Hücre Göç Çalışmaları altında Dik Kimya ve Oksijen Gradyanların için polidimetilsiloksan-polikarbonat mikroakışkan Cihazlar

Bu deneyin genel amacı, çeşitli dik kimyasal ve oksijen gradyan kombinasyonları altında memeli hücre göçünü incelemek için bir polidimetilsiloksan-polikarbonat mikroakışkan cihaz kurmaktır. Bu yöntem, bu gradyanların farklı hücre tiplerinin veya farklı genlere sahip hücrelerin göçü üzerindeki etkileri dahil olmak üzere, memeli hücre göçü çalışmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tüm deneysel düzeneğin, zahmetli kurulumlar ve hantal cihazlar gerektirmeden, optimal hücre kültürü koşulları için standart bir inkübatörde gerçekleştirilebilmesidir.

Hücre hareketliliği ve fizyolojik olarak ilişkili çeşitli gradyanların mikroakışkan cihaz kullanılarak karakterize edilebilmesi nedeniyle, bu tekniğin etkileri kanser hücresi metastaz kapasitesinin teşhisine kadar uzanmaktadır. Bu yöntem, memeli hücre göçü hakkında bilgiler sağlayabilir. Ayrıca, ilaç konsantrasyonları ve oksijen tansiyonu kombinasyonları üzerindeki in vitro hücre tabanlı ilaç testleri gibi diğer hücre çalışmalarına da uygulanabilir.

İnce bir PDMS tabakası oluşturmak için, iki gram polidimetilsiloksan veya PDMS ön-polimerini, üst katman akışkan kanal desenlerinin bulunduğu kalıba aktarın. Ardından, PDMS'teki gazları gidermek için kalıbı 60 dakika boyunca bir desikatör düzeneğine yerleştirin. Gaz giderme işleminden sonra, PDMS kürlenmesi için kalıbı gece boyunca 60 derece Celsius sıcaklıktaki bir fırında bekletin.

Kalıbın yatay bir düzlemde olduğundan emin olun. Kalıbı oda sıcaklığına kadar soğuttuktan sonra, kalıbın üzerine ek olarak 13 gram PDMS ön-polimer dökün ve ardından PDMS'yi desikatör düzeneğinde 60 dakika boyunca vakumlayın. Gaz difüzyon bariyeri olarak, bir milimetre kalınlığındaki bir polikarbonat veya PC filmi taze PDMS tabakasının içine yavaşça yerleştirin.

Mevcut tüm hava kabarcıklarını dışarı atın. Ardından, kalıbı gece boyunca 60 °C'lik fırında bekletin. Kalıbın yatay bir düzlemde olduğundan emin olun.

Kürlenmiş PDMS oda sıcaklığına soğuduktan sonra, tüm kanal desenlerini kapsayacak şekilde cihazı bir bistüri ile yaklaşık 5,5 çarpı beş santimetrekarelik bir alana kesin. Ardından, PDMS tabakasını kalıptan soyun. Son olarak, iki milimetre çapında bir biyopsi punch'ı kullanarak giriş ve çıkış deliklerini açın.

Hazırlanan üst PDMS-PC katmanını, daha sonraki montaj işlemi için ortam tozundan uzak bir yerde saklayın. Cihazı monte etmek için, öncelikle hazırlanan PDMS-PC üst katmanını ve spin-kaplı PDMS membran içeren wafer'ı, yapışma yüzeyleri yukarı bakacak şekilde bir oksijen plazma yüzey işlem makinesine yerleştirin. PDMS yüzeylerine 40 saniye boyunca 90 watt oksijen plazması uygulayın.

Oksijen plazma yüzey işleminin hemen ardından üst katmanı PDMS membranına yapıştırın. Bağlanmayı desteklemek için yapıştırılan katmanların üzerine bir ağırlık yerleştirin ve bir gece boyunca 60 °C'lik fırında bekletin. Yapıştırılan katmanlar oda sıcaklığına soğuduğunda, üst katmana yapışık olan membranı bir bisturi ile yaklaşık 5,5 x 5 cm² boyutunda bir alan olacak şekilde kesin.

Bondlu yapıyı silikon gofretten soyun ve iki milimetre çapında bir biyopsi punch'ı kullanarak kimyasal gradyan kanalının giriş ve çıkışlarına delikler açın. Ardından, membran bondlu üst katmanı ve hazırlanmış PDMS alt katmanı, bondlanacak yüzeyler yukarı bakacak şekilde oksijen plazma yüzey işlem makinesine yerleştirin. PDMS yüzeylerini aktive etmek için plazmayı 90 watt gücünde 40 saniye boyunca uygulayın.

Yüzey işleminin hemen ardından, yapıştırma için üst ve alt katmanları birbirine tutturun. Ağırlığı yapıştırılan cihazın tamamının üzerine yerleştirin ve 60 °C'lik bir fırında gece boyunca bekletin. Ertesi gün, üretilen cihazın tamamını fırından çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğutun.

Mikroakışkan hücre migrasyon deneyi, metin protokolünde açıklandığı şekilde hücrelerin cihazda hazırlanmasıyla başlatılır. İkinci günde, sıfırıncı günden itibaren kültüre edilen hücrelerin ortamı aspire edin ve hücreleri iki kez beş mililitre DPBS ile yıkayın. DPBS'yi aspire edin ve iki mililitre Trypsin-EDTA ekleyin, ardından hücrelerin flask yüzeyinden ayrılması için hücreleri inkübatörde beş dakika inkübe edin.

Hücreler ayrılıp çözelti içinde süspansiyona getirildikten sonra, flaska sekiz mililitre serumsuz ortam ekleyin. Tüm sıvıları 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 140 ×g'de santrifüj edin. Santrifüj işleminin ardından süpernatanı aspire edin ve mililitre başına bir milyon hücrelik bir nihai hücre yoğunluğu için uygun miktarda serumsuz ortam ekleyin.

Ardından, metin protokolünde açıklandığı üzere birinci gün hazırlanan mikroakışkan cihazı çıkarın. Serumsuz ortamı, kimyasal gradyan kanalının çıkışından, ortam her iki giriş iğnesinden de dışarı akana kadar enjekte etmek için küt uçlu 14 gauge iğneye sahip bir mililitrelik şırınga kullanın. Daha sonra, kimyasal gradyan kanalının çıkışından 200 µL hücre süspansiyonu enjekte edin.

Hücrelerin mikroakışkan kanala giriş yaptığını onaylamak için cihazdaki hücre kültürü odasını bir mikroskop altında gözlemleyin. Ardından, hücrelerin cihaz yüzeyine yapışmasını teşvik etmek için cihazı nemli bir kaba yerleştirin ve beş saat boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe bekletin. Bu sırada, istenen konsantrasyondaki kimyasalı serumsuz besiyerinde hazırlayın.

Kimyasal içeren ve içermeyen serumsuz medyumu, yüksek saflıkta tüplere bağlı iki ayrı üç mililitrelik şırıngaya çekin. Ardından, şırıngaları daha sonra kullanmak üzere dakikada bir mikrolitre akış hızına sahip bir şırınga pompasına yerleştirin. Sonrasında, 15 mililitre bir molar sodyum hidroksit çözeltisi ve 15 mililitre 200 miligram/mililitre pirogallol çözeltisi hazırlayın.

Sodyum hidroksit çözeltisini, yüksek saflıkta PFTE tübe bağlı 15 mililitrelik bir şırıngaya ve pirogallol çözeltisini, yüksek saflıkta bir tübe bağlı 15 mililitrelik bir şırıngaya çekin. Şırıngaları, daha sonra kullanılmak üzere, dakikada beş mikrolitre akış hızına sahip bir şırınga pompasına yerleştirin. Beş saatlik inkübasyonun ardından, cihazın tamamını çıkarın ve 15 santimetre çapında bir Petri kabına yerleştirin.

Cihazı yapışkan macun kullanarak Petri kabına sabitleyin, ardından Petri kabını bir inkübatör içindeki canlı hücre görüntüleme mikroskobuna aktarın. Kimyasal gradyan oluşturmak için şırıngalardan gelen tüpleri kimyasal gradyan kanalının girişlerine bağlayın. Daha sonra çıkışı, atık rezervuarına giden tübe bağlayın.

Kimyasal gradyan oluşumu için kullanılan şırıngaların bulunduğu şırınga pompasını açın. Ardından, sodyum klorür ve pirogallol içeren şırıngalardan gelen yüksek saflıktaki tüpleri oksijen gradyan kanalının girişlerine bağlayın. Atıkları toplamak için tüpü çıkışa bağlayın ve oksijen gradyanı oluşturmak için kullanılan şırıngaların bulunduğu şırınga pompasını açın.

Cihazın nemli kalmasını sağlamak için Petri kabına yaklaşık 15 mililitre çift distile su ekleyin. Ardından, canlı hücre görüntüleme mikroskobunu zaman ayarlı görüntü yakalama için ayarlayın ve her 15 dakikada bir görüntü alın. Veri toplama, analiz ve gradyanların karakterizasyonunu metin protokolünde açıklandığı şekilde gerçekleştirin.

Burada, hücre migrasyonu için mikroakışkan cihaz içerisinde oluşturulan kimyasal gradyanların temsilci sonuçları gösterilmiştir. Sayısal simülasyon sonucu, kimyasal olarak floresein çözeltisinin kullanıldığı deneysel karakterizasyon ile iyi bir uyum göstermektedir. Kemokin SDF-1 alpha gibi diğer kimyasalların gradyanları da simülasyon kullanılarak önceden tahmin edilebilir.

Cihaz içerisinde oluşturulan oksijen gradyanları, oksijene duyarlı floresan boya kullanılarak deneysel olarak karakterize edilebilir. Tipik olarak, cihaz içerisinde akış yönünün başında %1'den sonunda %16'ya kadar değişen oksijen gradyanları kararlı bir şekilde oluşturulabilir. Burada, canlı hücre görüntüleme mikroskobu kullanılarak deneyler sırasında toplanan tipik zaman ayarlı görüntüler gösterilmektedir.

Görüntü analizinden sonra, A549 hücrelerinin göç yörüngeleri ve ortalama hareketleri hesaplanabilir. Gradyan bulunmadığında, hücreler rastgele göç gösterir ve ortalama hareket sıfıra yakındır. Sadece bir SDF-1 alfa kemokin gradyanı olduğunda, hücreler kemotaktik davranış sergiler ve beklendiği üzere yüksek kemokin gradyanı yönüne doğru göç eder.

Sadece bir oksijen gradyanı olduğunda, hücreler düşük oksijen yönüne doğru hareket ederek, memeli hücreler için üzerinde yeterince çalışılmamış olan aerotaktik bir davranış sergilerler. İlginç bir şekilde, hem kemokin hem de oksijen gradyanlarının varlığında, hücrelerin düşük oksijen gradyanına doğru hareket etmesi, oksijen gradyanının baskın etkilere sahip olduğunu göstermektedir. Bu gözlem, daha detaylı çalışmalar gerektirmektedir.

Bu prosedürü uygularken, fabrikasyon sırasında cihazın düzeyiyle iyi bir şekilde ayarlandığını hatırlamak ve hücre göçü deneyi sırasında mikroakışkan cihaz kurulumundaki hava kabarcıklarını gidermek önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, PDMS-PC mikroakışkan cihazının nasıl hazırlanacağı ve kimyasal ve oksijen gradyanlarının kombinasyonları altında memeli hücre göçünü incelemek için deneylerin nasıl kurulacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.