Name: Canlı Zebra balığı Embriyolarında Biosense Motor Nöron Membranı Potansiyeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Öğrenin, FRET tabanlı GEVI kullanarak zebra balığı embriyolarında sinir hücrelerinin elektriksel özelliklerini invivo ve invaziv olmayan yöntemle nasıl ölçebilirsiniz. Bu teknik, nörolojik bozuklukların patogenezindeki rolü anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, FRET görüntüleme analizine paha biçilmez desteği için Simona Rodighiero'ya teşekkür eder.

1. pHuC_Mermaid Plasmid Üretimi NOT: Denizkızı, Ciona intestinalis&#39;in voltaj algılama alanını (VSD) eşleştirerek geliştirilen bir biyosensördür (şimdi FRET partneri fluorophores Umi-Kinoko Green (mUKG: verici) ve turuncu-yayan floresan protein Kusabira Orange (mKOk: acceptor) monomerik versiyonu ile fosfataz (Ci-VSP) içeren 5 voltaj sensörü. Bu biyolojik sensör için, membranın depolarizasyonu ile uyarılan VSD alanının konformasyonel değişimleri, verici ve alıcı floresan proteinlerin yakınlığını arttırır, böylece aralarındaki enerji transferini arttırır (FRET Oranının arttırılması) 3 . VSD, plazma membranında biyo-sensörün etkin lokalizasyonunu sağlar. Biyosensörün nöronal ifadesi (omurilikte, sinyal hem internöronlarda hem de motor nöronlarda saptanabilir), Deniz Kızı opsiyonunun klonlanmasıyla elde edilirZebra balığı pan-sinir promotörü HuC 6&#39;nın altında bir çerçeve (ORF) okuma. <ol><li> T3 Universal primerini ve Deniz Kızı Sma I primerini (5&#39;TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA) kullanarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile pCS4 + Mermaid plasmid 3&#39;ten Mermaid ORF&#39;yi Pfu (prova okuma) DNA polimeraz ile yükseltin ve böylece yukarıya bir Sma I sınırlama bölgesi yerleştirilir Denizkızı ORF. <ol><li> Aşağıdaki PCR karışımını kullanın: 0.5 uL Pfu DNA polimeraz, 7.5 uL özgül 10x tampon, 1 uL 10 mM dNTP, 2.5 uL dimetil sülfoksit (DMSO), 0.5 uL (50 ng) plazmid preparatı ve 1 Toplam 50 μL hacimdeki her bir primerin 20 μM stok solüsyonlarının μL&#39;si. </li><li> PCR karışımını 95 ° C&#39;de 15 saniye boyunca ısıtın, 50 ° C&#39;de 15 saniye boyunca başlatın ve toplam 35 devir boyunca 72 ° C&#39;de 4 dakika boyunca uzatın. </li></ol></li><li> Belirli küntleri jel-arındırmakPCR ürünü, ticari bir jel arıtma kiti kullanılarak imalatçının protokolünü izleyerek. </li><li> Üreticinin protokolünü izleyerek DNA parçasını pCMV-SC künt vektör içine klonlayın. </li><li> HuC promoterinin aşağıdaki eklenmesi için Mermaid pozitif plasmidini (pCMV-SC_Mermaid olarak adlandırılır) Sma I restriksiyon enzimi ile lineerize edin. <ol><li> Restriksiyon reaksiyonunu aşağıdaki gibi ayarlayın: Sma I sınır enziminin 0.5 uL&#39;si (10 U), kit 10x tampon maddenin 2 uL&#39;si ve toplam 20 μL hacimdeki plasmid DNA&#39;sının 5 μg&#39;si. Reaksiyonu 25 ° C&#39;de 1 saat inkübe edin. </li></ol></li><li> Üreticinin protokolünü izleyen ticari bir jel arıtma kiti kullanılarak sindirilmiş plazmiti jel-arındırın. </li><li> Bir çift HuC-spesifik primer (HuCprom-forwl_SalI: 5&#39;-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA ve HuCpro kullanılarak, şablon olarak Pfu DNA polimeraz ve zebrafish genomik DNA&#39;sı ile HuC yükselticisini (pHuC) PCR ile çoğaltınM-rev1: 5&#39;-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) ve ATG&#39;nin akış yukarı akışında 3.150 bp&#39;lik bir bölgeye yayılmıştır. <ol><li> Aşağıdaki şemayı kullanarak PCR karışımını ayarlayın: Pfu DNA polimerazın 0.5 uL&#39;si, spesifik 10x tamponun 7.5 uL&#39;si, 10 mM dNTP&#39;lerin 1 uL&#39;si, DMSO&#39;nun 2.5 uL&#39;si, genomik DNA&#39;nın 200 ng&#39;si ve 20-μM&#39;lik 1 uL&#39;lik Her primerin stok solüsyonları toplam 50 μL hacimdedir. </li><li> 95 ° C&#39;de 2 dakikalık bir başlangıç ​​basamağından sonra, PCR karışımını 95 ° C&#39;de 15 saniye ısıtın, 50 ° C&#39;de 15 saniye süreyle asın ve toplam 35 döngü için 72 ° C&#39;de 4 dakika uzatın . </li></ol></li><li> Üreticinin protokolünü izleyerek ticari bir jel arıtma kiti kullanarak spesifik künt PCR ürününü jel-arındırın. </li><li> 1 mcL T4 DNA ligaz ve 10 uL&#39;lik bir toplam hacimde spesifik 10X tamponun 1 uL&#39;si kullanılarak saflaştırılmış pCMV-SC_Mermaid&#39;in (basamak 1.5) ve pHuC DNA&#39;sının (basamak 1.7) eş molar bir miktarı ligatlandırın. Reaksiyonu 16 saat boyunca enkübe edin4 ° C. </li><li> Üreticinin talimatlarını izleyen 5 μL ligasyon reaksiyonu ile (adım 1.8) yetkili hücrelerin bir bölümünü dönüştürün. </li><li> Bir Sal I- Eco RV çift sindirimiyle (SalI kısıtlama bölgesi adım 1.6&#39;da promoter fragmanının akış aşağısına sokuldu ise Eco RV kısıtlama bölgesi PCMV-SC plazmidinin poliadenilasyon bölgesi olan PolyA&#39;nın akış aşağısında yer alır). <ol><li> Restriksiyon reaksiyonunu aşağıdaki gibi ayarlayın: hem Sal I hem de Eco RV kısıtlama enzimlerinin 0.5 uL&#39;si (10 U), kit10X tamponunun 2 uL&#39;si ve 1 μg pHuC_Mermaid DNA&#39;nın toplam hacmi 20 uL olmalıdır. Reaksiyonu 37 ° C&#39;de 1 saat inkübe edin. Tepkimeleri bir agaroz jel üzerine uygulayın. </li></ol></li></ol> 2. Embriyo Mikroenjeksiyonu <ol><li> Döllenen örneği transfer edin(AB türü) ya da Sod1-G93R yetişkin zebra balığı 4&#39;ten plastik bir pipet kullanılarak 10 mm&#39;lik bir Petri kabuğundan elde edilen gs&#39;dir. </li><li> Embriyoları soğuk (4 ° C) balık suda durulayın ve bir microinjector kullanarak 200 μg pHuC_Mermaid plazmid ile hemen sarılı içine mikroenjekte edin (mikroenjeksiyon prosedürünün genel ve detaylı bir tarifi için bkz. Referanslar 7 ve 8). </li><li> Plastik bir pipet kullanarak embriyoları bir Petri kabına aktarın ve aşağıdaki analizler için istenen gelişim evresine (20-24 saat sonrası dölleme, hpf) ulaşana kadar 28 ° C&#39;de balık suyunda inkübe edin. </li></ol> 3. Spontan Kuyruk Sargısı Analizi NOT: 20-24 hpf embriyolarında spontan kuyruk sarmalama davranışını riluzole ilaç ilacı olsun veya olmasın değerlendirin. <ol><li> % 0.2 DMSO (riluzole araç) içeren balık suyuyla doldurulmuş 90 mm&#39;lik yuvarlak bir Petri kabına bir embriyo aktarın ve elle de tw kullanarak kapatıp çıkarınO Kuyumcunun forsepsleri keskin uçlarla. Embriyo 5 dakika inkübe edin. </li><li> Bir stereomikroskopta monte edilmiş dijital bir kamera kullanarak 1 dakika video kaydı sırasında kuyruk sargısını RT&#39;de algılayın. 30 karelik / s&#39;lik bir zaman çözünürlüğünde zaman serileri elde edin. </li><li> Zaman birimi başına viraj sayısını (hem kontralateral hem de ipsilateral) sayarak spontan kuyruk sargılar sıklığını hesaplayın. </li><li> İlaç riluzolunun etkisini değerlendirmek için, 5 μM riluzol içeren balık suyu ile dolu yeni bir 90 mm Petri kabına embriyo aktarmak için hafifçe bir plastik Pasteur pipeti kullanın. <ol><li> 1 dk. Video kaydetmeden önce davranış analizi uygulayarak embriyo 5 dakika inkübe edin. </li></ol></li></ol> 4. Yaşayan Embriyolarda Denizkızı Biyosensör Görselleştirme Görüntüleme Kurulumu: Verici ve Alıcı Sinyallerinin Eşzamanlı Tespiti <ol><li> 20-24 hpf embriyolarını% 1 düşük erime noktalı agarozda balık suyuna37 ° C&#39;de 35 mm&#39;lik cam tabanlı bir görüntüleme çanağının içinde. Embriyoların yanlarını yönlendirin. Agaroz oda sıcaklığında katılaşıncaya kadar bekleyin. </li><li> Ters çevrilmiş mikroskopta monte edilmiş ters çevrilmiş bir konfokalın sahnesine görüntüleme çanağını aktarın. 488 nm argon lazer hattı ile mUKG&#39;yi heyecanlandırarak ve 495 ila 525 nm arasındaki emisyonunu kaydeden biyolojik sensörü ifade eden motor nöronları 20X&#39;lik bir objektifle (0,7 sayısal diyafram açıklığı, NA) tanımlayın. </li><li> FRET ölçümü için, FRET çifti vericisi olan mUKG&#39;yi 488 nm lazer hattı ile tahrik edin. Çift yönlü modda 8.000 Hz&#39;de çalışan bir rezonant tarayıcı ile donör tarafından yayılan flüoresan (495 ila 525 nm arasında) ve mKOk alıcı tarafından yayılan flüoresan (550 ve 650 nm arasında FRET kanalı) eşzamanlı olarak algılayın. Varsa, 473 nm lazeri kullanın. NOT: Donörün uyarılma verimi hafifçe azalacaktır (488 nm&#39;de% 93 yerine% 85), fakat alıcıın çapraz uyarımının(488 nm&#39;de% 17&#39;den 473 nm lazer hattıyla% 9&#39;a) azaltılmalıdır. </li><li> Fototoksisite ve florofor ağartmayı azaltmak için lazer hattının gücünü azaltarak (satın alma yazılımının kiriş yol penceresinde ) numunenin aydınlatmasını en aza indirin. </li><li> Uyarıyı, denemenin başında belirlenen ve oturum boyunca sabit tutulan kazanç ve ofset parametreleriyle eşleşecek şekilde optimize edin. Ofseti ayarlamak için, görüntünün rengini yoğunluk değerlerine değiştirin (Q arama tablosunu kullanarak) ve lazer kapalıyken tarama yaparken ofset düğmesini çevirin (akıllı ofset), böylece arka plandaki piksellerin hafif yoğunluğa sahip olması gerekir Sıfırdan yüksek. Aynı tarama tablosunda, tarama sırasında lazeri açarak, doymuş pikselleri önlemeye dikkat ederek sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak için kazanç düğmesini çevirin (akıllı kazanç). </li><li> Açık bir iğne deliği (2 havadar birimi) kullanarak nicel için yeterli dinamik aralık sağlamak için 16 bit görüntüler elde edinE analizleri. Edinme hızını artırmak ve photobleaching&#39;i en aza indirgemek için ortalamalardan kaçının. </li><li> Yazılım edinme penceresinde, açılır menüden 512 x 64 piksel (piksel boyutu: 605 nm) boyutundaki bir resim alanını seçin. </li><li> Edinme modu penceresinden açılır menüden xyt (tek bir xy düzleminde zaman aşımı) seçin ve tek bir xy düzlemi edinerek embriyo spinal nöron voltajındaki değişiklikleri kaydedin , her bir görüntüyü 30 dakikada bir kaydetmek için edinme parametrelerini ayarlayın Ms 1 dakika boyunca. </li><li> Aynı nöronda membran depolarizasyonu üzerine riluzole uygulanmasının etkisini değerlendirmek için, 5 μM riluzol içeren balık suyunun eklenmesinden 5 dakika sonra yeni bir veri kümesi edinin. </li><li> FRET analizi için ImageJ makrosu Biosensor_FRET&#39;i kullanın (tek zincirli FRET biyosensörlerini ifade eder. </li><li> T1&#39;deki her nöronun bazal membran FRET oranını ((FRET ortalama - FRET arka planı) / (Donör ortalama - Donör arka plan) gibi değerlendirin; burada FRET ve DonVeya ortalama yoğunluk, elde edilen her kanal için hücrenin etrafında çizilmiş olan aynı ilgi alanında (ROI) hesaplanan ortalama floresan yoğunluğudur ve FRET ve Donör arka plan, floresan numunesi olmadan görüş alanının bir ROI&#39;sinde hesaplanan ortalama floresan yoğunluğudur. NOT: Eklentinin kullanımıyla ilgili ayrıntılı bir adım adım açıklama <a href="http://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret">www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret</a> web sitesinde bulunabilir. </li><li> Farklı deneysel paradigmalar arasındaki depolarizasyon frekansını, amplitüdünü ve süresini karşılaştırmak için bir grafik yazılımı kullanın. Eşlenmemiş bir Öğrencinin t- testi kullanarak iki grubu karşılaştırın ve P &lt;0.05 olduğunda istatistiksel olarak farklı ortalama değerler düşünün. </li></ol>

<ol><li>Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+voltage+indicators+for+large+scale+cortical+imaging+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age.</a> Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).</li>
<li>Chemla, S., Chavane, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+dye+imaging%3A+Technique+review+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models.</a> J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).</li>
<li>Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+membrane+voltage+measurements+using+FRET+with+new+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).</li>
<li>Benedetti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((INaP+selective+inhibition+reverts+precocious+inter-+and+motorneurons+hyperexcitability+in+the+Sod1-G93R+zebrafish+ALS+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">INaP selective inhibition reverts precocious inter- and motorneurons hyperexcitability in the Sod1-G93R zebrafish ALS model.</a> Sci Rep. 6, 24515(2016).</li>
<li>Pennati, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+differences+between+larvae+of+the+Ciona+intestinalis+species+complex%3A+hints+for+a+valid+taxonomic+definition+of+distinct+species%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Morphological differences between larvae of the Ciona intestinalis species complex: hints for a valid taxonomic definition of distinct species.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0122879(2015).</li>
<li>Park, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+upstream+elements+in+the+HuC+promoter+leads+to+the+establishment+of+transgenic+zebrafish+with+fluorescent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons.</a> Dev Biol. 227 (2), 279-293 (2000).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (27), (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Drapeau, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12450489">Development of the locomotor network in zebrafish.</a> Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).</li>
<li>Brustein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steps+during+the+development+of+the+zebrafish+locomotor+network%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Steps during the development of the zebrafish locomotor network.</a> J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).</li>
<li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).</li>
<li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2%3A+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1S7 (2007).</li>
<li>Sungmoo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Membrane+Potential+with+Two+Types+of+Genetically+Encoded+Fluorescent+Voltage+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors.</a> J Vis Exp. (108), e53566(2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada sunulan protokol, zebrafish embriyo omurga motor nöronlarının elektriksel özellikleri ile embriyonik gelişimin yaklaşık 17 hpf&#39;sinde görülen ve 24 hpf 10&#39;a kadar uzanan ilk stereotipik motor aktivite olan spontan sarmal davranış arasındaki ilişkiyi keşfetmemizi sağladı. Yaklaşımımız araştırmacılara, bozulmamış embriyoların sinir sistemini incelemek için geliştirilmiş bir işlevsel ağdaki hücreler arasındaki etkileşimlerin karmaşıklığını tamamen koruyan b...

İn vivo sistemik bileşen analizi, bilim insanlarının hücresel davranışlarını en güvenilir biçimde araştırmalarını sağlar. İncelenen aktivite, membran voltajı değişikliklerinin uyarılabilir hücreler arasındaki iletişimi yönlendirdiği sinir sisteminde olduğu gibi, hücre-hücre etkileşimlerinden (temaslı ve temassız olmak üzere) büyük ölçüde etkilendiğinde, bu durum özellikle geçerlidir. Bu elektrik sinyalleri tarafından kodlanan bilginin anlaşılması, sinir sisteminin hem fizyolojik hem de hastalık hallerinde nasıl çalıştığı anlamanın anahtarıdır. En invaziv olmayan fizyolojik koşullarda hücre elektriksel özelliklerini incelemek için yakın zamanda birkaç genetik olarak kodlanmış gerilim göstergesi geliştirilmiştir 1 . Önceki nesiller optik voltaj sensörlerinin (özellikle voltaja duyarlı boyalar) 2 aksine, GEVI&#39;ler bozulmamış sinir sisteminin in vivo analizlerine izin verir veIfadeleri, spesifik hücre tipleri veya popülasyonları ile sınırlanabilir. Zebra balığı embriyo, GEVI&#39;ye atfedilen büyük potansiyelin avantajlarından yararlanmak için seçilen in vivo &quot;substrat&quot; ​​tır. Aslında, optik netliği ve basitleştirilmiş ve evrimsel olarak korunmuş sinir sistemi sayesinde zebra balığı modeli, bir ağdaki her hücresel bileşenin anlaşılır bir şekilde tanımlanmasına ve manipüle edilmesine olanak tanır. Aslında, FRET tabanlı GEVI Mermaid 3&#39;ün istihdamı, amyotrofik lateral skleroz (ALS) 4&#39;ün zebrafish modelinde spinal motor nöron davranışındaki semptomatik önlemlerin tanımlanmasına yol açtı. Aşağıdaki canlı organizma protokolü, Mermaid&#39;i nörona spesifik bir şekilde ifade eden bozulmamış zebra balığı embriyolarındaki omurilik motor nöronlarının elektriksel özelliklerini nasıl izleyeceğini açıklamaktadır. Dahası, farmakolojik olarak indüklenen chan&#39;ınBu tür elektriksel özelliklerdeki ges, gelişimin çok erken evrelerinde zebra balığı hareket davranışını karakterize eden stereotipik motor aktivite olan embriyonik spontan sargıların frekansındaki değişikliklerle ilişkilendirilebilir.

<table><tbody><tr><td>Düşük Erime Noktalı Agaroz&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>Riluzole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R116</td><td></td></tr><tr><td>Pfu Ultra HQ DNA polimeraz&nbsp;</td><td>Agilent Technologies - Stratagene Ürünleri Bölümü</td><td>600389</td><td></td></tr><tr><td>T3 Üniversal astar&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Jel ve PCR Temizleme sistemi</td><td>Promega</td><td>A9280</td><td></td></tr><tr><td>Universal SmaI astarı&nbsp;</td><td>Eurofins</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StrataClone Memeli İfade Vektör Sistemi / pCMV-SC künt vektör&nbsp;</td><td>Agilent Technologies - Stratagene Ürünleri Bölümü&nbsp;</td><td></td><td></td>240228</tr><tr><td>SmaI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England Biolabs</td><td>R0195S</td><td></td></tr><tr><td>35 mm, cam tabanlı görüntüleme kabı ve nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>81151</td><td></td></tr><tr><td>forseps</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>M10 F</td><td></td></tr><tr><td>Dijital kamera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC 310 FX</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite 4.7.1 yazılımı&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuickTime Player, v10.4</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop (ters)</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ makro Biosensor_FRET&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prizma 6.0c&nbsp;</td><td>GraphPad Yazılım, Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

canlı zebra balığı embriyolarında biosense motor nöron membranı potansiyeli

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Burada açıklanan protokoller, araştırmacıların, hücrelerin bulunduğu ortamın bütünlüğünü değiştirmeden hücre iletişimini incelemelerine izin vermek için tasarlanmıştır. Spesifik olarak, omurilik nöronları gibi uyarılabilir hücrelerin elektriksel aktivitesini analiz etmek için geliştirilmiştir. Böyle bir senaryoda, omurga hücresinin bütünlüğünü korumak çok önemlidir, ancak ilgili sistemlerin anatomisini ve fizyolojik şeklini korumak da önemlidir. Gerçekten de, sinir sisteminin ve diğer karmaşık sistemlerin nasıl çalıştığının anlaşılması, sistemik bir yaklaşıma dayanmalıdır. Bu nedenle canlı zebra balığı embriyosu model sistem olarak seçilmiş ve embriyoların fizyolojik durumlarına müdahale edilmeden spinal nöron zarı voltaj değişiklikleri değerlendirilmiştir. 
Burada, zebra balığı embriyolarının kullanımını FRET tabanlı bir biyosensörle birleştiren bir yaklaşım açıklanmaktadır. Zebra balığı embriyoları, çok basitleştirilmiş bir sinir sistemi ile karakterize edilir ve şeffaflıkları sayesinde görüntüleme uygulamaları için özellikle uygundur, bu da zebra balığı gelişimi sırasında plazma zarında floresan bazlı voltaj göstergelerinin kullanılmasına izin verir. Bu iki bileşen arasındaki sinerji, fizyolojik durumu bozmadan, bozulmamış canlı organizmalardaki hücrelerin elektriksel aktivitesini analiz etmeyi mümkün kılar. Son olarak, bu non-invaziv yaklaşım, diğer analizlerle (örneğin, burada gösterildiği gibi spontan hareket kayıtları) birlikte var olabilir.

Protein sentezini sadece sinir sisteminde yönlendiren pHuC pan-nöronal promotörün kontrolü altında FRET-esaslı Denizkızı biyosensör kodlama sekansını taşıyan bir ifade vektörü, tek hücreli döllenmiş yumurtalara bir mikroenjeksiyon vasıtasıyla Geçici transgenik embriyoların elde edilmesi için sipariş verme ( Şekil 1 , Sol panel). Mikroenjeksiyon tekniğini uyguladıktan sonra, Denizkızı pozitif embriyoların yüzdesi% 100&#39;e yakıntı. Bunlardan FRET anali...

Burada açıklanan protokoller, zebra balığı embriyolarını in vivo bir sistemde kullanarak, ilgilenilen hücre tipinde seçici olarak ifade edilen bir floresan rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı genetik olarak kodlanmış voltaj göstergesi (GEVI) ile birlikte uyarılabilir hücrelerin elektriksel özelliklerinin incelenmesine izin verir.

Canlı Zebra balığı Embriyolarında Biosense Motor Nöron Membranı Potansiyeli

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Bu prosedürün genel amacı, FRET tabanlı bir GEVI kullanarak zebra balığı embriyoları aracılığıyla, invaziv olmayan fizyolojik koşullar altında uyarılabilir hücrelerin elektriksel özelliklerini incelemektir. Bu yöntem, nöronlar gibi uyarılabilir hücrelerin biyolojisine ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, bu yöntemler nörolojik bozuklukların patogenezinde uyarılabilirliğin rolünü analiz etmek için kullanılabilir.Bu yaklaşım, FRET tabanlı genetik olarak kodlanmış voltaj indikatörleri eksprese eden şeffaf zebrafish embriyolarını kullanır. Yaklaşım, hücrelerin elektriksel özelliklerinin in vivo ve invaziv olmayan bir şekilde ölçülmesine olanak tanır. Böylece bu yöntem, zebrafish embriyolarındaki spinal nöron uyarılabilirliği hakkında bilgi sağlayabilir.Bu yöntem, görüntüleme çalışmalarına uygun diğer in-vitro veya in-vivo sistemlere de uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için Mermaid biyosensör kodlama dizisini amplifiye etmek üzere PCR karışımını hazırlayın. PCR karışımını 95 °C'de 15 saniye boyunca ısıtın.50 °C'de 15 saniye boyunca primerleme ve 72 °C'de dört dakika boyunca uzatma olmak üzere toplam 35 döngü uygulayın. Ardından, ticari bir jel saflaştırma kiti kullanarak spesifik küt PCR ürününü jel ile saflaştırın. Sonrasında, DNA fragmanını pCMV-SC küt vektörüne klonlayın ve HuC promoterinin yerleştirilmesi için Mermaid-pozitif plazmidi SmaI restriksiyon enzimi ile lineerize edin.Restriksiyon reaksiyonunu toplam 20 µL hacimde hazırlayın ve reaksiyonu 25 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, sindirilmiş plazmidi ticari bir jel saflaştırma kiti kullanarak jel üzerinden saflaştırın. Daha sonra, şablon olarak zebrafish genomik DNA'sı ve PFU DNA polimeraz kullanarak HuC promotörünü PCR ile amplifiye edin.PCR karışımını hazırlayın. 95 °C'de iki dakikalık başlangıç adımının ardından, PCR karışımını 95 °C'de 15 saniye boyunca ısıtın. 50 °C'de 15 saniye boyunca primer bağlatma işlemi gerçekleştirin ve toplam 35 döngü boyunca 72 °C'de dört dakika boyunca uzatma işlemi yapın.Ardından, spesifik küt PCR ürününü jel ile saflaştırın. Saflaştırılmış eşmolar miktardaki pCMV-SC Mermaid ve pHuC DNA'yı, toplam 10 µL hacminde bir µL T4 DNA ligaz ve bir µL Spesifik 10x tamponu kullanarak ligeyin. Sonrasında reaksiyonu 4 °C'de 16 saat boyunca inkübe edin.Yetkin hücrelerin bir alikotunu, beş µL ligasyon reaksiyonu ile transforme edin. Promotörün uygun oryantasyonda yerleştiği pHuC-pozitif klonları, CEL1-EcoRV çift sindirimi ile seçin. Klonları 15 mL'lik tüplere aktarın ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.Ardından plazmidi hücrelerden ekstrakte edin, CEL1-EcoRV çift restriksiyon reaksiyonunu hazırlayın ve 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra reaksiyonları bir agaroz jele yükleyin. Bu prosedürde, yaban tipi veya sod1G93R yetişkin zebrafish'lerden elde edilen döllenmiş yumurtaları 10 mm'lik bir Petri kabına aktarın.Embriyoları soğuk balık suyu ile durulayın. Ardından, 200 picogram pHuC-Mermaid plazmidini hemen yolk kısmına mikroenjekte edin. Sonrasında embriyoları bir Petri kabına aktarın ve sonraki analizler için istenen gelişim evresine ulaşana kadar 28 °C'deki balık suyunda inkübe edin.Spontan kuyruk kıvrılma analizi için embriyoları, %0,2 DMSO içeren balık suyu ile doldurulmuş 90 milimetrelik yuvarlak bir Petri kabına aktarın. Ardından, uçları sivri iki adet kuyumcu pensi veya iğne kullanarak embriyoları manuel olarak dekoryonize edin. Sonrasında embriyoları 28 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin.Bir stereomikroskopa monte edilmiş dijital kamera kullanarak, bir dakikalık video kaydı sırasında oda sıcaklığında kuyruk kıvrılmasını tespit edin. Ardından, saniyede 30 karelik bir zaman çözünürlüğünde zaman serisini edinin. Daha sonra, birim zaman başına düşen bükülme sayısını sayarak spontan kuyruk kıvrılma frekansını hesaplayın.Riluzol ilacının etkisini değerlendirmek için embriyoları, beş mikromolar riluzol içeren balık suyuyla doldurulmuş yeni bir 90 milimetrelik Petri kabına aktarın. Ardından, bir dakikalık video kaydı almak ve davranışsal analizi gerçekleştirmek önce embriyoları 28 °C'de beş dakika inkübe edin. Şimdi, 20 ila 24 hpf embriyoları, 37 °C'de 35 milimetrelik cam tabanlı bir görüntüleme kabı içerisinde, balık suyuyla hazırlanmış yüzde bir düşük erime noktalı agaroz içine yerleştirin.Embriyoları yan tarafları üzerine konumlandırın ve agarozun oda sıcaklığında katılaşmasını bekleyin. Ardından, görüntüleme kabını bir konfokal mikroskobun tablasına yerleştirin. Monomerik Umikinoko-Green'i 488 nanometre argon lazer ile uyararak biyosensörü eksprese eden motor nöronları belirleyin.Ardından emisyonu 495 ile 525 nanometre arasına ayarlayın ve kaydet düğmesine basın. Bir FRET ölçümü için, Fret çiftinin donörü olan mUKG'yi 488 nanometre lazerle uyarın. Aynı anda iki fotomultipliyer kullanarak donör tarafından yayılan floresansı ve monomerik Kusibira-Orange akseptörü tarafından yayılan floresansı tespit edin.Deneyin başında, mUKG floresansının kaydedildiği birinci fotomultiplier'ın kazancını (gain) ve ofsetini (offset) optimize edin ve bunları oturum boyunca sabit tutun. Ofseti ayarlamak için Q görünüm tablosunu (lookup table) kullanarak görüntünün rengini yoğunluk değerlerine dönüştürün. Lazer kapalıyken tarama yaparken, arka plan piksellerinin yoğunluğu sıfırdan biraz daha yüksek olacak şekilde ofset sürgüsünü kullanın.Aynı bakma tablosunu kullanarak lazeri açın. Tarama yaparken, doygun piksellerden kaçınmaya dikkat ederek sinyal-gürültü oranını maksimize etmek için kazanç sürgüsünü kullanın. Yazılım veri toplama penceresinde, açılır menüden xyt veri toplama modunu ve 512 x 64 piksellik bir görüntü alan boyutunu seçin.Ardından, embriyo spinal nöron voltajındaki değişimlerin kaydı için her 30 milisaniyede bir, bir dakika boyunca tek bir XY düzlemi alınacak şekilde ayarlama yapın. Riluzole uygulamasının aynı nörondaki membran depolarizasyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için, beş mikromolar riluzole içeren balık suyu ilavesinden beş dakika sonra yeni bir veri seti elde edin. Bu videoda, kuyruk ucunu başa getiren tam vücut kasılmalarından oluşan motor yanıtlar olan spontan kıvrılmalar, standart balık ortamında 20 ila 24 hpf evresinde kaydedilmiştir.Bu film, beş mikromolar riluzole ile inkübasyon sonrası bir embriyonun spontan kıvrılmalarını göstermektedir. Omurilik motor nöronlarının elektriksel aktivitesindeki değişimlerin, riluzole kaynaklı spontan kıvrılma frekansındaki değişikliklerin temelinde olup olmadığını test etmek için, Mermaid biyosensörünün donör-akseptör FRET çiftinin floresan yoğunluk oranı ölçülerek embriyo omurilik motor nöronlarındaki membran potansiyeli tamamen noninvazif bir yöntemle incelenmiştir. Biyosensörü eksprese eden primer omurilik motor nöronları tanımlanmış ve bazal spontan depolarizasyon aktiviteleri kaydedilmiştir.Kuyruk kıvrılma hareketlerinin sıklığındaki azalma ile birlikte, riluzole uygulaması spontan depolarizasyon olaylarının sıklığını da azaltmıştır. Uzmanlaşıldığında, bu yaklaşım araştırmacıların, gelişmekte olan fonksiyonel sistemdeki hücreler arası etkileşimlerin karmaşıklığını tamamen koruyan, sağlam embriyoların nöral ağlarının elektriksel özelliklerini incelemesine olanak tanıyacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, spinal nöronların elektriksel aktivitesinin spontan kuyruk kıvrılma sıklığı ile nasıl korele olduğu konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

biosensing-motor-neuron-membrane-potential-in-live-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu videoda, biz gelişmekte olan omurgalı beyin konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte canlı zebrafish embriyolar analiz edildiği bir yöntem gösteriyor. Bu, tek hücreli zebrafish embriyo enjekte ve daha sonra gelişmekte olan beyin montaj ve görüntü hangi yöntemi içerir.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Bu protokol zebrafish embriyolar yaşayan tek tek nöronların veya nöral krest hücreleri görüntüleme açıklar. Bu yöntem, floresan konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak cep davranışlar ve aktin lokalizasyonu incelemek için kullanılır.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

Larvaların zebrafish spinal motor nöron ve hedef iskelet kası aynı anda yama kelepçe kayıt izin vermek için ilk omurgalı model sistemi temsil eder. Bu video segmental CaP motor nöron ve hedef kas hücrelerinin yanı sıra, her bir hücre tipi kayıt için metodolojiler tanımlamak için kullanılır mikroskobik yöntemler göstermektedir.

Motor-nöron Paired Patch Kelepçe Kayıtlar ve Zebra balığı Hedef İskelet Kası

Bu videoda, genetik olarak modifiye edilmiş somatosensoriyel nöronları aktive ederek ve ortaya çıkan davranışsal yanıtı yüksek hızlı bir video kamera ile kaydederek optogenetik teknikler açıklanmaktadır.

Zebra Balığı Optogenetiği: Larva Davranışsal Tepkilerini İncelemek için Genetik Olarak Değiştirilmiş Somatosensoriyel Nöronun Aktive Edilmesi

Bu video, zebra balığı embriyolarında motor nöronların elektrofizyolojisini incelemek için invaziv olmayan bir testi göstermektedir. Omurilik motor nöronlarının spontan depolarizasyonu sonucu embriyolarda kuyruk koilinin ölçümü yapıldıktan sonra, koilleme frekansını azaltmak için bir sodyum kanal blokeri uygulanır. Daha sonra, embriyolar agaroz içinde hareketsiz hale getirilir ve bir floresan mikroskobu altına yerleştirilir. Genetik olarak tasarlanmış motor nöronlar, bir donör ve bir alıcı...

Zebra Balığı Embriyolarında Motor Nöronların Elektrofizyolojisini İncelemek İçin İnvaziv Olmayan Bir Yaklaşım

Bu video, felçli bir zebra balığı larvasındaki afferent nöronlardan gelen elektrik sinyallerinin, lateral hat ganglionunun yakınına bir mikropipet yerleştirerek ve sinyal yakalama için gevşek bir conta oluşturarak kaydedilmesini göstermektedir. Hücre dışı çözelti, bu işlem sırasında nöronal canlılığı korur.

İmmobilize Bir Zebra Balığı Larvasında Afferent Nöronlardan Gelen Elektrik Sinyallerinin İzlenmesi

Çoğalma, desenleme, farklılaşma ve akson rehberlik gibi gelişimsel süreçleri kolaylıkla Zebrafish omurilikte örnek alınabilir. Bu yazıda, bu olayların görselleştirme optimize eden, zebra balığı embriyolarının için bir montaj prosedürü açıklar.

Diseksiyon ve Zebra balığı Embriyolar Yanal Montaj: Omurilik Kalkınma Analizi

Bu yazıda zebra balığı embriyolarının ve larva spinal nöronların elektrofizyolojik kayıtları için yöntemleri tarif eder. Hazırlık yerinde nöronları korur ve genellikle asgari diseksiyonu kapsar. Bu yöntemler, erken larva aşamalarında ilk elektrik uyarılma alımından spinal nöronların çeşitli elektrofizyolojik çalışmaları için izin verir.

Zebra balığı<em&gt; Situ</em&gt; Omurilik Omurilik duyusal ve motor nöronlar gelen Elektrofizyolojik Recordings Hazırlık

Burada, bir hücresel elektrik voltaj muhabir Zebra balığı çizgi embriyonik gelişim, hareket, görselleştirmek için oluşturma sürecini göstermek ve in vivobalık tümör hücreleri.

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Model omurgalı saç hücresi sisteminde motor komutlar sırasında afferent nöron aktiviteslerindeki değişiklikleri izlemek için bir protokol açıklıyoruz.

Zebra Balıklarında Yüzme Sırasında Posterior Lateral Line Afferent Neurons'un Aktivitesi

Zebra balığı larva nöromüsküler kavşağı, sinaptik fizyolojiyi incelemek için çekici bir modeldir. Elektrofizyoloji ve optik görüntüleme dahil olmak üzere birçok deneysel tekniğe uygundur. Burada, dik bir epifloresan mikroskobu altında pHluorin bazlı bir prob kullanarak sinaptik iletimi görüntülemek için bir protokol açıklıyoruz.

Diseke Larva Zebra Balığının Nöromüsküler Kavşağında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümünün Canlı Görüntülenmesi

Öğrenin, FRET tabanlı GEVI kullanarak zebra balığı embriyolarında sinir hücrelerinin elektriksel özelliklerini invivo ve invaziv olmayan yöntemle nasıl ölçebilirsiniz. Bu teknik, nörolojik bozuklukların patogenezindeki rolü anlamak için değerlidir.

Canlı Zebra balığı Embriyolarında Biosense Motor Nöron Membranı Potansiyeli

Daha fazla video keşfet