Hücre Göç Çalışmaları altında Dik Kimya ve Oksijen Gradyanların için polidimetilsiloksan-polikarbonat mikroakışkan Cihazlar

Bu deneyin genel amacı, dik kimyasal ve oksijen gradyanlarının çeşitli kombinasyonları altında memeli hücre göçüne bir polidimetilsiloksan-polikarbonat mikroakışkan cihaz kurmaktır. Bu yöntem, bu gradyanların farklı hücre türlerinin veya ote genlerine sahip hücrelerin göçü üzerindeki etkileri de dahil olmak üzere memeli hücre göçü çalışmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, tüm deney düzeneğinin, sıkıcı kurulum ve hantal enstrümantasyon olmadan optimal hücre kültürü koşulları için geleneksel bir inkübatörde yürütülebilmesidir.

Bu tekniğin etkileri, hücre motilitesi ve fizyolojik olarak ilişkili çeşitli gradyanlar mikroakışkan cihaz kullanılarak karakterize edilebildiğinden, kanser hücresi metastaz yeteneğinin teşhisine doğru genişletilmiştir. Bu yöntem, memeli hücre göçü hakkında bilgi sağlayabilir. İlaç konsantrasyonları ve oksijen gerilimlerinin kombinasyonları üzerinde in vitro hücre bazlı ilaç testi gibi diğer hücre çalışmalarına da uygulanabilir.

İnce bir PDMS tabakası oluşturmak için iki gram polidimetilsiloksan veya PDMS pre-polimerini üst tabaka akışkan kanal desenleri ile kalıba aktarın. Ardından, PDMS'yi 60 dakika boyunca gazdan arındırmak için kalıbı bir kurutucu kurulumuna yerleştirin. Gazdan arındırma işleminden sonra, PDMS kürlemesi için kalıbı gece boyunca 60 derecelik bir fırına koyun.

Kalıbın yatay bir düzlemde olduğundan emin olun. Kalıbı oda sıcaklığına soğuttuktan sonra, kalıba 13 gram daha PDMS pre-polimer dökün, ardından kurutucu kurulumunda PDMS'yi 60 dakika boyunca gazdan arındırın. Bir milimetre kalınlığında bir polikarbonat veya PC filmi, gaz difüzyon bariyeri olarak yeni PDMS katmanına yavaşça gömün.

Mevcut olan baloncukları dışarı atın. Ardından kalıbı gece boyunca 60 derecelik fırına koyun. Kalıbın yatay bir düzlemde olduğundan emin olun.

Kürlenmiş PDMS'yi oda sıcaklığına soğuttuktan sonra, cihazı bir neşter ile tüm kanal desenlerini kaplayabilecek yaklaşık 5,5 x beş santimetre karelik bir alana kesin. Ardından, PDMS laboratuvarını kalıptan çıkarın. Ardından, iki milimetre çapında bir biyopsi zımbası kullanarak girişler ve çıkışlar için delikler açın.

Fabrikasyon üst PDMS-PC katmanını daha sonra montaj için ortam tozundan uzakta saklayın. Cihazı monte etmek için, önce fabrikasyon PDMS-PC üst katmanını ve spin kodlu PDMS membranlı gofreti, yapıştırma yüzeyleri yukarı bakacak şekilde bir oksijen-plazma yüzey işleme makinesine yerleştirin. PDMS yüzeylerine 40 saniye boyunca 90 watt oksijen plazması uygulayın.

Oksijen plazma yüzey işleminden hemen sonra üst tabakayı PDMS membranına yapıştırın. Yapıştırılmış katmanların üstüne bir ağırlık koyun ve yapışmayı teşvik etmek için gece boyunca 60 derecelik bir fırına koyun. Yapıştırılan katmanlar oda sıcaklığına soğuduktan sonra, üst katmana yapıştırılan zarı bir neşter ile yaklaşık 5,5 x beş santimetre karelik bir alana kesin.

Bağlı yapıyı silikon gofretten çıkarın ve iki milimetre çapında bir biyopsi zımbası kullanarak kimyasal gradyan kanalının giriş ve çıkışlarında delikler açın. Ardından, membran bağlı üst katmanı ve fabrikasyon PDMS alt katmanını, yapıştırma yüzeyleri yukarı bakacak şekilde oksijen plazma yüzey işleme makinesine yerleştirin. PDMS yüzeylerini etkinleştirmek için plazmayı 40 saniye boyunca 90 watt'ta kullanın.

Yüzey işleminden hemen sonra yapıştırmak için üst ve alt katmanları birbirine yapıştırın. Ağırlığı tüm yapıştırılmış cihazın üzerine yerleştirin ve gece boyunca 60 derecelik bir fırında bırakın. Ertesi gün, fabrikasyon cihazın tamamını fırından çıkarın ve oda sıcaklığına soğutun.

Metin protokolünde açıklandığı gibi cihazdaki hücrelerin hazırlanmasıyla mikroakışkan hücre göçü testine başlayın. İkinci günde, sıfırıncı günden beri kültürlenen hücrelerden ortamı aspire edin ve hücreleri iki kez beş mililitre DPBS ile yıkayın. DPBS'yi aspire edin ve iki mililitre Tripsin-EDTA ekleyin, ardından hücreleri şişe yüzeyinden ayırmak için hücreleri inkübatörde beş dakika inkübe edin.

Hücreler ayrıldıktan ve çözelti içinde süspanse edildikten sonra, şişeye sekiz mililitre serumsuz ortam ekleyin. Tüm sıvıları 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 140 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı aspire edin ve mililitre başına bir milyon hücrelik bir nihai hücre yoğunluğu için uygun miktarda serumsuz ortam ekleyin.

Ardından, metin protokolünde anlatıldığı gibi birinci gün hazırlanan mikroakışkan cihazı çıkarın. Serum içermeyen ortamı, ortam girişlerdeki her iki iğneden dışarı akana kadar kimyasal gradyan kanalının çıkışından enjekte etmek için künt 14 gauge iğneli bir mililitrelik şırınga kullanın. Ardından, kimyasal gradyan kanalının çıkışından 200 mikrolitre hücre süspansiyonu enjekte edin.

Hücrelerin mikroakışkan kanala sokulduğunu doğrulamak için cihazdaki hücre kültürü odasını mikroskop altında gözlemleyin. Ardından, cihazı nemli bir kaba koyun ve hücrelerin cihaz yüzeyine yapışmasını sağlamak için beş saat boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe tutun. Bu arada kimyasalı serumsuz ortamda istenilen konsantrasyonda hazırlayın.

Serumsuz ortamı, kimyasal içeren ve içermeyen serumsuz, yüksek saflıkta tüpe bağlı iki ayrı üç mililitrelik şırıngaya çekin. Ardından, şırıngaları daha sonra kullanmak üzere dakikada bir mikrolitre akış hızına sahip bir şırınga pompasına yerleştirin. Daha sonra, 15 mililitre bir molar sodyum hidroksit çözeltisi ve mililitre pirogallol çözeltisi başına 15 mililitre 200 miligram yapın.

Sodyum hidroksit çözeltisini yüksek saflıkta bir PFTE borusuna bağlı 15 mililitrelik bir şırıngaya çekin ve pirogallol çözeltisini yüksek saflıkta bir boruya bağlı 15 mililitrelik bir şırıngaya çekin. Şırıngaları daha sonra kullanmak üzere dakikada beş mikrolitre akış hızına sahip bir şırınga pompasına yerleştirin. Beş saatlik inkübasyondan sonra, tüm cihazı çıkarın ve 15 santimetre çapında bir Petri kabına yerleştirin.

Cihazı yapışkan macun kullanarak Petri kabına sabitleyin, ardından Petri kabını bir inkübatördeki canlı hücre görüntüleme mikroskobuna aktarın. Kimyasal gradyanın oluşturulması için boruyu şırıngalardan gelen kimyasal gradyan kanalının girişlerine bağlayın. Ardından, çıkışı bir atık rezervuarına giden boruya bağlayın.

Kimyasal gradyan üretimi için şırınga pompasını şırıngalarla birlikte açın. Ardından, sodyum klorür ve pirogallol içeren şırıngalardan gelen yüksek saflıkta boruyu oksijen gradyan kanalının girişlerine bağlayın. Atıkları toplamak için hortumu prize bağlayın ve oksijen gradyanı üretimi için şırınga pompasını şırıngalarla birlikte açın.

Cihazı nemli tutmak için Petri kabına yaklaşık 15 mililitre çift damıtılmış su ekleyin. Ardından, canlı hücre görüntüleme mikroskobunu hızlandırılmış görüntü yakalama için ayarlayın ve her 15 dakikada bir görüntü alın. Metin protokolünde açıklandığı gibi veri toplama ve analizinin yanı sıra gradyanların karakterizasyonunu gerçekleştirin.

Burada gösterilenler, hücre göçü için mikroakışkan cihaz içinde üretilen kimyasal gradyanların temsili sonuçlarıdır. Sayısal simülasyon sonucu, kimyasal olarak floresein çözeltisi kullanılarak yapılan deneysel karakterizasyon ile iyi bir uyum içindedir. Kemokin SDF-1 alfa gibi diğer kimyasalların gradyanları da simülasyon kullanılarak önceden tahmin edilebilir.

Cihaz içinde üretilen oksijen gradyanları, oksijene duyarlı floresan boya kullanılarak deneysel olarak karakterize edilebilir. Tipik olarak, yukarı akışta %1'den aşağı akışta %16'ya kadar oksijen gradyanları cihaz içinde stabil bir şekilde oluşturulabilir. Burada, canlı hücre görüntüleme mikroskobu kullanılarak yapılan deneyler sırasında toplanan tipik hızlandırılmış görüntüler gösterilmektedir.

Görüntü analizinden sonra, A549 hücrelerinin göç yörüngeleri ve ortalama hareketleri hesaplanabilir. Gradyan yokken, hücreler rastgele göç gösterir ve ortalama hareket sıfıra yakındır. Sadece bir SDF-1 alfa kemokin gradyanı ile hücreler kemotaktik davranış gösterir ve beklendiği gibi yüksek kemokin gradyan yönüne doğru göç eder.

Sadece bir oksijen gradyanı ile hücreler, memeli hücreleri için iyi çalışılmamış bir aerotaktik davranış göstererek düşük oksijen yönüne doğru hareket eder. İlginç bir şekilde, hem kemokin hem de oksijen gradyanlarında, hücreler düşük oksijen gradyanına doğru hareket eder ve oksijen gradyanının baskın etkilere sahip olduğunu gösterir. Bu gözlem daha fazla çalışma gerektirir.

Bu prosedürü denerken, imalat sırasında cihazı iyi bir şekilde düzleştirmeyi ve hücre göçü deneyi sırasında mikroakışkan cihaz kurulumundaki hava kabarcıklarını ortadan kaldırmayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, bir PDMS-PC mikroakışkan cihazının nasıl hazırlanacağını iyi anlamalı ve kimyasal ve oksijen gradyanlarının kombinasyonları altında memeli hücre göçünü incelemek için deneyleri kurmalısınız.