopy and Immune Synapse Detection.</a> Am J Transplant. 16 (5), 1394-1407 (2016).</li>
<li>Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numbers+matter%3A+quantitative+and+dynamic+analysis+of+the+formation+of+an+immunological+synapse+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 347 (1-2), 79-86 (2009).</li>
<li>Burbach, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+regulation+of+integrin-dependent+T+cell+conjugate+formation+and+NF-kappa+B+activation+by+the+adapter+protein+ADAP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Distinct regulation of integrin-dependent T cell conjugate formation and NF-kappa B activation by the adapter protein ADAP.</a> J Immunol. 181 (7), 4840-4851 (2008).</li>
<li>Markey, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-dressing+by+donor+dendritic+cells+after+allogeneic+bone+marrow+transplantation+contributes+to+formation+of+the+immunological+synapse+and+maximizes+responses+to+indirectly+presented+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-dressing by donor dendritic cells after allogeneic bone marrow transplantation contributes to formation of the immunological synapse and maximizes responses to indirectly presented antigen.</a> J Immunol. 192 (11), 5426-5433 (2014).</li>
<li>Moreau, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).</li>
<li>Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InFlow+microscopy+of+human+leukocytes%3A+A+tool+for+quantitative+analysis+of+actin+rearrangements+in+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse.</a> J Immunol Methods. , (2015).</li>
<li>Ford, W. L., Simmonds, S. J., Atkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cellular+events+in+a+systemic+graft-vs.-host+reaction.+II.+Autoradiographic+estimates+of+the+frequency+of+donor+lymphocytes+which+respond+to+each+Ag-B-determined+antigenic+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Early cellular events in a systemic graft-vs.-host reaction. II. Autoradiographic estimates of the frequency of donor lymphocytes which respond to each Ag-B-determined antigenic complex.</a> J Exp Med. 141 (3), 681-696 (1975).</li>
<li>Macedo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+naive+and+memory+T-cell+populations+to+the+human+alloimmune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Contribution of naive and memory T-cell populations to the human alloimmune response.</a> Am J Transplant. 9 (9), 2057-2066 (2009).</li>
<li>Noorchashm, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+method+for+the+calculation+of+alloreactive+CD4%2B+T+cell+precursor+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A direct method for the calculation of alloreactive CD4+ T cell precursor frequency.</a> Transplantation. 67 (9), 1281-1284 (1999).</li>
<li>Suchin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+frequency+of+alloreactive+T+cells+in+vivo%3A+new+answers+to+an+old+question%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question.</a> J Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).</li>
<li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+recognition+of+allopeptides+promotes+the+development+of+cardiac+allograft+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Indirect recognition of allopeptides promotes the development of cardiac allograft vasculopathy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (6), 3276-3281 (2001).</li>
<li>Pickl, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+characteristics+of+dendritic+cells+generated+from+highly+purified+CD14%2B+peripheral+blood+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional characteristics of dendritic cells generated from highly purified CD14+ peripheral blood monocytes.</a> J Immunol. 157 (9), 3850-3859 (1996).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li>
<li>Francis, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+transplantation+tolerance+converts+potential+effector+T+cells+into+graft-protective+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of transplantation tolerance converts potential effector T cells into graft-protective regulatory T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (3), 726-738 (2011).</li>
<li>Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+induction+of+transplantation+tolerance+with+a+nondepleting+anti-Cd4+monoclonal+antibody+and+donor-specific+transfusion+before+transplantation.+A+critical+period+of+time+is+required+for+development+of+immunological+unresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness.</a> Transplantation. 61 (11), 1642-1647 (1996).</li>
<li>Faust, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+T+cell+TGFbeta+signaling+and+IL-17+in+allograft+acceptance+and+fibrosis+associated+with+chronic+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of T cell TGFbeta signaling and IL-17 in allograft acceptance and fibrosis associated with chronic rejection.</a> J Immunol. 183 (11), 7297-7306 (2009).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+CD4+Th17+cells+in+mediating+cardiac+allograft+rejection+and+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A novel role of CD4 Th17 cells in mediating cardiac allograft rejection and vasculopathy.</a> J Exp Med. 205 (13), 3133-3144 (2008).</li>
<li>Emerson, R. O., Mathew, J. M., Konieczna, I. M., Robins, H. S., Leventhal, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+alloreactive+T+cell+repertoire+using+high-throughput+sequencing+of+mixed+lymphocyte+reaction+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Defining the alloreactive T cell repertoire using high-throughput sequencing of mixed lymphocyte reaction culture.</a> PLoS One. 9 (11), e111943(2014).</li>
<li>Stanford, R. E., Ahmed, S., Hodson, M., Banner, N. R., Rose, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+indirect+allorecognition+in+lung+transplant+recipients+with+obliterative+bronchiolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">A role for indirect allorecognition in lung transplant recipients with obliterative bronchiolitis.</a> Am J Transplant. 3 (6), 736-742 (2003).</li>
<li>Benichou, G., Valujskikh, A., Heeger, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+direct+and+indirect+T+cell+alloreactivity+during+allograft+rejection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contributions of direct and indirect T cell alloreactivity during allograft rejection in mice.</a> J Immunol. 162 (1), 352-358 (1999).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+direct+and+indirect+recognition+pathways+to+T+cell+alloreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of direct and indirect recognition pathways to T cell alloreactivity.</a> J Exp Med. 177 (6), 1643-1650 (1993).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Görüntüleme akış sitometrisi monoklonal T hücreleri ve APC &#39;ler arasında veya süper antijenler 24, 25, 26, 27, 28 varlığı, immün sinaps oluşumunu göstermek için kullanılmıştır. Bu yöntem, verimli bir T hücre-APC temas ettikten sonra, T hücre teması 21 yerinde doğru polarize olarak, aktin hücre iskeleti yeniden düzenler olmasından yararlanır. Bu yeniden düzenlenme TCR sinyali olmaksızın oluşmaz, ve bu nedenle, T-hücresi aktivasyonu 19, 20, 21 erken bağıntısı olduğunu gösterdi. Burada sunulan yöntem poliklonal T hücre popülasyonlarında alloreaktif T-hücresi frekans ölçümü için bu yaklaşım adapte olur. Bunun gibi, gelecekte donör reactivi için tahliller gelişmesi için temel teşkil edebilir<html> Klinik naklinde Ty. doğrudan karşılaştırmalar henüz yapılmamış olmasına rağmen, alloreaktiftir bağışıklık sinapsların algılama geleneksel MLR&#39;den daha üstün öngörü gücüne sahip görünmektedir. Tolerans yukarıda tarif edilen protokol, örneğin, önceki eser göstermiştir, bir MLR sonuçları güvenilir bir aşı sonucu 2 ile ilişkili başarısız. Bu alloantijen yanıt olarak, efektör hücre fonksiyonu ölçmek her ne kadar bir çok deney, insan 9, 10, 11 işlevsel olarak dayanıklı durum için geliştirilmiştir. Bunun aksine, IFNy ELISPOT 8 ölçü efektör T-hücresi fonksiyonunu deneyleri, ancak, IL-17 38 gibi akut ve kronik allogreft reddi ile ilgili olabilir, sitokin salgılanması tam spektrum, yakalamak değildir,&gt; 39. Emek yoğun bir şekilde sınırlandırıcı bir sulandırma deney 4, ve fareler gerektirir trans-vivo deney, 6, klinik bir ortamda kendi uygulama engelleyecek önemli pratik sınırlamaları vardır. MLR&#39;de yanıt T hücrelerinin TCR dizi analizi kullanılarak çoğalan hücrelerin analizi son gelişmeler değer olabilir, fakat burada sunulan deney gibi, klinik çalışmalarda 18 40 ayrıca doğrulama gerektirecektir. Bağışıklık sinaps saptama deneyinin daha da geliştirilmesi önemli bir dizi soru cevap edilmesini gerektirecektir. İlk olarak, geliştirilmiş olarak tahlil sadece doğrudan alloreaktivitesini ölçer. doğrudan yol verici türetilmiş APC&#39;ler Allojenik MHC / peptid komplekslerinin tanıtımı içerir. ikincisi genellikle hızlı bir şekilde nakli sonrası elimine ve ayrıca alloantijeni sunum Carri olan edilirsağlam verici MHC (yarı doğrudan bir güzergahın) ortaya alıcı APC veya kendi MHC molekülleri (dolaylı yol) işlenmiş verici antijenleri tarafından ed. Dolaylı yol kronik allograft reddi 33, 41 arasında önemli bir sürücüdür. Prensip olarak, tahlil kullanılarak dolaylı bağışıklık sinaps tespit etmek mümkün olmalıdır, ancak dolaylı alloreaktiftir T hücreleri olayların daha çok sayıda analizi gerekecektir, yani direkt olanları 42, 43 çok daha düşük frekansa sahiptir. İkinci bir husus sadece CD8 + T hücreleri aynı zamanda anti-verici tepkisinin önemli bir bileşeni, oysa, CD4 + T hücreleri kullanılarak, bu tahlil test olmasıdır. Yine, yöntem kullanılarak CD8 + T hücre-APC sinaps tespit etmek mümkün olmalıdır. Başka bir sınırlama yöntemi nihai memb manuel inceleme ve hücre görüntülerinin analizini gerektirirrane iletişim kapısı ve şu anda bu adımın otomasyon üzerinde çalışıyoruz. Son olarak, bu yöntem, insan deneklerde test ve geliştirilmesini gerektirmektedir ve insan örnekleriyle ön çalışmalar halen yapılmaktadır. Transplant alıcılarında immün sinaps tespiti ile kombinasyon halinde daha fazla fenotipik T-hücresi alt tiplerinin (örneğin, efektör, bellek, düzenleyici, vs.) alloreaktif T-hücresi repertuarını karakterize etmek için güçlü bir yaklaşım ifade eder ve önemli bir odak noktası olacaktır gelecek iş.

Katı organ transplantasyonu, böbrek, karaciğer, kalp ve akciğerlerin son evre hastalık ile hastaların tedavisini dönüştürdü. immünosupresif ilaçların kullanıldığı takdirde büyük ve küçük doku uygunluk antijenleri de farklılıklara nedeniyle, ancak, allograftları derhal alıcı T hücreleri tarafından reddedilir. Bu ajanlar kanser ve organ işlev bozukluğu için riskler de dahil olmak üzere çok sayıda olumsuz etkilere sahiptir. Önemli bir klinik amaç alograft reddini önlediği için gereken minimum seviyeye immunsupresyonun dozunu düşürmek etmektir. Bu düzey, doğuştan gelen bağışıklık sistemi aktivasyonu derecesine bağlı olarak değişiklik gösterebilir olasıdır; alıcı ve verici arasındaki alloantijeni uyumsuzluğu derecesi; bağışıklık sistemi, farmakokinetik ve farmakodinamik ve hastalar arası farklar. Ne yazık ki, nakil klinisyenler doğru her bir hastada 1 verici reaktivitesini değerlendirmek için bir alet gerekmez. karışıklökosit reaksiyonu (MLR), verici reaktivitesi tespit edilebilmiştir, ancak güvenilir bir aşı sonucu 2, 3 tahmin başarısız olur. , Sınırlayıcı seyreltme testleri, sitokin ELISPORTS ve trans-vivo deney, ya yanıtların sınırlı olarak ölçülmesi veya işletme tolerans 9, 10, 11 ile ilgili 4, 5, 6, 7, 8 .Gene ifade profilleri ortaya koymuştur imzalar pratik değildir 12 ve ret 13, 14, 15, ancak bu her zaman popülasyonlar 16 boyunca genellenebilir değildir ve sonuç olarak, hastalarda sınırlı fayda olabilir. Sıra tabanlı analyMLR 18, kanda 17 ya da çoğalan T hücrelerinin, T-hücre reseptörü (TCR) ses de geliştirilmiştir ama daha fazla doğrulama gerektirmez. Kavramsal olarak, bir verici antijeni ile alıcı T-hücresi aktivasyonu erken gerekli adımları saptayan bir deney için istenebilecektir. eserleri tanıtabilirsiniz (MLR&#39;deki gibi) gün içinde hücrelerin kültürünün beri böyle bir test ideal olarak bu tür çoğalması veya efektör fonksiyonu olarak mansap olaylar ölçümünü gerektirir olmaz. Test sadece tanımlayıcı değerlendirmeler için, T-hücresi işlevinin bir elemanına bağlıdır için Aynı şekilde, ancak, aynı zamanda arzu edilir (Örneğin, TCR sekanslama) anerjik ve fonksiyonel T hücreleri arasında ayrım yapamaz olabilir. Çok sayıda çalışma, uzun süreli, T-APC temas önemli bir ilk bir immün sinaps oluşumu için gerekli olduğunu göstermiştirT-hücresi yanıtı 19, 20, 21, 22 devreye girer. Fare% 10 CD4 + T hücreleri allojenik kemik iliği türevli dendritik hücreleri (BMDC) 23 ile uzun süreli temas oluştururlar - Son zamanlarda in vitro zaman atlamalı görüntüleme, yaklaşık 5 dinamik sırasında bildirmiştir. Uzun süreli temas frekans farelerde daha önce aynı antijenlere karşı toleranslı hale getirilmiş ise, bir aşı reddedilen hayvanlarda artmıştır, bu untransplanted farelerde 23 görülen seviyelerde kalmıştır. Uzun süreli etkileşimleri alıcı Tregs varlığında indirgenir ve yokluğunda artan ve insan T hücrelerini ve alojenik monosit türevli DCler (MoDC&#39;ler) 23 kullanılarak benzer olguları gözlenmiştir. Bununla birlikte, uzun süreli kontakların numara sisteminin, bir poliklonal T hücre populatio içinde yapılann zaman alıcı ve emek yoğun olduğunu. Bu nedenle görüntülemenin kullanımı allojenik bağışıklık sinaps oluşumunu incelemek için akım sitometri yaptı. Görüntüleme akış sitometrisi sitometri floresan mikroskopi tek hücreli görüntüleme yetenekleri ile geleneksel akışının multiparametrik veri toplama ve analiz yeteneklerini de içeriyor. Bu teknik, tek klonlu T hücreleri 24, 26, 27 ya da süper antijenler 28 varlığında bağışıklık sinaps oluşumunu çalışmak için, diğer araştırmacılar tarafından kullanılmıştır. Alloreaktif T hücreleri genel olarak, toplam T hücre repertuarının 29, 30, 31, 32% 5-15 oluşturduğu tahmin edilmektedir, oysa Böyle durumlarda, ancak, tepki veren T hücreleri frekansı, 30-100% arasında değişmektedir. Önemli olan, biz görüntüleme akış sitometri av üretebilir olduğunu gösterdieri alloreaktif T-hücresi frekansı 23 ve bir poliklonal T hücre popülasyonu içinde sinaps frekansında değişiklikler aşı sonucu 23 belirtisi olduğu benzer ölçer. Şu anda, bu yaklaşım ilke olarak, CD4 + T hücrelerinin doğrudan alloreaktivitesini ölçmek için optimize edildi, ama, aynı zamanda CD8 + T hücreleri ve dolaylı yolu incelemek için geliştirilebilir. Dolaylı alloreaktivitesini Nakil sonrası 33 daha uzun zamanlarda kullanıcılar artan inanılmaktadır. Şu anda hastalarda test etmek için izin verecektir insan hücreleri, kullanmak için bu yöntemi geliştiriyorlar. Bu nedenle gelecekte, genel yaklaşım, nakilden önce transplant alıcılarında, T-hücre yanıtlarının fonksiyonel değerlendirme için yararlı olabilir; hemen nakli sonrası; ve uzun vadede, ne zaman ilaç minimizasyonu önemli bir hedeftir haline gelir.

<table><tbody><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su</td><td>Çeşitli</td><td>Değişir</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamentetraasetik asit, 0,5 M çözelti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 noniyonik deterjan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Beta-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>Çözeltisi %37 formaldehittir ve bu nedenle %1.5'lik çözelti için 25 kez seyreltilmelidir</td></tr><tr><td>Hücre süzgeçleri, 70 &mu; m gözenek boyutu</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-floresein izotiyosiyanat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5282</td><td></td></tr><tr><td>7-aminoaktinomisin D</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1310</td><td>DMSO'da Sulandırıldı</td></tr><tr><td>Allofikosiyanin konjuge anti-fare CD90.2</td><td>eBioscience</td><td>17-0902</td><td></td></tr><tr><td>Pasifik mavisi konjuge anti-fare CD11b</td><td>eBioscience</td><td>48-0112</td><td>Pasifik mavisi, eFluor 450 ile değiştirildi</td></tr><tr><td>Biyotinile fare karşıtı CD3</td><td>eBioscience</td><td>13-0032</td><td></td></tr><tr><td>Biyotinile anti-fare MHC sınıf II</td><td>eBioscience</td><td>13-5321</td><td></td></tr><tr><td>Biyotinile anti-fare B220</td><td>eBioscience</td><td>13-0452</td><td></td></tr><tr><td>Biyotinile anti-fare CD8</td><td>eBioscience</td><td>13-0081</td><td></td></tr><tr><td>Biyotinile anti-fare CD19</td><td>eBioscience</td><td>13-0193</td><td></td></tr><tr><td>Anti-biyotin mikroboncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>LS sütunları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS manyetik hücre ayırıcı</td><td>MIltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>rekombinant fare GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>rekombinant insan TGF ve beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>İnsan TGF ve beta; 1 fare hücreleri üzerinde aktiviteye sahiptir</td></tr><tr><td>Amnis ImageStream X Mark II</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>Görüntüleme akış sitometresi; ayrıntılar http://www.emdmillipore.com/ IDEAS Software'de mevcuttur.</td></tr> <tr><td></td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>Ücretsiz indirme (kayıt gereklidir): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20</td></tr><tr><td>Hücre kültürü ortamı&nbsp;</td><td>Çeşitli</td><td>Değişir</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Çeşitli</td><td>Değişir</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü plakaları</td><td>Çeşitli</td><td>Değişir</td><td></td></tr></tbody></table>

görüntüleme akım sitometri kullanımı t hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

transplant alıcılarında verici antijenleri bağışıklık reaktivitesi ölçümü başarılı azaltılması veya bağışıklık bastırma çekilmesi için önemli olması muhtemeldir. Karışık lökosit reaksiyonu (MLR), sınırlayıcı seyreltme testleri, ve trans-vivo gecikmeli tip hipersensitivite (DTH) deneyi bu soruya uygulanmıştır, ancak bu yöntemler öngörü yeteneği ve / veya bunların yararını azaltmak önemli pratik sınırlamalar sınırlıdır. Görüntüleme akış sitometrisi sitometri floresan mikroskopi görüntüleme yetenekleriyle akışının çok parametreli niceliksel güçlerini birleştiren bir tekniktir. Son zamanlarda verici antijen sunan hücreler (APC&#39;ler) ile olgun bir bağışıklık sinaps oluşturabilen alıcı T hücrelerinin oranını tanımlamak için bir görüntüleme akış sitometri yaklaşımın kullanımı. Iyi karakterize fare kalp transplant modelinde kullanarak, göstermiştir ki, T-APC Membr arasında, in vitro bağışıklık sinaps sıklığıane kontak olayları şiddetle allogreft reddi, hoşgörü içinde sonucunu ve nakli hayatta kalma kaynaklı düzenleyici T hücreleri bağlı olan bir durum öngördü. T-APC, kontakların frekans akut ret esnasında farelerde T hücreleri ile artarak alloantijen yanıtsız hale farelerinden alınan T hücreleri ile azalmıştır. In vitro sistemde düzenleyici T hücrelerinin eklenmesi uzun T-APC temas azaltmıştır. Kritik olarak, bu etki, aynı zamanda, doğal olarak insancıllaştırılmış bir fare modellerinde insan doku reddini kontrol etmek için bilinen regülatör T hücreleri, ortaya çıkan genleşmiş insan poliklonal görüldü. Bu yaklaşım daha da geliştirilmesi, transplant alıcılarında alloreaktif T hücre bölmesine daha derin bir karakterizasyonu için izin verebilir. Gelecekte, daha da geliştirilmesi ve insan hücreleri kullanılarak da bu yöntemin değerlendirme immünosupresyon minimize hastaları seçmek için kullanılan tahliller için bir temel oluşturabilir ve tolerojen etkisini ölçmek için kullanılabiliric klinikte terapiler.

Bu yöntem, heterotopik kalp alograft transplantasyon öncesi verici alloantijenlere karşı toleranslı hale getirilmiş farelerde CD4 + T-hücresi alloreaktivitesini araştırmak için kullanıldı. CBA fareleri (H-2k) (, H-2b, B6) bir-tüketici olmayan CD4 antikoru, bir ay ile bir araya kan nakli öncesinde B6 kalp nakli için bir verici-spesifik oluşan bir tolerans kuralı verildi. Foxp3 + regülatör T hücreleri 36, 37 bağlıdır, uzun vadeli alograft ömrünü Bu protokol ile sonuçlanır. Tolerize ve B6, kardiyak allogreftlerin tolerize olmamış alıcılar ve birlikte kuluçkaya Bu protokole göre B6, kemik iliğinden türetilmiş DCler ile olan post-transplant yedi gün, dalak CD4 + T hücreleri elde edildi. Şekil 2, bu deneyden elde edilen temsili verileri gösterir. Membran temas kapısı, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştirBir yeşil ince artı bir sinaptik olay üzerine yerleştirilen ile (Sol panel, 1) ve olmayan bir sinaptik olayı (sağ panel). Şekil 2B, bu etkinlik için aydınlık ve floresan kanallarını göstermektedir. Önyargı azaltmak için, veri işleme ataması 23 körleşmiş bir gözlemci tarafından analiz edildi. Her iki tolerize olmamış, Şekil 3&#39;te çeşitli örneklerde gösterildiği gibi (Şekil 3A-B) ve tolerize (Şekil 3C-D), B6 kalpler CBA alıcıları, sinaps T APC ara yüzeyinde yoğun bir FITC pozitif sırt varlığıyla olmayan, sinaptik temasların kolayca ayırt edilir. Bu sonuçlar, alıcı T hücreleri tarafından yapılan bağışıklık sinaps görsel saptama alıcısında alo-tepkiselliği derecesi ile izler göstermektedir. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig2.jpg" /> Membran T-APC ikilileri Şekil 2. Kimlikİletişim ve Bağışıklık Synapse oluşumu. Nihai çift kapı (Şekil 1F) olaylar analiz edilir. APC nesne maske A. T hücre markeri floresan DC nesne maske APC markör floresan karşı çizilmiştir. Bazı çiftler olaylar hücre-hücre temas olmadan bir APC, ve T hücresi varsa ve arsa sol alt köşesinde görüntülenir (resimler gösterilmemiştir). Bir membran temas kapısı bu yüzden T hücreleri ve APC &#39;ler temas halinde olduğu, yalnızca çiftleri içeren çizilebilir. bu kapının her olayın görüntüleri faloidin-FITC kanalında aktin hücre iskeleti yeniden düzenlenmesi kanıtı incelenir ve analiz yazılımı kullanılarak etiketlenebilir. Sol panel Sağ panel bağışıklık sinaps oluşumu olmadan bir membran temas etkinliği gösterir ise, bir immün sinaps olay (1 etiketli ve yeşil kursör ile gösterilir) gösterir (2 etiketli ve yeşil kursör ile gösterilir). sinaps oluşumu belirlenmesi Bunların manuel inceleme gerektirirgörüntü, B.B. gösterilen üst satır bir bağışıklık sinaps ile, ikili için aydınlık ve floresan kanal görüntülerini gösterir (A durumunda 1 karşılık gelir); alt sıra membran temas ama eksik sinaps oluşumu (A durumunda 2 tekabül eder) ile bir ikili gösterir. Veri işleme atama göre körleme olarak analiz edilmiş ve önceden yayınlanmış bir deneyde 23 içerikleri arasında. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55283/55283fig3.jpg" /> T-APC Sinaps formasyonunun Şekil 3. Örnek. CBA farenin (ya da herhangi bir ön-muamele (AB) &#39;den veya bir-tüketici olmayan anti-CD4 antikorunun örtüsü altında B6 tam kan ile tolerans sonra B6 vericilerden kardiyak allograftlar alınan <st<html> Rong&gt; CD). 7 gün sonra, dalak CD4 + T hücreleri, B6 DCler ile sinaps oluşumu için test edildi. C. olmayan bir tolerize edilmiş hayvandan membran temas olmayan sinaptik çifti üç örnek. B. olmayan bir tolerize edilmiş hayvandan bağışıklık sinaps üç örnek. C. tolerize edilmiş hayvandan membran temas olmayan sinaptik çifti üç örnek. D. tolerize edilmiş hayvandan bağışıklık sinaps üç örnek. Sinaps oluşumu, T-APC arabirimi (Ch03) parlak bir FITC pozitif sırt varlığı ile gösterilir. Veri işleme atama göre körleme olarak analiz edilmiş ve önceden yayınlanmış bir deneyde 23 içerikleri arasında. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> ays &quot;&gt; <tbody><tr><td> Antikor / Boya </td><td> florokrom </td><td> Kanal </td><td> konsantrasyon </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> eF450 </td><td> CH02 </td><td> 5 ug / mL, deneysel olarak titre </td></tr><tr><td> CD90.2 </td><td> APC </td><td> Ch06 </td><td> 5 ug / mL, deneysel olarak titre </td></tr><tr><td> Phalloidın </td><td> FITC </td><td> Ch03 </td><td> 0,05-0,5 ug / ml </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> - </td><td> Ch05 </td><td> 25 ug / ml </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Antikorlar ve bu Çalışmada Kullanılan Boyalar. Florokrom-eşlenik antikorlar, boyalar, tedarikçi ve tavsiye edilen konsantrasyonlarda tabloda sunulmaktadır. Her bir florokrom tespit etmek için kullanılan kanal sitometresi görüntüleme akışı da tabloda gösterilmiştir.

Bu kağıt sitometrisi görüntüleme akışı kullanarak T hücrelerinin karışık bir popülasyonda alloreaktivitesini ölçülmesi için bir yöntemi tarif etmektedir.

Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Bu prosedürün genel amacı, görüntüleme akış sitometrisi kullanarak T hücresi alloreaktivitesini ölçmektir. Bu yöntem, alıcının T hücrelerinin ne kadarının donör alloantijenlerine karşı reaktif olduğu gibi transplantasyon immünolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, akış sitometrisinin çok parametreli kantitatif gücünü, floresan mikroskobisinin görüntüleme yetenekleriyle birleştirerek, bireysel T hücresi antijen sunan hücre sinapslarının yüksek kapasiteli olarak incelenmesine olanak tanır.Prosedürü, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Sajad Moshkelgosha gösterecek. İşleme, 96 kuyucuklu bir hücre kültürü plakasının her kuyucuğuna 0,5 × 10⁶ dendritik hücre, ardından 1 × 10⁶ T hücresi ekleyerek ve kuyucuk başına toplam hacmi 50 µL kültür ortamı ile tamamlayarak başlayın.Soğuk kültürleri 37 °C'de ve %5 karbondioksit altında dört saat boyunca inkübe edin. Ardından, her kuyucuğa kültür hacminin üç katı kadar PBS içinde %1,5 formaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Fiksasyon işlemi sona erdiğinde, her kuyucuktaki hücreleri karşılık gelen 5 mL'lik polistiren tüplere aktarın.Hücreleri, ışıktan korunarak, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 100 µL yıkama tamponu içerisindeki uygun florokrom konjuge antikorlarla boyayın. Ardından, hücreleri 1 mL yıkama tamponu ile yıkayın ve pelletleri phalloidin FITC içeren perm/yıkama tamponu içerisinde yeniden süspanse edin. Işıktan korunarak oda sıcaklığında 30 dakika daha beklettikten sonra, hücreleri 1 mL taze perm/yıkama tamponu ile yıkayın.Peletleri, oda sıcaklığında, ışıktan korunarak 30 dakikalık son inkübasyon için perm/yıkama tamponu içindeki ilgili nükleer boyada yeniden süspande edin. Hücreleri bir mililitre perm/yıkama tamponu ile yıkayın ve ardından yalnızca yıkama tamponu ile bir kez daha yıkayın. Daha sonra, hücreleri 50 ila 100 µL taze yıkama tamponu içinde yeniden süspande edin.Hücreleri kapaklı küçük mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Hücreler arası etkileşimleri analiz etmek için, öncelikle parlak alan görüntüleme için bir kanal ayırın ve ilk kontrol tüpünü yükleyin. Parlak alan kanalı kapalıyken, çalışma alanı penceresinde, kullanılan her kanal için alan üzerinden en-boy oranıyla yeni bir dağılım grafiği oluşturun.En-boy oranının bire yakın olduğu singletleri kapılayın. Her florokrom için pozitif popülasyonu kontrol edin ve gerektiğinde aydınlatma kutusundaki lazer voltajını ayarlayın. Kanallar kutusunda, boyamada kullanılan florokromlar için uygun kanalları seçin.Ardından, kaydet (record) düğmesine tıklayın. Olay sayısı belirtilen eşiğe ulaştığında, veri toplama işlemi otomatik olarak duracaktır. Tüm tekli boyama kontrolleri toplandıktan sonra, ilk deneysel örnek tüpünü yükleyin ve parlak alan kanalı da dahil olmak üzere uygun analiz kanalları altında on binlerce olay toplayın.Bir kompanzasyon matrisi oluşturmak için, tekli boyama kontrol veri dosyalarını kompanzasyon sihirbazına yükleyin ve deney için uygun floresan kanalları seçin. Doğru pozitif popülasyonların seçildiğini onayladıktan sonra, matristeki bir değere çift tıklayın ve her kanal için grafiği analiz alanına ekleyin. Kompanzasyon matrisini bir CTM dosyası olarak kaydetmek için bitir'e tıklayın.RIF dosyasını uygun analiz yazılımına yükleyin. RIF dosyasını veri analizi DAF dosyasına dönüştürün. İlk örnek dosyasını açın.Brightfield kanalındaki görüntüleme yoğunluğu değişim hızının karekök ortalamasını grafiğe dökün. Ardından, antijen sunan hücre belirteci için en-boy oranını alana karşı grafiğe dökün. Tek bir antijen sunan hücre içeren dubletleri kapılayın.T hücresi markörü için en-boy oranını alana karşı grafiğe dökün. Tek bir T hücresi içeren dubletleri kapılayın (gate). Birbirleriyle temas halindeki hücreleri belirlemek için analiz menüsü altındaki maskeler seçeneğini kullanarak maske yöneticisini açın ve yeni maskeyi T hücresi nesne maskesi olarak adlandırın.İşlev düğmesine tıklayın ve diyalog kutusundan nesneyi seçin. T hücresi belirtecinin saptandığı kanalı seçip Tamam'a tıklayın. Benzer şekilde, uygun kanalda antijen sunan hücre belirteci için bir maske oluşturun. Antijen sunan hücre nesne maskesindeki T hücresi belirteci floresan yoğunluğunu, T hücresi nesne maskesindeki antijen sunan hücre floresan yoğunluğuna karşı grafiğe dökün.Ardından, yalnızca birbirleriyle temas halindeki hücreleri kapsayan bir kapı (gate) çizin. Son olarak, bu kapı içindeki olayların phalloidin FITC görüntülerini, bu görüntüleri işaretlemek için etiketleme görüntüleri işlevini kullanarak manuel olarak inceleyin ve olgun immün sinapsları basit hücre-hücre temaslarından ayırt edin. Burada, transplantasyon sonrası yedi gün geçtikten sonra B6 kardiyak allogreftlerin tolerize edilmiş ve tolerize edilmemiş alıcılarından elde edilen ve B6 kemik iliği türevli dendritik hücrelerle birlikte inkübe edilen splenik CD4 pozitif T hücreleri için membran temas kapısı gösterilmiştir.Yeşil artı işaretleri ile belirtilen sinaptik ve sinaptik olmayan olaylarla birlikte. Brightfield ve floresan kanal analizleri, bireysel sinaptik ve sinaptik olmayan olayların görselleştirilmesine de olanak tanır. Nitekim, B6 kalbi nakledilen tolerize edilmemiş ve tolerize edilmiş CDA alıcılarının sinapsları, T hücresi ile antijen sunan hücre arayüzündeki yoğun FITC pozitif sırtların varlığı sayesinde sinaptik olmayan temaslardan kolayca ayırt edilebilir.Daha fazla geliştirilmesinin ardından, bu tekniğin klinik ortamlarda; örneğin, immünosupresyonun azaltılması veya kesilmesi ya da insan transplant alıcılarında greft sonucunun öngörülmesi gibi alanlarda uygulanabilmesi mümkün olabilir.

measurement-of-t-cell-alloreactivity-using-imaging-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu yazıda, insan periferik kan mononükleer hücrelerinde alloantigen özel anerji ikna etmek için basit bir teknik anlatılmaktadır. Tekniği olmayan alloreactive donör hücreleri oluşturmak için klinik olarak uygulanabilir. İnfüzyon bu hücrelerin bağışıklık sulandırıldıktan geliştirmek ve allojeneik hematopoietik kök hücre transplantasyonu sonrası toksisite azaltabilir.

Co-uyarıcı Sinyal Abluka Alloantigen Uyarım İnsan periferik kan mononükleer hücreleri içinde Alloantigen özel anerji indüksiyonu

Bu video, immünolojik sinapsların oluşumuna yol açan alloantijen taşıyan dendritik hücrelerle etkileşimleri gözlemleyerek karışık T hücresi popülasyonlarında alloreaktiviteyi değerlendirmek için bir yöntem göstermektedir. Akış sitometrisi ile sinaps içeren çiftlerin diferansiyel boyanması ve miktar tayini, T hücresi alloreaktivitesini ortaya çıkarır.

Karışık Bir T Hücresi Popülasyonunda Alloreaktivitenin Ölçülmesi

Bu videoda, insan periferik kan mononükleer hücrelerinde (PBMC'ler) CD4+ ve CD8+ T hücrelerini, γδ T hücrelerini, B hücrelerini, doğal öldürücü (NK) hücreleri ve monositleri tanımlamak için iki florokrom kullanan akış sitometrisi tabanlı bir teknik gösterilmektedir. Hücrelerin yüzey belirteçlerine karşı florokrom konjuge antikorlarla inkübe edilmesinin ardından, hücre alt kümeleri optimal bir akış sitometrik geçit stratejisi kullanılarak tanımlanır.

Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinde İmmün Hücre Alt Kümelerini Tanımlamak için Bir Akış Sitometrisi Testi

Video, in vivo adjuvan kaynaklı sitotoksik T lenfosit veya CTL üretimini izlemek için immünolojik bir yöntemi göstermektedir. Bir fareye genetik olarak tasarlanmış, proliferatif boya lekeli donör CD8 + T lenfositleri önceden enjekte edilir. Ovalbüminin adjuvanlarla deri altı enjeksiyonu, hasat sonrası immün boyama ve akış sitometrisi yoluyla tanımlanan sitotoksik CD8 + T lenfositleri oluşturur.

Adjuvan Aracılı Sitotoksik T Lenfosit Oluşumunu İzlemek İçin İmmünolojik Bir Teknik

Bu protokol, hassas, hücre bazlı bir sitotoksisite testini tanımlar. Artan sayıda efektör CD8 + T hücresinin varlığında canlı hedef CD4 + T hücrelerinin frekansındaki azalmayı numaralandırarak, bu test antijene özgü CD8 + T hücrelerinin sitolitik aktivitesinin doğrudan değerlendirilmesine izin verir.

Sitotoksik Aktiviteyi Ölçmek için Hücre Bazlı Akış Sitometrisi Testi

Bu makale, tanımlanmış bir alloantijene spesifik olarak yanıt veren insan T hücresi klonlarının üretilmesi ve yayılması için bir yöntemi açıklar. Bu protokol, çeşitli peptit-MHC ligandlarına özgü insan T hücrelerinin klonlanması için uyarlanabilir.

Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

Bir hücre sedimantasyon manifoldu/slayt aparatı kullanarak yapışık olmayan bağışıklık hücrelerinin radyal hareketliliğini in vitro olarak izlemek için bir protokol açıklıyoruz. Hücre göçü, tümör hücrelerinin tek katmanlarında veya hücre dışı matriks proteinlerinde izlenir. Işık ve floresan mikroskobu ile inceleme, hücre hareketliliğinin ve sitotoksik işlevselliğin gözlemlenmesine izin verir.

Radyal Hareket ve retroviral replike olan bir vektör transduse, Yapışmayan Alloresponsive T lenfositlerinin sitotoksik işlev

Akış sitometri T hücreleri içinde kromatin durumunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu protokol, bilim adamları, floresan Histon H3 antikorların ortalama florasan yoğunluğu (MFI) bir artış gösterdiği, T hücresi aktivasyonu sırasında kromatin yoğunlaşması kanıt yorumlama sağlar...

Akış Sitometrinin Kullanımı T Hücrelerinde Kromatin Devleti değerlendirmek için

Burada, CD4 tanımlamak için bir akış sitometrik protokol mevcut+ ve CD8+ T hücreleri, γδ T hücreleri, B hücreler, NK hücreleri ve monosit yedi yerine sadece iki fluorochromes kullanarak insan periferik kan içinde. Bu yaklaşım ile beş ek işaretleri çoğu akışı cytometers üzerinde kaydedilir.

İki-fluorochrome tarafından yedi bağışıklık hücre alt kümeleri ayrımcılık Akış Sitometresi

T hücresi sinyalizasyonunun bir ölçüsü olan kalsiyum akışı, T hücresi reseptör stimülasyonuna verilen yanıtları analiz etmenin etkili bir yoludur. Hint-1'i hücre yüzey moleküllerine yönelik antikor panelleriyle çoklamak için kullanılan bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisinin son derece esnek yeteneklerinden yararlanır.

Primer Murin T-hücrelerinde T-hücresi Reseptörü Kaynaklı Kalsiyum Akışının Tam Spektrumlu Akış Sitometrisi ile Analizi

Mevcut protokol, önceden tedavi edilmiş tümör hücreleri ile allojenik bir ko-kültür sisteminde insan T hücresi stimülasyonunun ex vivo analizine izin veren deneysel bir iş akışını açıklamaktadır.

Önceden İşlem Görmüş Tümör Hücrelerinin Allojenik Ko-Kültür Ortamında İnsan T Hücresi Aktivitesinin Analizi

Öğrenin görüntüleme akım sitometrisi kullanarak T hücresi alloreaktivitesini ölçme yöntemini. Bu teknik, bağışık sinaps oluşumunu inceleyerek transplantasyon immünolojisinde greft sonuçlarını tahmin etmeye yardımcı olur.

Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

Daha fazla video keşfet