Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

Bu prosedürün genel amacı, görüntüleme akış sitometrisi kullanarak T hücresi alloreaktivitesini ölçmektir. Bu yöntem, bir alıcının T hücrelerinin ne kadarının donör alloantijenlerine reaktif olduğu gibi transplant immünolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, hücre sinapslarını sunan bireysel T hücresi antijeninin yüksek verimli incelemesine izin vermek için akış sitometrisinin multiparametrik kuanitatif güçlerini floresan mikroskobunun görüntüleme yetenekleriyle birleştirir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora sonrası olan Sajad Moshkelgosha olacak. Sıfır noktasını beş çarpı 10 ila altıncı dendritik hücrelere tohumlayarak başlayın. 96 oyuklu bir hücre kültürü plakasının her bir oyuğuna, ardından bir kez 10 ila altıncı T hücresine ve kuyu başına toplam 50 mikrolitreye kadar kültür ortamının nihai hacmine sahip bir hacim.

Soğuk kültürleri 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksitte dört saat inkübe edin. Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca her bir oyuğa PBS'de yüzde bir nokta beş formaldehitin kültür hacminin üç katını ekleyin. Fiksasyonun sonunda, hücreleri her bir oyuktan karşılık gelen beş mililitrelik bir polistiren tüpe aktarın.

Hücreleri, ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 100 mikrolitre yıkama tamponunda uygun florokrom konjuge antikorlarla boyayın. Daha sonra, hücreleri bir mililitre yıkama tamponunda yıkayın ve peletleri phalloidin FITC içeren perma / yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Işıktan korunan oda sıcaklığında 30 dakika daha sonra, hücreleri bir mililitre taze perma / yıkama tamponunda yıkayın.

Işıktan korunan oda sıcaklığında son 30 dakikalık bir inkübasyon için ilgilenilen nükleer boyadaki peletleri perma / yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri bir milimetre perma / yıkama tamponunda yıkayın, ardından yalnızca yıkama tamponunda bir yıkama yapın. Ardından, hücreleri 50 ila 100 mikrolitre taze yıkama tamponunda yeniden süspanse edin.

Hücreleri küçük kapaklı mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Hücreden hücreye etkileşimleri analiz etmek için, önce parlak alan görüntü elde etmek için bir kanal ayırın ve ilk kontrol tüpünü yükleyin. Parlak alan kanalı kapalıyken, çalışma alanı penceresinde, alan üzerindeki en boy oranıyla kullanılan her kanal için yeni bir dağılım grafiği oluşturun.

En boy oranının bire yakın olduğu yerlerde singlet'leri ingonize edin. Her florokrom için pozitif popülasyonu kontrol edin ve aydınlatma kutusundaki lazer voltajını gerektiği gibi ayarlayın. Kanallar kutusunda, boyamada kullanılan florokromlar için uygun kanalları seçin.

Ardından, kaydet'i tıklayın. Olay sayısı belirtilen eşiğe ulaştığında, alım otomatik olarak durdurulur. Tek leke kontrollerinin tümü elde edildikten sonra, ilk deneysel numune tüpünü yükleyin ve parlak alan kanalı da dahil olmak üzere uygun analiz kanalları altında on binlerce olay elde edin.

Bir kompanzasyon matrisi oluşturmak için, tek leke kontrol veri dosyalarını kompanzasyon sihirbazına yükleyin ve deney için uygun floresan kanallarını seçin. Doğru pozitif popülasyonların seçildiğini onayladıktan sonra, matriste bir değere çift tıklayın ve grafiği her kanal için analiz alanına ekleyin. Telafi matrisini bir CTM dosyası olarak kaydetmek için bitir'e tıklayın.

RIF dosyasını uygun analiz yazılımına yükleyin. RIF dosyasını bir veri analizi DAF dosyasına dönüştürün. İlk örnek dosyayı açın.

Parlak alan kanalındaki görüntüleme yoğunluğunun değişim oranının ortalama karekök karesini çizin. Ardından, antijen sunan hücre işaretleyicisinin alanına karşı en boy oranını çizin. Tek bir antijen sunan hücre içeren çiftleri girintileyin.

T hücresi işaretçisinin alanıyla karşılaştırıldığında en boy oranını çizin. Tek bir T hücresi içeren çiftler üzerine ingate. Birbiriyle temas halinde olan hücreleri tanımlamak için, analiz menüsü altında, maske yöneticisini açmak için maskeler seçeneğini kullanın ve yeni maskeyi T hücresi nesne maskesi olarak adlandırın.

İşlev düğmesini tıklatın ve iletişim kutusunda nesneyi seçin. T hücresi işaretçisinin algılandığı kanalı seçin ve Tamam'ı tıklatın. Antijen sunan hücre markörü için uygun kanalda aynı şekilde bir maske oluşturun. Antijen sunan hücre nesnesi maskesindeki T hücresi işaretleyici floresan yoğunluğunu, T hücresi nesne maskesindeki antijen sunan hücre floresan yoğunluğuna karşı çizin.

Ardından, yalnızca birbiriyle temas halinde olan hücreleri içeren bir kapı çizin. Son olarak, olgun bağışıklık sinapslarını basit hücreden hücreye temaslardan ayırt etmek için bu görüntüleri işaretlemek için görüntüleri etiketleme işlevini kullanarak bu kapıdaki olayların falloidin FITC görüntülerini manuel olarak inceleyin. Burada, transplantasyondan yedi gün sonra B6 kardiyak allogreftlerin tolere edilmiş ve tolere edilmemiş alıcılarından elde edilen ve gösterildiği gibi B6 kemik iliği türevi dendritik hücrelerle çakıştırılan splenik CD4 pozitif T hücreleri için membran temas kapısı gösterilmiştir.

Yeşil artı işaretleriyle gösterilen sinaptik ve sinaptik olmayan olaylarla. Brighfield ve floresan kanal analizleri, bireysel sinaptik ve sinaptik olmayan olayların görselleştirilmesine de izin verir. Gerçekten de, B6 kalplerinin hem tolere edilmemiş hem de tolere edilmiş CDA alıcılarından alınan sinapslar, T hücresi antijeni sunan hücre arayüzünde yoğun FITC pozitif çıkıntıların varlığı ile sinaptik olmayan temaslardan kolayca ayırt edilir.

Daha fazla gelişmeden sonra, bu teknik, immünosupresyonun azaltılması veya geri çekilmesi veya insan translpan alıcılarında greft sonucunun tahmin edilmesi gibi klinik ortamlarda uygulanabilir.