Bitki Buz yakınlık Arıtma kullanma Buz yeniden kristalleşme İnhibisyon ve İzolasyonu Değerlendirilmesi sayesinde Proteinler Buz bağlayıcı tanımlanması

Bu protokolün genel amacı, buz bağlama aktivitesini test ederek ve buz afinite saflaştırması kullanarak doğal peptitleri izole ederek bitkilerden yeni buz bağlayıcı proteinleri veya IBP'leri tanımlamaktır. Bu yöntem, bitki donma toleransı, özellikle buz bağlayıcı proteinler alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, karmaşık saflaştırma yöntemleri kullanmadan buz bağlayıcı proteinleri doğal ekstraktlardan izole etmenize izin

Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir, çünkü aparat kurulumunun kavramsallaştırılması zor olabilir. Bu protokole, metin protokolünde açıklandığı gibi uyarı aparatı kurulumuyla başlayın. Donmaya dayanıklı otlarda veya diğer donmaya dayanıklı bitki türlerinde buz bağlayıcı proteinlerin veya IBP'lerin ekspresyonunu indüklemek için, düşük ışık koşullarında dört santigrat derecede bir haftaya kadar soğuğa iklimlendirilmiş bitkiler.

Sapın tabanından keserek ve ardından 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirerek yaklaşık 0,1 gram yaprak dokusu elde edin. Numuneyi hemen sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve kullanana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Hücreleri parçalamak için, doku örneğini bir havan topu kullanarak ince bir toz haline getirin ve sıvı nitrojen altında havaneli havan tokmağı yapın.

Homojenizasyon işlemi sırasında sıvı nitrojenin buharlaşmadığından emin olun. Öğütülmüş numuneleri hemen buzun üzerine yerleştirin ve sıvı nitrojenin tamamen buharlaşmasına izin verin. Daha sonra bir mililitre doğal protein ekstraksiyon tamponu ekleyin ve karıştırmak için pipetleyin.

Numuneleri gece boyunca dört santigrat derecede hafifçe çalkalayın ve kalan adımları aynı sıcaklıkta gerçekleştirin. Ertesi gün, numuneleri beş dakika boyunca yaklaşık 1.600 kez G'de santrifüjleyerek hücresel kalıntıları çıkarın. Çözünür fraksiyonu koruyun ve hücresel kalıntı devam ederse beş dakika daha santrifüjleyin.

Arıtılmış numuneler kullanıma kadar eksi 20 santigrat derecede saklanabilir. Polarize film ile kurulan dış hazneye 100 mililitre heksan dökün ve slaytlarda nem birikmesini önlemek için beş ila altı kurutma boncuğu ekleyin. Daha sonra banyoyu kaplayan plakaya az miktarda vakumlu gres ekleyin ve sıkı bir sızdırmazlık sağlamak ve hekzanın buharlaşmasını önlemek için bükün.

Deneye başlamadan 40 dakika önce, soğutma bloğunu plastik tüpün hemen altındaki polistiren bir kutuya yerleştirin ve üzerini tamamen kuru buzla kapatın. Teste başlamadan önce tüpün düz olduğundan emin olun. Ardından kuru buzu soğuk bloğun üstünden çıkarın.

İlk olarak, numunenin soğutma bloğunun neresine düşeceğini belirlemek için bu prosedürü suyla test edin. Otomatik bir pipete yapıştırılmış tek kullanımlık ucu, numunenin pipetin dışına yapışmak yerine düşmesine izin verecek daldırma yağına batırın. Fazla yağı çıkarmak için bir kağıt havlu kullanın.

Ardından 10 mikrolitre su aspire edin. Suyu serbest bırakmadan önce pipeti doğrudan plastik borunun üzerine yerleştirin. Su, soğutma bloğuna çarptığında ve tek bir buz kristali tabakası oluşturduğunda belirgin bir sıçrama sesi duyulmalıdır.

Ardından, su ile belirlenen damla işaretinin üzerine bir cam mikroskop kapak sürgüsü yerleştirin. Tahlillere başlamadan hemen önce, ışık kaynağını açın ve cam haznenin dibinde oluşan buzu kazıyın. Ardından, su için yapıldığı gibi numune ile sıçrama tahlilini gerçekleştirin ve tek bir buz kristali tabakası oluşturmak için numunenin 10 mikrolitresini cam kapak sürgüsüne bırakın.

Mikroskop lamını cımbız kullanarak soğuk bloktan hızlı ve dikkatli bir şekilde çıkarın ve polarize edici filmin üzerine hekzan banyosuna yerleştirin. Mikroskobun altına bakarak, mikroskop slaytını görüş alanına koyun ve objektif merceği, çapraz polarizasyon yüksek kontrastlı buz kristallerinin görselleştirilmesine izin verecek şekilde ayarlayın. Kamerayı mikroskoba takın ve buz kristallerinin net bir şekilde görselleştirilmesini sağlamak ve görüntüyü yakalamak için ayarları makro olarak ayarlayın.

Tüm örnekler için bu adımları tekrarlayın. Tipik olarak, heksan haznesine farklı bir numune ile altı adede kadar slayt yerleştirin. Bitirdikten sonra ışık kaynağını kapatın.

Ardından, hekzan banyosunun üzerine plastik bir plaka yerleştirin, sıkı bir sızdırmazlık sağlayın ve buz kristallerinin gece boyunca tavlanmasına izin verin. Kuluçka işleminden sonra, daha önce olduğu gibi buz filmlerinin görüntülerini yakalayın. Bitki dokusunu daha önce olduğu gibi soğuk iklimlendirdikten sonra, 20 mililitrelik tüplerde yaklaşık 100 ila 150 gram öğütülmüş biyokütle toplayın.

Numuneleri hemen dondurun ve kullanmadan önce eksi 80 santigrat derecede tutun. Yaprak dokusunun yeniden süspansiyonu için bire bir oran kullanarak numuneyi daha önce olduğu gibi hazırlayın. IBP'lerin endojen proteazlar tarafından bozunmasını önlemek için ek proteaz inhibitör tabletleri kullanın.

Hücresel kalıntıları gidermek için, lizatı iki kat tülbentten üç kez eleyin. Enkazı, dört santigrat derecede 40 dakika boyunca 30.000 kez G'de santrifüjleme ile peletleyin. Daha sonra, doğal protein ekstraksiyon tamponu kullanarak numunenin hacmini 120 mililitreye yükseltin ve herhangi bir buz bağlama aktivitesi kaybını önlemek için buz afinitesi saflaştırması için lizadeyi hemen kullanın.

Buz parmağını eksi 0,5 santigrat dereceye kadar soğuttuktan sonra, soğuk damıtılmış su içeren 50 mililitrelik bir tüpe daldırın. Buz çekirdeklenmesini kolaylaştırmak için birkaç buz parçası ekleyin ve parmağınızda ince bir buz tabakası oluşmasına izin verin. Bu işlem genellikle 20 ila 30 dakika sürer.

Numuneyi, manyetik karıştırıcının üzerine polistiren bir kaba yerleştirilmiş küçük bir manyetik karıştırma çubuğu içeren 150 mililitrelik bir cam kabın içine yerleştirin. Buz parmağının ortalandığından ve sıvı numunenin en az yarısına kadar indirildiğinden emin olun. Ardından kabı kapatın.

Programın yaklaşık iki gün çalışmasına izin verin ve her 24 saatte bir kontrol edin. Numunenin %50'si donduktan sonra programı durdurun. IBP'lerin buz yarımküresine dahil edilmesi, buz aşındırması ile sonuçlanacaktır.

Buz yarım küresini çıkarmak için, probu dört santigrat dereceye ısıtın. Daha sonra, bağlanmamış proteini çıkarmak için yarım küreyi damıtılmış suyla durulayın ve dört santigrat derecede çözün. Buz yarımküresi hala pigment içeriyorsa veya numune saflaştırmasını artırmak için saflaştırma adımlarını iki ila üç kez tekrarlayın.

Burada, IBP'leri olmayan bir tampon kontrolünden toplanan ekstraktlar ve IBP içermeyen vahşi tip Arabidopsis thaliana'dan ekstraktlar gösterilmiştir. 18 saat sonra, tampon kontrolü ve A.thaliana özleri buz kristali büyümesini kısıtlayamaz. Buna karşılık, soğuğa alıştırılmış Lolium perenne'den IBP'leri eksprese eden transgenik A.thaliana özleri ile görülen küçük buz kristalleri, buz kristali büyümesini önemli ölçüde kısıtlar.

İlk saflaştırma turundan sonra, yarım küre yüzeyindeki yüksek derecede buz aşındırması, IBP'lerin buza adsorbe olduğunu ve buz kristallerinin büyümesini değiştirdiğini gösterir. Ek çözünen maddeleri, pigmentleri ve kirletici proteinleri uzaklaştırmak için, daha net bir buz yarımküresi ile sonuçlanan ikinci bir buz afinitesi turu kullanıldı. Bu prosedürü takiben, buz bağlayıcı proteinleri daha fazla karakterize etmek için buz şekillendirme ve termal histerezis bir nanolitre ozmometre kullanılarak değerlendirilebilir.

Ek olarak, peptit dizilerini tanımlamak için kütle spektometrisi için izole fraksiyonlar gönderilebilir.