İzolasyon ve Roman Yüzey Etiket Kombinasyon ile tanımlanır Karaciğer progenitör Alt Grupları zenginleştirilmesi

Bu karaciğer sindirim protokolünün genel amaçları, akış sitometrisi ile çeşitli karaciğer progenitör alt kümelerini değerlendirmek ve daha sonraki analizler için yeni bir yüzey belirteç kokteyli kullanarak bu hücreleri yüksek saflıkta izole etmektir. Bu yöntem, örneğin progenitör hücrelerin alt kümesine özgü özelliklerinin neler olduğu ve karaciğer hasarı sırasındaki uzak nedenlerinin neler olduğu gibi, karaciğer progenitör hücrelerinin biyolojisi hakkındaki çeşitli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, in-vitro analizler için kritik önem taşıyan yüksek saflıkta ve canlılıkta progenitör hücrelerin izole edilmesine olanak sağlamasıdır.

Bu sindirim tekniği progenitör hücre biyolojisine dair bilgi sağlasa da, aslında hematopoetik ve endotelyal hücre popülasyonlarının izolasyonu için de kullanılabilir. Fare karaciğerinden tek hücreli bir preparat hazırlamak için, lobları kuru bir petri kabına aktarın ve dokuları yaklaşık iki milimetreküp boyutunda homojen küpler halinde kesmek için bir neşter kullanın. Parçaları, her biri 2,5 ml sindirim tamponu içeren, karaciğer başına iki adet 15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın.

Ardından örnekleri, 5 ve 10 dakikada bir hafifçe çalkalayarak 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. 15 dakikalık sindirimden sonra, karaciğer parçalarını nazikçe titrate etmek için ucu kesilmiş 1.000 µL'lik bir pipet kullanın. Daha sonra tüpleri banyoya geri koyun ve parçaların iki dakika boyunca çökelmesini bekleyin.

Ardından, süpernatanttan yaklaşık 700 µL'lik iki alikotu, 800 µL toplama tamponu ile önceden ıslatılmış 100 µm'lik bir süzgeçten geçirin. Çıkarılan süpernatantın yerine taze sindirim tamponu ekleyin. Karaciğer dokusu artık görünmediğinde, sindirim tüplerindeki tüm süpernatantı filtreden geçirin.

Ardından tüm hücreleri santrifüjasyonla toplayın. Pelletleri, oda sıcaklığında bir mililitre amonyum klorür potasyum lizis tamponu içinde yeniden süspande edin ve bir dakika sonra beş mililitre taze toplama tamponu ekleyerek lizisi durdurun. Hücreleri tekrar santrifüjasyonla toplayın.

Ardından, gevşek peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice aspire edin. Ve hücreleri buz üzerinde dört mililitre taze toplama tamponunda yeniden süspanse edin. Akış sitometrisi ile karaciğer örneği hücre sayılarını belirlemek için, öncelikle 20 µL karaciğer hücresi süspansiyonunu 1,5 mililitrelik bir polistiren tüp içerisinde 174 µL PBS ve altı mikrolitre propidyum iyodür ile karıştırın.

Hücre miktarının belirlenmesini sağlayan sayım boncuklarını ekleyin ve boncuk ile hücre karışımını akış sitometresine yükleyin. debris'den kaçınmak için ileri saçılma (forward-scatter) parametrelerine göre yan saçılma (side scatter) üzerinde kapılama yapın. İleri saçılma yüksekliği ile ileri saçılma alanı kapısı üzerinden dubletleri ve propidyum iyodür pozitif ölü hücreleri hariç tutun.

Ardından, akım sitometreye 30 µL örnek yükleyin ve olayları kaydedin. Progenitör alt kümelerinin akım sitometrik analizi için karaciğer hücrelerini boyamak amacıyla, hücrelerden 2x10^5'lik alikotları 1,5 mL'lik reaksiyon tüplerine aktarın. ve hücreleri santrifüj ile pellete getirin.

Pelletleri, buz üzerinde beş dakikalık inkübasyon için Fc blok içinde yeniden süspanse edin. Ardından, ışıktan korunarak buz üzerinde 20 dakikalık inkübasyon için ilgili tüplere 50 microliters ilgili hücre yüzeyi boyama antikor kokteyli ekleyin. İnkübasyon sonunda, örnekleri örnek başına 400 microliters boyama tamponu ile yıkayın.

Ardından, peletleri ışıktan korunmuş şekilde buz üzerinde 20 dakika boyunca 100 µL uygun sekonder antikor kokteylinde yeniden süspanse edin. Sonra hücreleri 400 µL daha boyama tamponu ile yıkayın. Ve peletleri propidyum iyodür içeren 300 µL boyama tamponunda yeniden süspanse edin.

Örneği bir akış sitometresi kullanarak ölçün. Manyetik mikroboncuk tabanlı ayırma yoluyla progenitor hücre popülasyonunu zenginleştirmek için, 1,5-2x10^6 hücreyi uygun sayıda 15 mililitrelik konik tüpe aktarın ve hücreleri santrifüjle toplayın. Pelletleri, BSA ile desteklenmiş 400 mikrolitre HBSS içinde yeniden süspande edin.

Ardından, 4 °C'de 15 dakika inkübasyon için 40 µL anti-CD31 Microbeads ve 30 µL anti-CD45 Microbeads ekleyin. Daha sonra hücreleri 5 mL BSA eklenmiş HBSS ile yıkayın. Pelletleri, oda sıcaklığında 15 dakika inkübasyon için 100 µL ölü hücre uzaklaştırma boncukları (dead cell removal beads) içinde yeniden süspande edin.

Hücreler inkübe olurken, her bir karaciğer için uygun boyutta bir pozitif seçilim kolonunu üç mililitre HBSS artı BSA ile dengeleyin. Ardından hücrelere 900 µL HBSS artı BSA ekleyin ve hücreleri 100 mikronluk bir poliamid filtre süzgecinden geçirin. Filtrelenmiş, boncukla inkübe edilmiş hücreleri kolonlara yükleyin ve elüatı santrifüj tüpüne toplayın.

Tüm hücreler kolondan geçtikten sonra, kolonları üçer mililitre BSA eklenmiş HBSS ile üç kez yıkayın. Hücreleri santrifüjle çöktürün ve hücre peletini 100 microliters durulama tamponu ve Fc blok içerisinde yeniden süspanse edin. Dört ila altı karaciğerden gelen hücre peletlerini veya 1x10^6'dan daha az negatif seçimli hücreyi toplayın.

Beş dakika sonra, hücreleri buz üzerinde 10 dakika boyunca biotinillenmiş anti-GP38 antikor ile işaretleyin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri 400 µL durulama tamponu ve 5 µL Anti-Biotin Microbeads içinde yeniden süspande etmek üzere santrifüj ile toplayın. 4 °C'de 15 dakika bekledikten sonra, hücreleri derhal 5 mL durulama tamponu ile yıkayın.

Ve peleti bir mililitre taze durulama tamponunda yeniden süspande edin. Yeniden süspande edilen hücreleri soğutulmuş bir 15'li rafa yerleştirin ve otomatik manyetik ayrıştırmayı başlatın. Ardından, akış yoluyla ayrılan kısmı santrifüjleyin ve peletleri planlanan sonraki deneysel analizler için uygun çözeltide yeniden süspande edin.

CD45, CD31 ve asialoglikoprotein bir reseptörü için negatif olan hücreler üzerinde yapılan kapılama (gating), daha sonra glikoprotein 38 ve CD133 ekspresyonlarına göre gruplandırılabilecek olan karaciğer progenitör hücrelerini seçer. gp38 pozitif CD133 pozitif ve gp38 negatif CD133 pozitif hücreler, sağlıklı yetişkin fare karaciğerindeki CD45 negatif CD31 negatif ASGPR1 negatif hücreler arasında en bol bulunan hücre popülasyonlarını temsil eder ve daha önce progenitör hücrelerle ilişkilendirilmiş çeşitli yüzey markerlarının ekspresyonlarında belirgin farklılıklar gösterirler. Az önce gösterildiği gibi, bu progenitör hücrelerin manyetik mikroboncuk tabanlı izolasyonu, yüksek canlılık derecesine sahip karaciğer hücrelerinde %90'ın üzerinde bir saflık sağlar.

Bu nadir hücreleri izole etmeye çalışırken, karaciğer sindirim basamaklarında kullanılan enzimlerin dikkate alınması önemlidir; çünkü farklı enzimler belirli öncül alt popülasyonları öncelikli olarak sağlayabilir ve CD133 ekspresyon seviyelerini önemli ölçüde azaltabilir. Hücre saflığının ve verimin, karaciğer tek hücre süspansiyonlarının nazikçe hazırlanmasına bağlı olduğunu unutmamak gerekir. Ayrıca, yüksek miktardaki hücresel debris ve ölen hücre kontaminasyonunun, bu protokolün başarısını olumsuz etkileyebileceği unutulmamalıdır.