Yaşayan Hücreleri Mühendise Sentetik Biyoloji kullanarak That Programlanabilir Malzemelerle Arayüzü

Bu prosedürlerin genel amacı, genetik modifikasyon ve yüzey fonksiyonelleştirme stratejilerini birleştirerek, programlanabilir malzeme yüzeylerini kontrol etmek ve manipüle etmek için sentetik olarak mühendislikten geçirilmiş E.coli kullanmaktır. Bu yöntem, moleküler tıp ve çevresel izleme gibi alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genetik olarak programlanmış hücrelerin yerel bir ortamı yorumlamasını ve fonksiyonelleştirilmiş bir malzemeyi buna göre değiştirmesini sağlayarak, çok çeşitli uygulamalar için modüler bir araç sunmaktayız.

Bu tekniğin temel avantajı, canlı hücrelerin fonksiyonelleştirilmiş arayüzler aracılığıyla çevrelerindeki koşulları okuyabilen, işleyebilen ve kaydedebilen dinamik sensörler olarak hareket edebilmeleridir. Çözeltileri hazırlayıp biotin üreten E.coli'den biotince zengin süpernatan topladıktan sonra, metin protokolüne uygun olarak 20 µL streptavidin veya SA çözeltisine 1,4 µL SPDP çözeltisi ekleyin. Tüpü alüminyum folyo ile sarın ve SPDP çapraz bağlayıcının bir amino grubu aracılığıyla SA'ya bağlanarak piridilditio-aktive SA oluşturması için oda sıcaklığında bir buçuk saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tüpe 2,4 µL DTT çözeltisi ekleyin ve sülfhidril-aktive SA ile sonuçlanan bir piridin-2-tiyon cleavage işlemi gerçekleşmesi için örneği oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Ardından, 72 µL HRP çözeltisine 7,5 µL SCC çözeltisi ekleyin, alüminyum folyoyla sarın ve oda sıcaklığında bir buçuk saat inkübe edin.

Bu işlem, bir amino grubu tarafından bağlanmış maleimid-aktive HRP ile sonuçlanır. 17 µL LC-LC biotin çözeltisini 200 µL BSA çözeltisi ile karıştırın, tüpü folyo ile sarın ve örneği oda sıcaklığında bir buçuk saat inkübe edin. Bu adım, biotinin bir amit bağı aracılığıyla BSA'ya konjuge olmasını sağlar.

SA-SPDP çözeltisini, HRP-SMCC'yi ve BSA-konjuge biotin çözeltisini spin tüplerindeki ayrı santrifüj konsantratörlerine aktarın. SA-SPDP'yi, tüp hacmi 100 µL'ye ulaşana kadar veya 16 dakika boyunca 10,000 ×g'de santrifüjleyin; ardından spin tüpünü PBS-EDTA kullanarak 500 µL'ye tamamlayın ve santrifüj ile PBS-EDTA ekleme işlemini beş kez daha tekrarlayın. Çözeltiyi 100 µL'ye kadar santrifüjle indirdikten sonra, stok çözeltiyi 4 °C'de saklayın.

HRP SMCC için, tüpleri hacim 25 µL'ye düşene kadar veya 16 dakika boyunca 10,000 ×g'de santrifüjleyin. Santrifüj işlemini ve PBS eklemesini beş kez daha tekrarlamadan önce, santrifüj tüpünü PBS kullanarak 4500 µL'ye tamamlayın. Çözeltiyi 100 µL'ye kadar çöktürdükten sonra, stok çözeltiyi 4 °C'de saklayın.

BSA biyotin için, hacim 100 µL'ye ulaşana kadar veya 12 dakika boyunca örneği 10,000 ×g hızda santrifüjleyin, ardından spin tüpünü PBS kullanarak 500 µL'ye tamamlayın. Santrifüj ve PBS ekleme işlemini dört kez daha tekrarladıktan sonra, tüpü hacim 100 µL'ye ulaşana kadar veya 12 dakika boyunca santrifüjleyin, ardından tüpe 100 µL PBS ekleyin ve stok çözeltiyi 4 °C'de saklayın. Daha sonra, 10 mg/mL HRP'den 25 µL ile 10 mg/mL SA çözeltisinden 25 µL'yi birleştirin ve tüpü gece boyunca 4 °C'de saklayın, ardından 10 µL BSA biyotin stoğunu 490 µL PBS'ye ekleyerek PBS içinde iki adet BSA biyotin alikotu hazırlayın.

Çözeltiden 100 µL'yi 96 kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa pipetleyin. Plakayı folyo ile sarın ve 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, kuyucuklara 200 µL %0,5 Tween 80 ve BPS ekleyin.

Plakayı oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin, ardından sıvıyı aspire edin ve boşaltın. Yıkama işlemini üç kez tekrarladıktan sonra, her bir kuyucuğa 200 µL %0,5 bloklama çözeltisi ekleyin ve ardından plağı 37 °C'de bir saat inkübe edin. Daha önce olduğu gibi bir yıkama serisini takiben, 12 mL %0,5 bloklama çözeltisini 7,5 µL %0,5 Tween 80 ile karıştırın, ardından bu çözeltiyi SA-HRP stok çözeltisini 1:10.000 oranında dilüe etmek için kullanın.

Seyreltilmiş SA-HRP'den 80 µL'yi 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna pipetleyin, ardından plakanın her bir kuyucuğuna hazırlanan biyotin örneğinden 20 µL ekleyin. Plakayı 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Bu adım, serbest biyotin ile immobilize edilmiş BSA biyotinin SA-HRP bağlanma bölgeleri için kompetitif bağlanmasını sağlar.

Ardından plakayı daha önce olduğu gibi üç kez yıkadıktan sonra; 50 millimolar sodyum asetat, %1 TMB ve %3 hidrojen peroksitten oluşan, 1.000:10:1 oranında 20 milliliter'lik bir çözelti hazırlayın. Çözeltiden her bir kuyucuğa 200 microliter ekleyin, plakayı folyo ile sarın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için her kuyucuğa iki molar sülfürik asitten 50 microliter pipetleyin ve ardından OD 450 değerini ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.

Metin protokolüne göre çözeltilerin hazırlanmasının ardından, 72 µL HRP'ye 7,5 µL LC-LC biotin ekleyin. Çözeltiyi folyo ile sarın ve örneği oda sıcaklığında, ajitasyonla bir buçuk saat boyunca inkübe edin. Bu adım, biotinin bir amit bağı aracılığıyla HRP'ye konjuge olmasını sağlar.

Çözeltiyi, bir santrifüj tüpü içindeki santrifügal konsantratöre aktarın ve hacim 100 µL'ye ulaşana kadar veya 12 dakika boyunca 10.000 ×g'de santrifüjleyin; ardından spin tüpünü 500 µL'ye tamamlamak için PBS kullanın ve santrifüjleme ile tampon ekleme işlemini dört kez tekrarlayın. Daha sonra, 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna, PBS içinde 0,17 µg/mL SA içeren 100 µL ekleyin. Plakayı folyo ile sarın ve 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.

Plaka kuyucuklarını yıkamak için, her bir kuyucuğa 200 µL %0,5 Tween 80 pipetleyin. Plakayı oda sıcaklığında iki dakika boyunca inkübe edin ve sıvıyı dökün. Yıkama işlemini üç kez daha tekrarladıktan sonra, kuyucuklara 200 µL %0,5 kaplama çözeltisi ekleyin.

Kuyucukları daha önce olduğu gibi üç kez yıkamadan önce, plakayı 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Önceden hazırlanan yıkanmış ve konsantre biotin HRP solüsyonunu kullanarak, biotin HRP stok solüsyonunu 1/10.000 oranında seyreltin, ardından 96 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına 80 µL solüsyon ekleyin. Plakanın her bir kuyucuğuna 20 µL hazırlanmış biotin örneği ekleyin ve serbest biotin ile biotin HRP'nin immobilize SA bağlanma bölgeleri için rekabetçi bağlanmasını sağlamak amacıyla plakayı 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.

Kuyucuklar daha önce olduğu gibi üç kez yıkandıktan sonra, 1.000'e 10'a bir oranında 50 millimolar sodyum asetat, %1 TMV ve %3 hidrojen peroksitten oluşan 20 mililitrelik bir çözelti hazırlayın. Plakanın her kuyucuğuna çözeltiden 200 mikrolitre ekleyin, üzerini folyo ile kapatın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin; ardından reaksiyonu durdurmak için her kuyucuğa iki molar sülfürik asitten 50 mikrolitre ekleyin. Son olarak, OD 450 değerini ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.

Mühendislik ürünü indüklenebilir E.coli MG1655 vahşi tip hücreleri, minimal ortamın yanı sıra DTB ve/veya IPTG ile desteklenmiş minimal ortamda büyütüldü ve izlendi. Bu grafikler, 24 saat boyunca her beş dakikada bir ölçülen OD 600 okumalarını göstermektedir. Bu deneyde, mühendislik ürünü hücreler IPTG ile indüklendiğinde indüksiyon profili ölçülebilmesi için bioB geni yerine floresan protein mCherry kullanılmıştır.

Bu sonuçlar, indükleyebilir gen ağının etkinliğini kanıtlamaktadır. Burada, hem dolaylı hem de doğrudan fonksiyonelleştirilmiş yüzey şemaları için biotinin değişen konsantrasyonlarına yanıt olarak OD 450'deki optik sinyaller grafiklenmiştir. Bu deneyde, fonksiyonelleştirilmiş yüzeyi kimyasal olarak modifiye etmek için indüklenmiş mühendislik hücrelerinin ürünleri kullanılmıştır.

Farklı biyotin konsantrasyonları; yabani tip hücreler, pKE1-lacI-bioB plazmidi içeren indüklenmemiş hücreler ve pKE1-lacI-bioB plazmidi içeren indüklenmiş hücreler için fonksiyonelleştirilmiş yüzey ile ölçülen indirekt kontrol şeması olarak sunulmuştur. Bu yöntem uzmanlaşıldığında, hücreler iki günde genetik olarak mühendisliğe tabi tutulabilirken, direkt ve indirekt yüzey fonksiyonelleştirme teknikleri uygun şekilde gerçekleştirildiklerinde her biri beş saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, bakteriyel hücre kültürünün kontaminasyonundan kaçınmaya ve fotobeyazlamayı önlemek için fonksiyonelleştirme sırasında yüzeylerin örtülmesine dikkat edilmesi önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, hem doğrudan hem de dolaylı kontrol şemaları için yüzeylerin nasıl fonksiyonelleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Etidyum bromür ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.