Canlı Zebra balığı Embriyolarında Biosense Motor Nöron Membranı Potansiyeli

Bu prosedürün genel amacı, FRET tabanlı bir GEVI kullanarak zebra balığı embriyoları aracılığıyla, invaziv olmayan fizyolojik koşullar altında uyarılabilir hücrelerin elektriksel özelliklerini incelemektir. Bu yöntem, nöronlar gibi uyarılabilir hücrelerin biyolojisine ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, bu yöntemler nörolojik bozuklukların patogenezinde uyarılabilirliğin rolünü analiz etmek için kullanılabilir.

Bu yaklaşım, FRET tabanlı genetik olarak kodlanmış voltaj indikatörleri eksprese eden şeffaf zebrafish embriyolarını kullanır. Yaklaşım, hücrelerin elektriksel özelliklerinin in vivo ve invaziv olmayan bir şekilde ölçülmesine olanak tanır. Böylece bu yöntem, zebrafish embriyolarındaki spinal nöron uyarılabilirliği hakkında bilgi sağlayabilir.

Bu yöntem, görüntüleme çalışmalarına uygun diğer in-vitro veya in-vivo sistemlere de uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için Mermaid biyosensör kodlama dizisini amplifiye etmek üzere PCR karışımını hazırlayın. PCR karışımını 95 °C'de 15 saniye boyunca ısıtın.

50 °C'de 15 saniye boyunca primerleme ve 72 °C'de dört dakika boyunca uzatma olmak üzere toplam 35 döngü uygulayın. Ardından, ticari bir jel saflaştırma kiti kullanarak spesifik küt PCR ürününü jel ile saflaştırın. Sonrasında, DNA fragmanını pCMV-SC küt vektörüne klonlayın ve HuC promoterinin yerleştirilmesi için Mermaid-pozitif plazmidi SmaI restriksiyon enzimi ile lineerize edin.

Restriksiyon reaksiyonunu toplam 20 µL hacimde hazırlayın ve reaksiyonu 25 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, sindirilmiş plazmidi ticari bir jel saflaştırma kiti kullanarak jel üzerinden saflaştırın. Daha sonra, şablon olarak zebrafish genomik DNA'sı ve PFU DNA polimeraz kullanarak HuC promotörünü PCR ile amplifiye edin.

PCR karışımını hazırlayın. 95 °C'de iki dakikalık başlangıç adımının ardından, PCR karışımını 95 °C'de 15 saniye boyunca ısıtın. 50 °C'de 15 saniye boyunca primer bağlatma işlemi gerçekleştirin ve toplam 35 döngü boyunca 72 °C'de dört dakika boyunca uzatma işlemi yapın.

Ardından, spesifik küt PCR ürününü jel ile saflaştırın. Saflaştırılmış eşmolar miktardaki pCMV-SC Mermaid ve pHuC DNA'yı, toplam 10 µL hacminde bir µL T4 DNA ligaz ve bir µL Spesifik 10x tamponu kullanarak ligeyin. Sonrasında reaksiyonu 4 °C'de 16 saat boyunca inkübe edin.

Yetkin hücrelerin bir alikotunu, beş µL ligasyon reaksiyonu ile transforme edin. Promotörün uygun oryantasyonda yerleştiği pHuC-pozitif klonları, CEL1-EcoRV çift sindirimi ile seçin. Klonları 15 mL'lik tüplere aktarın ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Ardından plazmidi hücrelerden ekstrakte edin, CEL1-EcoRV çift restriksiyon reaksiyonunu hazırlayın ve 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra reaksiyonları bir agaroz jele yükleyin. Bu prosedürde, yaban tipi veya sod1G93R yetişkin zebrafish'lerden elde edilen döllenmiş yumurtaları 10 mm'lik bir Petri kabına aktarın.

Embriyoları soğuk balık suyu ile durulayın. Ardından, 200 picogram pHuC-Mermaid plazmidini hemen yolk kısmına mikroenjekte edin. Sonrasında embriyoları bir Petri kabına aktarın ve sonraki analizler için istenen gelişim evresine ulaşana kadar 28 °C'deki balık suyunda inkübe edin.

Spontan kuyruk kıvrılma analizi için embriyoları, %0,2 DMSO içeren balık suyu ile doldurulmuş 90 milimetrelik yuvarlak bir Petri kabına aktarın. Ardından, uçları sivri iki adet kuyumcu pensi veya iğne kullanarak embriyoları manuel olarak dekoryonize edin. Sonrasında embriyoları 28 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin.

Bir stereomikroskopa monte edilmiş dijital kamera kullanarak, bir dakikalık video kaydı sırasında oda sıcaklığında kuyruk kıvrılmasını tespit edin. Ardından, saniyede 30 karelik bir zaman çözünürlüğünde zaman serisini edinin. Daha sonra, birim zaman başına düşen bükülme sayısını sayarak spontan kuyruk kıvrılma frekansını hesaplayın.

Riluzol ilacının etkisini değerlendirmek için embriyoları, beş mikromolar riluzol içeren balık suyuyla doldurulmuş yeni bir 90 milimetrelik Petri kabına aktarın. Ardından, bir dakikalık video kaydı almak ve davranışsal analizi gerçekleştirmek önce embriyoları 28 °C'de beş dakika inkübe edin. Şimdi, 20 ila 24 hpf embriyoları, 37 °C'de 35 milimetrelik cam tabanlı bir görüntüleme kabı içerisinde, balık suyuyla hazırlanmış yüzde bir düşük erime noktalı agaroz içine yerleştirin.

Embriyoları yan tarafları üzerine konumlandırın ve agarozun oda sıcaklığında katılaşmasını bekleyin. Ardından, görüntüleme kabını bir konfokal mikroskobun tablasına yerleştirin. Monomerik Umikinoko-Green'i 488 nanometre argon lazer ile uyararak biyosensörü eksprese eden motor nöronları belirleyin.

Ardından emisyonu 495 ile 525 nanometre arasına ayarlayın ve kaydet düğmesine basın. Bir FRET ölçümü için, Fret çiftinin donörü olan mUKG'yi 488 nanometre lazerle uyarın. Aynı anda iki fotomultipliyer kullanarak donör tarafından yayılan floresansı ve monomerik Kusibira-Orange akseptörü tarafından yayılan floresansı tespit edin.

Deneyin başında, mUKG floresansının kaydedildiği birinci fotomultiplier'ın kazancını (gain) ve ofsetini (offset) optimize edin ve bunları oturum boyunca sabit tutun. Ofseti ayarlamak için Q görünüm tablosunu (lookup table) kullanarak görüntünün rengini yoğunluk değerlerine dönüştürün. Lazer kapalıyken tarama yaparken, arka plan piksellerinin yoğunluğu sıfırdan biraz daha yüksek olacak şekilde ofset sürgüsünü kullanın.

Aynı bakma tablosunu kullanarak lazeri açın. Tarama yaparken, doygun piksellerden kaçınmaya dikkat ederek sinyal-gürültü oranını maksimize etmek için kazanç sürgüsünü kullanın. Yazılım veri toplama penceresinde, açılır menüden xyt veri toplama modunu ve 512 x 64 piksellik bir görüntü alan boyutunu seçin.

Ardından, embriyo spinal nöron voltajındaki değişimlerin kaydı için her 30 milisaniyede bir, bir dakika boyunca tek bir XY düzlemi alınacak şekilde ayarlama yapın. Riluzole uygulamasının aynı nörondaki membran depolarizasyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için, beş mikromolar riluzole içeren balık suyu ilavesinden beş dakika sonra yeni bir veri seti elde edin. Bu videoda, kuyruk ucunu başa getiren tam vücut kasılmalarından oluşan motor yanıtlar olan spontan kıvrılmalar, standart balık ortamında 20 ila 24 hpf evresinde kaydedilmiştir.

Bu film, beş mikromolar riluzole ile inkübasyon sonrası bir embriyonun spontan kıvrılmalarını göstermektedir. Omurilik motor nöronlarının elektriksel aktivitesindeki değişimlerin, riluzole kaynaklı spontan kıvrılma frekansındaki değişikliklerin temelinde olup olmadığını test etmek için, Mermaid biyosensörünün donör-akseptör FRET çiftinin floresan yoğunluk oranı ölçülerek embriyo omurilik motor nöronlarındaki membran potansiyeli tamamen noninvazif bir yöntemle incelenmiştir. Biyosensörü eksprese eden primer omurilik motor nöronları tanımlanmış ve bazal spontan depolarizasyon aktiviteleri kaydedilmiştir.

Kuyruk kıvrılma hareketlerinin sıklığındaki azalma ile birlikte, riluzole uygulaması spontan depolarizasyon olaylarının sıklığını da azaltmıştır. Uzmanlaşıldığında, bu yaklaşım araştırmacıların, gelişmekte olan fonksiyonel sistemdeki hücreler arası etkileşimlerin karmaşıklığını tamamen koruyan, sağlam embriyoların nöral ağlarının elektriksel özelliklerini incelemesine olanak tanıyacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, spinal nöronların elektriksel aktivitesinin spontan kuyruk kıvrılma sıklığı ile nasıl korele olduğu konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.