Name: Yaşayan Hücreleri Mühendise Sentetik Biyoloji kullanarak That Programlanabilir Malzemelerle Arayüzü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Öğrenin sentetik biyoloji ile mühendislik E. coli hücrelerini programlanabilir malzemelerle arayüzleme yöntemini. Genetik modifikasyon ve yüzey fonksiyonelleştirme stratejileri moleküler tıp ve çevre izleme için dinamik sensörler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar minnetle ABD Bilimsel Araştırma Hava Kuvvetleri Ofisi ödül FA9550-13-1-0108 destek kabul. Yazarlar ayrıca Virginia Politeknik Enstitüsü ve Devlet Üniversitesi&#39;nde Kritik Teknoloji ve Uygulamalı Bilimler Enstitüsü&#39;nde ve Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Research fon, ABD Donanma Araştırma Ofisi ödül N00014-15-1-2502 destek kabul Burs Programı, ödül sayısı 1.607.310.

<ol><li>Zhang, R., Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. -H., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+Surface+Chemistry+with+Engineered+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth.+Biol%22%5BJournal%5D)">Programming Surface Chemistry with Engineered Cells.</a> ACS Synth. Biol. , (2016).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+graphene+oxide+films+used+as+matrix+of+MALDI-TOF-MS+for+detection+of+octachlorodibenzo-p-dioxin%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Chem. Commun. 46, 6974-6976 (2010).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Cost+Detection+of+Zika+Virus+Using+Programmable+Biomolecular+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.</a> Cell. 165, 1255-1266 (2016).</li>
<li>Bähring, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Sensing+Properties+of+a+Self-Assembled+Supramolecular+Oligomer%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">Design and Sensing Properties of a Self-Assembled Supramolecular Oligomer.</a> Chem. Eur. J. 22, 1958-1967 (2016).</li>
<li>Nicolau Jr, D. V., Armitage, J. P., Maini, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+persistence+and+the+optimality+of+run-and-tumble+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Directional persistence and the optimality of run-and-tumble chemotaxis.</a> Comp. Biol. Chem. 33, 269-274 (2009).</li>
<li>Du, J., Shao, Z., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+microbial+factories+for+synthesis+of+value-added+products%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ind.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering microbial factories for synthesis of value-added products.</a> J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 38, 873-890 (2011).</li>
<li>Kim, H., Kim, M. J. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/7365478/">Electric Field Control of Bacteria-Powered Microrobots Using a Static Obstacle Avoidance Algorithm.</a> IEEE Trans. Rob. 32, 125-137 (2016).</li>
<li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+genetic+toggle+switch+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.</a> Nature. 403, 339-342 (2000).</li>
<li>Heyde, K. C., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+Host-Microbiome+Interactions+using+an+in+Silico+Model+of+Biomimetic+Robots+and+Engineered+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Exploring Host-Microbiome Interactions using an in Silico Model of Biomimetic Robots and Engineered Living Cells.</a> Sci. Rep. 5, 11988(2015).</li>
<li>Rice, M. K., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+biological+nanomaterials+using+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Tech.+Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Creating biological nanomaterials using synthetic biology.</a> Sci. Tech. Adv. Mater. 15, 014401(2014).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin.+3.+The+nature+of+the+biotin-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site.</a> Biochem. J. 89, 599-609 (1963).</li>
<li>Mesulam, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramethyl+benzidine+for+horseradish+peroxidase+neurohistochemistry%3A+a+non-carcinogenic+blue+reaction+product+with+superior+sensitivity+for+visualizing+neural+afferents+and+efferents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Tetramethyl benzidine for horseradish peroxidase neurohistochemistry: a non-carcinogenic blue reaction product with superior sensitivity for visualizing neural afferents and efferents.</a> J Histochem. Cytochem. 26, 106-117 (1978).</li>
<li>Litcofsky, K. D., Afeyan, R. B., Krom, R. J., Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+plug-and-play+methodology+for+constructing+and+modifying+synthetic+gene+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Iterative plug-and-play methodology for constructing and modifying synthetic gene networks.</a> Nat. Meth. 9, 1077-1080 (2012).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+Chemical+Synthesis%2C+Assembly%2C+and+Cloning+of+a+Mycoplasma+genitalium+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome.</a> Science. 319, 1215-1220 (2008).</li>
<li>Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biotin-%28strept%29avidin+system%3A+principles+and+applications+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology.</a> Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).</li>
<li>Nerurkar, L. S., Namba, M., Brashears, G., Jacob,, Lee, A. J., Sever, Y. J., L, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+herpes+simplex+virus+in+clinical+specimens+by+use+of+capture+biotin-streptavidin+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Micro%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of herpes simplex virus in clinical specimens by use of capture biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay.</a> J. Clin. Micro. 20, 109-114 (1984).</li>
<li>Cui, Y., Wei, Q., Park, H., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanowire+Nanosensors+for+Highly+Sensitive+and+Selective+Detection+of+Biological+and+Chemical+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanowire Nanosensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Biological and Chemical Species.</a> Science. 293, 1289-1292 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Biz bir fonksiyonelleştirilmiş malzeme yüzeyi ile yaşayan mühendislik hücrelerin arayüz için yeni bir strateji sundu. Bu IPTG ile indüklenmiştir zaman biyotin yüksek seviyelerde sentez edebilme yeteneğine sahip olan bir hücre hattı geliştirilmesi ile gerçekleştirildi. biotin yüksek seviyeler daha sonra fonksiyonalize yüzeyini değiştirmek için kullanılabilir. Protokoller E.coli hücre hattını mühendis nasıl ve iki farklı fonksiyonalize yüzeyler oluşturmak için nasıl ayrıntılı. Bu prot...

Burada, bir mühendislik hücre hattından bir kimyasal sinyali cevap verebilen bir programlanabilir alt tabakanın geliştirilmesi için prosedürler bildirmektedir. 1 Biz sentetik tasarlanmış Escherichia coli (E. coli) hücreler tarafından üretilen biyotin yanıt veren bir biyotin-streptavidin arayüz oluşturarak bunu. Daha önce, programlanabilir yüzeyler toksin tespiti 2 ve nokta-bakım teşhisi 3 savunma ve güvenlik için geniş bir uygulama yelpazesi için tasarlanmış edilmiştir. Programlanabilir yüzeyler sensörler ve aktüatörler olarak yararlı olabilir 4, onlar farklı çevresel zorluklara uyum yeteneği ile donatarak, &quot;akıllı&quot; hale getirilebilir. Bunun aksine, örneğin, E. coli gibi daha basit bir mikroorganizmalar doğal uyum ve karmaşık ve çoğu zaman, beklenmedik çözümlerle zorluklara yanıt yeteneğine sahiptir. Bu uyum E. sağladıkompleks gen ağları tarafından kontrol coli popülasyonları, maliyet-etkin bir kaynak aramaya, 5 katma değerli ürünler, 6 ve hatta güç mikro ölçekli robotik oluşturun. 7 programlanabilir yüzeylerin kullanımı ile yaşayan hücrelerin adaptif avantajlarını birleştirerek, farklı çevre koşullarına cevap verebilecek bir akıllı substrat oluşturabilirsiniz. Sentetik biyoloji canlıların davranışlarını programlamak için araştırmacılara yeni yetenekler vermiştir. yeni gen düzenleyici ağları içeren hücrelerin mühendislik, araştırmacılar programlanmış bir dizi davranışı gösteren hücreleri tasarlayabilirsiniz. Temel araştırma ötesinde 8, 9, bu davranışlar gibi katma değerli ürünler malzeme düzeneğini kontrol ve biyolojik üretmek gibi uygulamalar için kullanılabilir. 10 Burada, sentetik biyoloji araçlarını kullanılan ayrıntılarıyla nasıl trindüksiyondan sonra biotin sentezleyen bir E. coli suşu disi. Bu soy, bir plazmid, pKE1-lacl-biyobalistik monte sınırlama enzimi klonlama yöntemleri kullanılarak geliştirilmiştir. E. coli K-12 MG1655 dönüştürülmüştür, bu plasmid, biyobalistik, biyotin sentezi için gerekli bir enzimin, yüksek seviyelerde ifade yeteneğine sahip hücrelerin endows. dönüştürülmüş hücreler izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ile teşvik ve bir biyotin ön, destiobiyotin (DTB) ile sağlanan zaman, biotin yüksek seviyelerde üretildi. streptavidin, biyotin en bağlanma etkileşimi doğada bulunan güçlü kovalent olmayan bağlar biridir. örneğin, biyotin-streptavidin interaksiyonundan iyi karakterize edilmiş ve son derece biyoteknoloji kullanılan hem de. Bu yazının içinde 11 biz duygusu ve işlevsel yüzey hücre üretilen biyotin algılamak için biyotin-streptavidin etkileşimi kullanan iki strateji sunuyoruz. Biz&quot;Dolaylı&quot; ve &quot;doğrudan&quot; kontrol programları gibi bu zıt yüzeylere bakın. Dolaylı kontrol şeması, hücre üretilen biyotin konjuge ve bağlayıcı siteler streptavidin bir polistiren yüzey üzerine immobilize edilmiş biotin ile rekabet eder. Buna ek olarak, streptavidin-yaban turpu peroksidaz (HRP) ile konjuge edilir. HRP 3, 3 &#39;, 5, 5&#39;-tetrametilbenzidin (TMB), 450 nm (OD 450), spektral emicilik (yani, optik yoğunluk) miktarının izlenebilir bir optik sinyalin, 12 üretilmesi için değiştirir. Böylece, dolaylı kontrol düzeni araştırmacılar OD 450 sinyal attentuation izleyerek hücre üretilen biyotin ölçmek için sağlar. doğrudan kontrol şeması bir malzeme yüzeyine doğrudan streptavidin hareketsiz hale ve bağlayıcı siteleri streptavidin için rekabet hücre üretilen biyotin ve biyotinile HRP izin vererek streptavidin-biotin olay patlatır. Yine,Hücre üretilen biyotin nispi seviyeleri, bir OD 450 sinyalinin ölçülmesi ile takip edilir. Birlikte ele alındığında, mühendislikten geçirilen hücreler ve fonksiyonalize yüzeyler US canlı hücre ağları uyararak programlanabilir yüzey özelliklerini kontrol sağlar. Diğer bir deyişle, biz birlikte bu sistemleri birbirine bağlayarak bir mühendislik malzemesi arayüzü canlıların uyum ve güvenilirlik ve şartname yararlanır bir sistem oluşturduk.

<table><tbody><tr><td>LB Et Suyu, Değirmenci&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-795-027</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9744500</td><td></td></tr><tr><td>Karbenisilin&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>M9, Minimimal Tuzlar, 5x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td></td></tr><tr><td>Kasamino Asitler&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1424-100</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat, Susuz</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür, Dihidrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroz (D-Glikoz), Susuz</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>NEB Turbo Hücre Hattı</td><td>New England Biolabs</td><td>C2984l</td><td></td></tr><tr><td>Oligonükleotid Primerler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>25N sentezi, DSL saflaştırma</td></tr><tr><td>Q5 Yüksek Kaliteli Polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Reaksiyon Tamponu</td><td>New England Biolabs</td><td>B9027S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Çözelti Karışımı</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioexpress</td><td>E-3120-125</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum Bromür, %1</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>Jel Ekstraksiyon Kitleri</td><td>Epoch Biolabs</td><td>2260250</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plazmid DNA Miniprep Kiti</td><td>Epoch Biolabs</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>AatII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0117S</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Cutsmart Tampon</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz Reaksiyon Tamponu</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>ColiRolle Cam Kaplama Boncukları&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>7101-3</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil ve beta;-D-1-tiyokalaktopiranosit (IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Desthiobiotin (DTB)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16129</td><td></td></tr><tr><td>Süksinimidil Trans-4- (maleimidilmetil) Sikloheksan-1-Karboksilat (SMCC)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S1534</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit (DMSO)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Süksinimidil 3- (2-piridildithio) Propiyonat (SPDP) &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S1531</td><td></td></tr><tr><td>NHS-LC-LC-biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21343</td><td></td></tr><tr><td>Yaban turpu Peroksidaz (HRP)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31490</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS), 10x Çözelti</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin (SA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21145</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Ditiyotreitol (DTT)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetataasetik asit (EDTA) &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen Peroksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-4</td><td></td></tr><tr><td>3, 3 ', 5, 5'-tetrametilbenzidin (TMB)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>AC229280050</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 500 Santrifüj Konsantratörler&nbsp;</td><td>Viva Ürünleri</td><td>VS0192</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Asetat, Susuz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyulu Polistiren Plakalar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>266120</td><td></td></tr></tbody></table>

yaşayan hücreleri mühendise sentetik biyoloji kullanarak that programlanabilir malzemelerle arayüzü

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Biz mühendislik hücreler işlevsel yüzey malzeme özelliklerini kontrol sağlayan bir abiyotik-biyotik bir arayüz geliştirdik. E. coli hücrelerinin bir sentetik tasarlanmış suşu ve işlevselleştirilmiş ara yüzüne: Bu sistem, iki modül oluşturarak yapılır. Bu metinde yer alan, biz detay genetik moleküler klonlama stratejileri kullanarak E.coli suşu içinde seçilen davranışları mühendislik için bir protokol. Bir kimyasal uyarıcı maruz kaldığında kez geliştirilen bu suş biotin yüksek seviyelerde üretir. Buna ek olarak, hücre sentezlenmiş biyotin cevap verebilecek her biri iki farklı işlevselleştirilmiş yüzeyler oluşturmak için ayrıntılarıyla protokolleri. Birlikte ele alındığında, biz cansız yüzeylerde malzeme bileşimi ve montaj kontrol hücreleri mühendislik sağlayan bir bağlantılı, abiyotik-biyotik sistemi oluşturmak için bir metodoloji sunuyoruz.

Temsilcisi sonuçları ekteki beş şekillerde sunulmaktadır. Okuyucu görsel sentetik mühendislik E.coli suşu oluşturmak için kritik adımları böylece Öncelikle, biz grafiksel klonlama işlemini (Şekil 1) sunuyoruz. Hücrelerin popülasyon dinamiklerini karakterize etmek amacıyla, nüfusun, 600 nm (OD 600) de optik yoğunluk ölçümü ile üretilen bir büyüme eğrisi (Şekil 2) bulunur. Sonra, biz düzenleyici gen ağı bize optik IPTG ile indüksiyon üz...

Bu yazıda mühendislik hücreleri ve sentetik kontrol ve programlanabilir malzeme yüzeylerini işlemek için E. coli mühendislik enable işlevselleştirilmiş yüzeylerin geliştirilmesi için bir dizi protokol sunar.

Yaşayan Hücreleri Mühendise Sentetik Biyoloji kullanarak That Programlanabilir Malzemelerle Arayüzü

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Bu prosedürlerin genel amacı, genetik modifikasyon ve yüzey fonksiyonelleştirme stratejilerini birleştirerek, programlanabilir malzeme yüzeylerini kontrol etmek ve manipüle etmek için sentetik olarak mühendislikten geçirilmiş E.coli kullanmaktır. Bu yöntem, moleküler tıp ve çevresel izleme gibi alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genetik olarak programlanmış hücrelerin yerel bir ortamı yorumlamasını ve fonksiyonelleştirilmiş bir malzemeyi buna göre değiştirmesini sağlayarak, çok çeşitli uygulamalar için modüler bir araç sunmaktayız.Bu tekniğin temel avantajı, canlı hücrelerin fonksiyonelleştirilmiş arayüzler aracılığıyla çevrelerindeki koşulları okuyabilen, işleyebilen ve kaydedebilen dinamik sensörler olarak hareket edebilmeleridir. Çözeltileri hazırlayıp biotin üreten E.coli'den biotince zengin süpernatan topladıktan sonra, metin protokolüne uygun olarak 20 µL streptavidin veya SA çözeltisine 1,4 µL SPDP çözeltisi ekleyin. Tüpü alüminyum folyo ile sarın ve SPDP çapraz bağlayıcının bir amino grubu aracılığıyla SA'ya bağlanarak piridilditio-aktive SA oluşturması için oda sıcaklığında bir buçuk saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tüpe 2,4 µL DTT çözeltisi ekleyin ve sülfhidril-aktive SA ile sonuçlanan bir piridin-2-tiyon cleavage işlemi gerçekleşmesi için örneği oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Ardından, 72 µL HRP çözeltisine 7,5 µL SCC çözeltisi ekleyin, alüminyum folyoyla sarın ve oda sıcaklığında bir buçuk saat inkübe edin.Bu işlem, bir amino grubu tarafından bağlanmış maleimid-aktive HRP ile sonuçlanır. 17 µL LC-LC biotin çözeltisini 200 µL BSA çözeltisi ile karıştırın, tüpü folyo ile sarın ve örneği oda sıcaklığında bir buçuk saat inkübe edin. Bu adım, biotinin bir amit bağı aracılığıyla BSA'ya konjuge olmasını sağlar.SA-SPDP çözeltisini, HRP-SMCC'yi ve BSA-konjuge biotin çözeltisini spin tüplerindeki ayrı santrifüj konsantratörlerine aktarın. SA-SPDP'yi, tüp hacmi 100 µL'ye ulaşana kadar veya 16 dakika boyunca 10,000 ×g'de santrifüjleyin; ardından spin tüpünü PBS-EDTA kullanarak 500 µL'ye tamamlayın ve santrifüj ile PBS-EDTA ekleme işlemini beş kez daha tekrarlayın. Çözeltiyi 100 µL'ye kadar santrifüjle indirdikten sonra, stok çözeltiyi 4 °C'de saklayın.HRP SMCC için, tüpleri hacim 25 µL'ye düşene kadar veya 16 dakika boyunca 10,000 ×g'de santrifüjleyin. Santrifüj işlemini ve PBS eklemesini beş kez daha tekrarlamadan önce, santrifüj tüpünü PBS kullanarak 4500 µL'ye tamamlayın. Çözeltiyi 100 µL'ye kadar çöktürdükten sonra, stok çözeltiyi 4 °C'de saklayın.BSA biyotin için, hacim 100 µL'ye ulaşana kadar veya 12 dakika boyunca örneği 10,000 ×g hızda santrifüjleyin, ardından spin tüpünü PBS kullanarak 500 µL'ye tamamlayın. Santrifüj ve PBS ekleme işlemini dört kez daha tekrarladıktan sonra, tüpü hacim 100 µL'ye ulaşana kadar veya 12 dakika boyunca santrifüjleyin, ardından tüpe 100 µL PBS ekleyin ve stok çözeltiyi 4 °C'de saklayın. Daha sonra, 10 mg/mL HRP'den 25 µL ile 10 mg/mL SA çözeltisinden 25 µL'yi birleştirin ve tüpü gece boyunca 4 °C'de saklayın, ardından 10 µL BSA biyotin stoğunu 490 µL PBS'ye ekleyerek PBS içinde iki adet BSA biyotin alikotu hazırlayın.Çözeltiden 100 µL'yi 96 kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa pipetleyin. Plakayı folyo ile sarın ve 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, kuyucuklara 200 µL %0,5 Tween 80 ve BPS ekleyin.Plakayı oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin, ardından sıvıyı aspire edin ve boşaltın. Yıkama işlemini üç kez tekrarladıktan sonra, her bir kuyucuğa 200 µL %0,5 bloklama çözeltisi ekleyin ve ardından plağı 37 °C'de bir saat inkübe edin. Daha önce olduğu gibi bir yıkama serisini takiben, 12 mL %0,5 bloklama çözeltisini 7,5 µL %0,5 Tween 80 ile karıştırın, ardından bu çözeltiyi SA-HRP stok çözeltisini 1:10.000 oranında dilüe etmek için kullanın.Seyreltilmiş SA-HRP'den 80 µL'yi 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna pipetleyin, ardından plakanın her bir kuyucuğuna hazırlanan biyotin örneğinden 20 µL ekleyin. Plakayı 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Bu adım, serbest biyotin ile immobilize edilmiş BSA biyotinin SA-HRP bağlanma bölgeleri için kompetitif bağlanmasını sağlar.Ardından plakayı daha önce olduğu gibi üç kez yıkadıktan sonra; 50 millimolar sodyum asetat, %1 TMB ve %3 hidrojen peroksitten oluşan, 1.000:10:1 oranında 20 milliliter'lik bir çözelti hazırlayın. Çözeltiden her bir kuyucuğa 200 microliter ekleyin, plakayı folyo ile sarın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için her kuyucuğa iki molar sülfürik asitten 50 microliter pipetleyin ve ardından OD 450 değerini ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.Metin protokolüne göre çözeltilerin hazırlanmasının ardından, 72 µL HRP'ye 7,5 µL LC-LC biotin ekleyin. Çözeltiyi folyo ile sarın ve örneği oda sıcaklığında, ajitasyonla bir buçuk saat boyunca inkübe edin. Bu adım, biotinin bir amit bağı aracılığıyla HRP'ye konjuge olmasını sağlar.Çözeltiyi, bir santrifüj tüpü içindeki santrifügal konsantratöre aktarın ve hacim 100 µL'ye ulaşana kadar veya 12 dakika boyunca 10.000 ×g'de santrifüjleyin; ardından spin tüpünü 500 µL'ye tamamlamak için PBS kullanın ve santrifüjleme ile tampon ekleme işlemini dört kez tekrarlayın. Daha sonra, 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna, PBS içinde 0,17 µg/mL SA içeren 100 µL ekleyin. Plakayı folyo ile sarın ve 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.Plaka kuyucuklarını yıkamak için, her bir kuyucuğa 200 µL %0,5 Tween 80 pipetleyin. Plakayı oda sıcaklığında iki dakika boyunca inkübe edin ve sıvıyı dökün. Yıkama işlemini üç kez daha tekrarladıktan sonra, kuyucuklara 200 µL %0,5 kaplama çözeltisi ekleyin.Kuyucukları daha önce olduğu gibi üç kez yıkamadan önce, plakayı 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Önceden hazırlanan yıkanmış ve konsantre biotin HRP solüsyonunu kullanarak, biotin HRP stok solüsyonunu 1/10.000 oranında seyreltin, ardından 96 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına 80 µL solüsyon ekleyin. Plakanın her bir kuyucuğuna 20 µL hazırlanmış biotin örneği ekleyin ve serbest biotin ile biotin HRP'nin immobilize SA bağlanma bölgeleri için rekabetçi bağlanmasını sağlamak amacıyla plakayı 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.Kuyucuklar daha önce olduğu gibi üç kez yıkandıktan sonra, 1.000'e 10'a bir oranında 50 millimolar sodyum asetat, %1 TMV ve %3 hidrojen peroksitten oluşan 20 mililitrelik bir çözelti hazırlayın. Plakanın her kuyucuğuna çözeltiden 200 mikrolitre ekleyin, üzerini folyo ile kapatın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin; ardından reaksiyonu durdurmak için her kuyucuğa iki molar sülfürik asitten 50 mikrolitre ekleyin. Son olarak, OD 450 değerini ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.Mühendislik ürünü indüklenebilir E.coli MG1655 vahşi tip hücreleri, minimal ortamın yanı sıra DTB ve/veya IPTG ile desteklenmiş minimal ortamda büyütüldü ve izlendi. Bu grafikler, 24 saat boyunca her beş dakikada bir ölçülen OD 600 okumalarını göstermektedir. Bu deneyde, mühendislik ürünü hücreler IPTG ile indüklendiğinde indüksiyon profili ölçülebilmesi için bioB geni yerine floresan protein mCherry kullanılmıştır.Bu sonuçlar, indükleyebilir gen ağının etkinliğini kanıtlamaktadır. Burada, hem dolaylı hem de doğrudan fonksiyonelleştirilmiş yüzey şemaları için biotinin değişen konsantrasyonlarına yanıt olarak OD 450'deki optik sinyaller grafiklenmiştir. Bu deneyde, fonksiyonelleştirilmiş yüzeyi kimyasal olarak modifiye etmek için indüklenmiş mühendislik hücrelerinin ürünleri kullanılmıştır.Farklı biyotin konsantrasyonları; yabani tip hücreler, pKE1-lacI-bioB plazmidi içeren indüklenmemiş hücreler ve pKE1-lacI-bioB plazmidi içeren indüklenmiş hücreler için fonksiyonelleştirilmiş yüzey ile ölçülen indirekt kontrol şeması olarak sunulmuştur. Bu yöntem uzmanlaşıldığında, hücreler iki günde genetik olarak mühendisliğe tabi tutulabilirken, direkt ve indirekt yüzey fonksiyonelleştirme teknikleri uygun şekilde gerçekleştirildiklerinde her biri beş saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, bakteriyel hücre kültürünün kontaminasyonundan kaçınmaya ve fotobeyazlamayı önlemek için fonksiyonelleştirme sırasında yüzeylerin örtülmesine dikkat edilmesi önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, hem doğrudan hem de dolaylı kontrol şemaları için yüzeylerin nasıl fonksiyonelleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Etidyum bromür ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

using-synthetic-biology-to-engineer-living-cells-that-interface-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu beş günlük protokolü bütün adımlar, ekipman, ve esaslı etkili endojen Escherichia coli sıfırdan TX-TL hücre serbest ifade sistemi oluşturmak ve çalıştırmak için gerekli ek yazılım özetliyor. Reaktif ile protokol 8 kurulumu için saat veya daha az bir tepki toplamak ve işlem verileri alır.

Bir uygulama için Protokoller Escherichia coli Tabanlı TX-TL Hücre-Özgür İfade Sistemi

Sıvı işleme robotlar üzerinde modüler bir klon DNA derleme yöntemi kullanılarak modüler DNA "aygıt" derleme gerçekleştirmek için otomatik bir iş akışı burada anlatılan. Protokol bir sezgisel yazılım aracı kullanarak iki sıvı taşıma platformları göstermek Kombinatorik DNA aygıt kitaplığı oluşturma için sıvı işleyicisi picklists üretmek için kullanır.

Robot sıvı işleme derleme modüler DNA cihazların otomatik

Biz bir basit tekniğinde gen uzunluğunda DNA moleküllerinin immobilizasyon için boş hücre gen ifade deneyler biochips üzerinde gerçekleştirmek için kullanılan bir yüzey üzerinde açıklayınız.

Genlerin Multistep Strand deplasman litografi kullanarak işlevsel yüzey immobilizasyon

PdMS tabanlı, çok katmanlı, mikroakışkan bir cihazın in vitro transkripsiyon ve çeviri (IVTT) reaksiyonlarının uzun süreler boyunca gerçekleştirilmesine olanak sağlayan üretim süreci anlatılmaktadır. Ayrıca, bu reaksiyonları uzun süre ler boyunca otomatikleştirmek ve korumak için gereken donanım ve yazılıma kapsamlı bir genel bakış sağlanır.

Uzun Süreli Hücresiz Gen Ekspresyonunun İletimi için Çok Katmanlı Mikroakışkan Platform

Bu protokol, RNA ve protein üreten sentetik hücrelerin aşağıdan yukarıya hazırlanması için yöntem, malzeme, ekipman ve adımları açıklamaktadır. Sentetik hücrelerin iç sulu bölmesi bir lipid bilayer içinde kapsüllenmiş S30 bakteriyel lizat içeriyordu (yani, istikrarlı lipozomlar), bir su-in-oil emülsiyon transferi yöntemi kullanarak.

Hücre Serbest Bakteriyel Özler, Lipozomlar ve Emülsiyon Transferi Kullanarak Protein Üreten Sentetik Hücreler Hazırlama

İyi karakterize edilmiş genetik parçalar, yeni genetik devrelerin tasarımı için gereklidir. Burada, genetik parçaları hızlı bir şekilde karakterize etmek için uygun maliyetli, yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz. Yöntemimiz, hücresiz lizatları, klonlamayı önlemek için lineer DNA'yı ve verimi artırmak ve reaksiyon hacimlerini azaltmak için akustik sıvı işlemeyi birleştirerek maliyeti ve zamanı azaltır.

Genetik Parçaların Hücresiz Sistemlerle Hızlı Karakterizasyonu

Bu protokol, sentetik hücrelerin yapımında kullanılan Hücresiz Protein Sentezi (CFPS) sistemini tanımlar. Farklı mikro bölmelerde temsili sonuçlarla temel aşamaları ana hatlarıyla belirtir. Protokol, sentetik hücre topluluğundaki çeşitli laboratuvarlar için en iyi uygulamaları oluşturmayı ve sentetik hücre gelişiminde ilerlemeyi ilerletmeyi amaçlamaktadır.

Sentetik hücreler oluşturmak için hücresiz protein sentez sistemi

Burada, tetrasiklin kontrollü tabanlı indüklenebilir sentetik devrenin tasarlanması, inşası ve teslimi için bir protokol sunulmaktadır. Sentetik devrelerin parazit eliminasyonu ve sitokin ekspresyonu üzerindeki etkisi, sunulan boru hattının kanalize edilmesiyle incelenebilir. Bu protokol, bulaşıcı hastalıklarda sentetik devre tabanlı terapötikler üzerinde çalışan araştırmacılar için geçerlidir.

Konakçıya Yönelik Tedavileri İlerletmek için Enfeksiyonda İmmünometabolik Devreler

Bu makale, bir biofabrication yaklaşımı tarif: hücreleri ya da proteinler ile fonksiyonelleştirilmiş edilebilir biyouyumlu filmler oluşturmak üzere yanlı elektrotlar varlığında uyaran-tepkisel polisakaritler çökelmesi. Biz, laboratuar-on-a-çip etkileşimli uygulamalar için biofunctionalized yüzeyler oluşturmak için filmler gibi temel kullanımların üretimi için, bir tezgah üstü stratejisi göstermektedir.

Biofabrication ile Bio-Elektronik Arayüz Bridging

Bu kağıt bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak microindentation ile canlı hücrelerin mekanik özelliklerini karakterize etmek için bir protokol göstermektedir.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Öğrenin sentetik biyoloji ile mühendislik E. coli hücrelerini programlanabilir malzemelerle arayüzleme yöntemini. Genetik modifikasyon ve yüzey fonksiyonelleştirme stratejileri moleküler tıp ve çevre izleme için dinamik sensörler sağlar.

Yaşayan Hücreleri Mühendise Sentetik Biyoloji kullanarak That Programlanabilir Malzemelerle Arayüzü

Daha fazla video keşfet