Yaşayan Hücreleri Mühendise Sentetik Biyoloji kullanarak That Programlanabilir Malzemelerle Arayüzü

Bu prosedürlerin genel amacı, genetik modifikasyon ve yüzey işlevselleştirme stratejilerini birleştirerek programlanabilir malzeme yüzeylerini kontrol etmek ve manipüle etmek için sentetik olarak tasarlanmış E.coli'yi kullanmaktır. Bu yöntem, moleküler tıp ve çevresel izleme gibi alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Yerel bir ortamı yorumlamak ve buna göre işlevselleştirilmiş bir materyali değiştirmek için genetik olarak programlanmış hücreleri kullanarak, çok çeşitli uygulamalar için modüler bir araç sağlıyoruz.

Bu tekniğin temel avantajı, canlı hücrelerin, işlevselleştirilmiş arayüzler aracılığıyla çevrelerindeki koşulları okuyabilen, işleyebilen ve kaydedebilen dinamik sensörler olarak hareket edebilmesidir. Çözeltileri hazırladıktan ve biyotin üreten E.coli'den biyotin ile zenginleştirilmiş süpernatanı topladıktan sonra, metin protokolüne göre, 20 mikrolitre streptavidin veya SA çözeltisine 1.4 mikrolitre SPDP çözeltisi ekleyin. Tüpü alüminyum folyoya sarın ve SPDP çapraz bağlayıcısının bir amino grubu aracılığıyla SA'ya bağlanmasına izin vermek için oda sıcaklığında bir buçuk saat inkübe edin ve piridildidio ile aktive edilmiş bir SA oluşturun. İnkübasyonun ardından, tüpe 2.4 mikrolitre DTT çözeltisi ekleyin ve sülfhidril ile aktive edilmiş bir SA ile sonuçlanan bir piridin-2-tion bölünmesine izin vermek için numuneyi oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra, 72 mikrolitre HRP çözeltisine 7.5 mikrolitre SCC çözeltisi ekleyin, alüminyum folyoya sarın ve oda sıcaklığında bir buçuk saat inkübe edin.

Bu, bir amino grubu tarafından bağlanan maleimid ile aktive edilmiş bir HRP ile sonuçlanır. 17 mikrolitre LC-LC biotin solüsyonunu 200 mikrolitre BSA solüsyonu ile karıştırın, tüpü folyoya sarın ve numuneyi oda sıcaklığında bir buçuk saat inkübe edin. Bu adım, biyotinin bir amid bağı yoluyla BSA'ya eşlenik olmasına izin verir.

SA-SPDP çözümünü, HRP-SMCC'yi ve BSA ile konjuge biyotin çözeltisini spin tüplerindeki ayrı santrifüj yoğunlaştırıcılara aktarın. SA-SPDP'yi tüp hacmi 100 mikrolitreye ulaşana kadar veya 16 dakika boyunca 10.000 kez g'de santrifüjleyin, ardından sıkma tüpünü PBS-EDTA kullanarak 500 mikrolitreye kadar doldurun ve sıkma işlemini beş kez daha tekrarlayın. Çözeltiyi 100 mikrolitreye düşürdükten sonra, stoğu dört santigrat derecede saklayın.

HRP SMCC için, tüpleri hacim 25 mikrolitreye ulaşana kadar veya 16 dakika boyunca 10.000 kez g'de santrifüjleyin. Sıkma tüpünü PBS kullanarak 4500 mikrolitreye kadar doldurun ve sıkmayı tekrarlamadan ve PBS ilavesini beş kez daha yapın. Çözeltiyi 100 mikrolitreye düşürdükten sonra, stoğu dört santigrat derecede saklayın.

BSA biotin için, hacim 100 mikrolitreye ulaşana kadar veya 12 dakika boyunca numuneyi 10.000 kez g'de santrifüjleyin, ardından PBS kullanarak sıkma tüpünü 500 mikrolitreye kadar doldurun. Sıkma işlemini ve PBS ilavesini dört kez daha tekrarladıktan sonra, hacmi 100 mikrolitreye ulaşana kadar veya 12 dakika boyunca tüpü santrifüjleyin, ardından tüpe 100 mikrolitre PBS ekleyin ve stoğu dört santigrat derecede saklayın. Daha sonra, mililitre başına 10 miligram HRP'nin 25 mikrolitresini mililitre SA çözeltisi başına 25 mikrolitre 10 miligram ile birleştirin ve tüpü gece boyunca dört santigrat derecede saklayın, daha sonra 10 mikrolitre BSA biyotin stoğu ekleyerek PBS'de iki BSA biyotin alikotunu hazırlayın

96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre çözelti pipetleyin. Plakayı folyoya sarın ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, kuyucuklara 200 mikrolitre% 05 Tween 80 ve BPS ekleyin.

Plakayı oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin, ardından sıvıyı aspire edin ve boşaltın. Yıkamayı üç kez tekrarladıktan sonra, oyukların her birine 200 mikrolitre% 0.5 muhafaza çözeltisi ekleyin, ardından plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha önce olduğu gibi başka bir yıkama turunun ardından, 12 mililitre %05 muhafaza solüsyonunu 7,5 mikrolitre %05 Tween 80 ile karıştırın, ardından bu solüsyonu SA-HRP stok solüsyonunu bir ila 10.000 arasında seyreltmek için kullanın.

96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 80 mikrolitre seyreltilmiş SA-HRP'yi pipetleyin, ardından plakanın her bir oyuğuna 20 mikrolitre hazırlanan biyotin numunesi ekleyin. Plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu adım, SA-HRP bağlanma bölgeleri için serbest biyotin ve hareketsizleştirilmiş BSA biyotin arasında rekabetçi bağlanmaya izin verir.

Daha sonra plakayı daha önce olduğu gibi üç kez yıkadıktan sonra, 1.000 ila 10 ila bir oranında 20 mililitrelik 50 milimolar sodyum asetat,% 1 TMB ve% 3 hidrojen peroksit çözeltisi hazırlayın. Plakanın her bir oyuğuna 200 mikrolitre çözelti ekleyin, folyoya sarın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için her bir oyuğa 50 mikrolitre iki molar sülfürik asit pipetleyin, ardından OD 450'yi ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.

Metin protokolüne göre çözeltilerin hazırlanmasını takiben, 72 mikrolitre HRP'ye 7,5 mikrolitre LC-LC biotin ekleyin. Çözeltiyi folyoya sarın ve numuneyi oda sıcaklığında çalkalama ile bir buçuk saat inkübe edin. Bu adım, biyotinin bir amid bağı yoluyla HRP'ye eşlenmesine neden olur.

Çözeltiyi bir döndürme tüpü içindeki bir santrifüj yoğunlaştırıcıya aktarın ve çözeltiyi hacim 100 mikrolitreye ulaşana kadar veya 12 dakika boyunca 10.000 kez g'de santrifüjleyin, ardından döndürme tüpünü 500 mikrolitreye doldurmak için PBS kullanın ve santrifüjleme ve tampon ilavesini dört kez tekrarlayın. Daha sonra, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna PBS'de mililitre SA başına 100 mikrolitre 0.17 mikrogram ekleyin. Plakayı folyoya sarın ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Plakanın kuyularını yıkamak için, her bir oyuğa 200 mikrolitre %05 Tween 80 pipetleyin. Plakayı oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin ve sıvıyı boşaltın. Yıkamayı üç kez daha tekrarladıktan sonra,% 0.5'lik muhafaza çözeltisinden 200 mikrolitre ekleyin.

Kuyucukları daha önce olduğu gibi üç kez yıkamadan önce plakayı 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Önceden hazırlanmış yıkanmış ve konsantre edilmiş biotin HRP çözeltisini kullanarak, biotin HRP stok çözeltisini bir ila 10.000 oranında seyreltin, ardından 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına 80 mikrolitre çözelti ekleyin. Plakanın her bir oyuğuna 20 mikrolitre hazırlanmış biyotin numunesi ekleyin ve hareketsizleştirilmiş SA bağlanma bölgeleri için serbest biyotin ve biyotin HRP arasında rekabetçi bağlanmaya izin vermek için plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Kuyuları daha önce olduğu gibi üç kez yıkadıktan sonra, 1.000 ila 10 ila bir oranında 20 mililitrelik 50 milimolar sodyum asetat,% 1 TMV ve% 3 hidrojen peroksit çözeltisi hazırlayın. Plakanın her bir oyuğuna 200 mikrolitre çözelti ekleyin, folyo ile örtün ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin, ardından reaksiyonu durdurmak için her oyuğa 50 mikrolitre iki molar sülfürik asit ekleyin. Son olarak, OD 450'yi ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.

Tasarlanmış indüklenebilir E.coli MG1655 vahşi tip hücreler, DTB ve / veya IPTG ile desteklenmiş minimum ortamda ve ayrıca minimal ortamda büyütüldü ve izlendi. Bu grafikler, 24 saat boyunca her beş dakikada bir ölçülen OD 600 okumasını gösterir. Bu deneyde, bioB geninin yerine floresan protein mCherry kullanıldı, böylece mühendislik hücreleri IPTG ile indüklendiğinde indüksiyon profili ölçülebildi.

Bu sonuçlar, indüklenebilir gen ağının etkinliğini göstermektedir. Burada çizilenler, hem dolaylı hem de doğrudan işlevselleştirilmiş yüzey şemaları için değişen biyotin konsantrasyonlarına yanıt olarak OD 450'deki optik sinyallerdir. Bu deneyde, işlevselleştirilmiş yüzeyi kimyasal olarak değiştirmek için indüklenmiş mühendislik hücrelerinin ürünleri kullanıldı.

Farklı biyotin konsantrasyonları, yabani tip hücreler, pKE1-lacI-bioB plazmidi içeren indüklenmemiş hücreler ve pKE1-lacI-bioB plazmidini içeren indüklenmiş hücreler için dolaylı kontrol şeması işlevselleştirilmiş yüzey ile ölçüldüğü gibi sunulur. Bir kez ustalaştıktan sonra, hücreler iki gün içinde genetik olarak tasarlanabilirken, doğrudan ve dolaylı yüzey işlevselleştirme tekniklerinin her biri, uygun şekilde gerçekleştirilirse beş saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, foto ağartmayı önlemek için bakteri hücre kültürünün kontaminasyonunu önlemeyi ve işlevselleştirme sırasında yüzeyleri kaplamayı unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, hem doğrudan hem de dolaylı kontrol şemaları için yüzeylerin nasıl işlevselleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Etidyum bromür ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.