Name: Bitki Buz yakınlık Arıtma kullanma Buz yeniden kristalleşme İnhibisyon ve İzolasyonu Değerlendirilmesi sayesinde Proteinler Buz bağlayıcı tanımlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Keşfedin buz bağlayıcı proteinleri buz yakınlık arıtma ile izole etme yöntemini. Bu teknik, bitki donma toleransı araştırmalarında karmaşık arıtma işlemleri olmadan yerel ekstraktlardan IBP izolasyonu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma VKW bir NSERC (Kanada) hibe ile finanse edildi.

1. Splat tertibat Ayar <ol><li> etilen glikol (% 50 v / su içinde hacim) olan bir sıcaklığa programlanabilir dolaşan su banyosu doldurun. Not: Yeşil otomotiv etilen glikol kullanılabilir. </li><li> Harici odasını monte etmek için, bir çift duvarlı cam kaseye su banyosu takmak için yalıtılmış plastik boru kullanılmalıdır. polistiren köpük cam kase izole ve bir plastik petri kabı bir kapak ile kaplayın. Işık kaynağı, cam odasının içinden görülebilir ve böylece polistiren bölmenin tabanında yer alan 3-4 inçlik bir delik. </li><li> Bir kamera portu ve bir 10x oküler lens ile bir 4X polarize objektif lens ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu üzerinde dış odasını, monte edin. Dış haznenin altına polarize filmin ek bir parça yerleştirin. </li><li> imbik tezgahının tabanında boru altında yer alan bir soğutma bloğu ile birlikte, büyük bir polistiren kap içinde bir otoklav standı ve yer üzerine 1-1.5 m borusu (~ 5 cm çapında) kelepçe. </li></ol> Doğal protein 2. Hazırlık IRI Analiz için özler <ol><li> Düşük ışık koşullarında (6 saat ışık / 18 saat karanlık) altında, 4 ° C &#39;de en fazla 1 hafta dondurularak dayanıklı otları ve diğer donma toleranslı bitki türleri, soğuk iklime alışmaları bitkilerde öğren ekspresyonunu indüklemek için. Bu zaten düşük sıcaklık koşullarında ve aklimasyonundan dönemleri maruz kalmış sahadan toplanan numuneler için geçerli değildir. </li><li> sapının kesilerek yaprak dokusunun yaklaşık olarak 0.1 g elde edilir ve daha sonra 1.5 ml bir tüp içinde yer. Kullanımdan hemen kadar -80 ° C&#39;de sıvı azot ve mağaza örnek flaş dondurma. </li><li> , Hücreler lize edildi, sıvı azot altında bir havan ve havan tokmağı kullanılarak ince bir toz halinde doku öğütülmesine için. Sıvı azot homojenleştirme işlemi sırasında buharlaşmaz emin olun. </li><li> Hemen buz üzerinde yer örnekleri yer ve sıvı azot tamamen buharlaşmasına izin verin. bir doğal protein extracti 1 ml ekleyin10 mM Tris-HCl, 25 mM NaCl (pH 7.5) ihtiva eden, iki EDTA içermeyen proteaz inhibitörü tableti içeren tampon, kullanımdan hemen önce eklenmiştir. Karıştırmak için pipet; Girdapsız davranma NOT: lizat ikincil metabolitler içeriyorsa ilave katkı maddelerinin kullanılması gerekebilir (bkz. Tartışma). </li><li> Örnekleri gece boyunca (18-24 saat) 4 ° C&#39;de hafifçe çalkalayın. Kalan adımları 4 ° C&#39;de gerçekleştirin. </li><li> 5 dakika boyunca ~ 16,000 xg&#39;de numuneleri santrifüj ederek hücre döküntülerini alın. Hücresel enkaz devam ediyorsa, çözünür fraksiyonu ve santrifüjü ilave 5 dakika muhafaza edin. Açıklanan numuneler kullanıma kadar -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 3. Splat Assay Deney öncesi kurulum <ol><li> Polarize film ile kurulan harici odaya 100 mL hekzan dökün ve slaytlar üzerinde nem oluşmasını önlemek için 5-6 kurutucu boncuk ekleyin. Hamamı kaplayan plakaya az miktarda vakum gres ekleyin ve sıkı bir sızdırmazlık sağlamak ve hekzanın buharlaşmasını önlemek için bükün. </li&gt; <li> Deneye başlamadan önce, arasında -4 ° C ve -6 ° C programlanabilen bir su banyosu kullanılarak yaklaşık olarak 2-3 saat heksan banyosu soğutulur. deney başlamadan önce bir termometre ile hekzan sıcaklığını kontrol etmek emin olun. </li><li> Doğrudan plastik tüp altında bir polistiren kutu soğutma blok yerleştirin ve kuru buz tamamen deney başlamadan önce 40 dakika kapsamaktadır. </li><li> tahlil başlamadan önce tüp seviyesi olduğundan emin olun. Örnek düşecek soğutma bloğu, birinci test ile burada su ile prosedür belirlemek ve (aşağıda tarif edildiği gibi) bir numune, bir marker ile düşünceye göstermek için. </li><li> Soğuk bloğun üstünden kuru buz çıkarın ve suyla belirlenmiştir damla işareti üstünde cam mikroskop kapak slayt yerleştirin. </li><li> Hemen Deneye başlamadan önce, ışık kaynağı açmak ve cam bölmenin alt kısmında oluşturulmuş olan herhangi bir buz kazıyın. buz kristalleri sürece ışık kaynağını tutmamaya özenheksan ısıtma önlemek için görüntülenmiştir edilmektedir. </li></ol> 4. Splat tahlili yapılması <ol><li> bir kağıt havlu fazla yağı kaldırmak kullanarak, immersiyon otomatik pipet (1-20 ul) yapıştırılmış atılabilir ucu batırın. Bu adım örnek düşmek yerine pipet dışına uymak sağlayacaktır. NOT: pipet fazla yağı çıkarma yağ damlacıkları görselleştirme zorlaştırır buz kristalleri üzerinde oluşturmuyor sağlamak için kritik öneme sahiptir. </li><li> şirketinden örnek bırakmadan önce plastik boru üzerine numune ve yer pipetin pipet 10 uL. Numune buz kristallerinin bir tek tabaka oluşturmaya, cam kapak slayt çarptığında bir tat &#39;splat&#39; sesi duyulmalıdır. </li><li> Çabuk ve dikkatle polarize filmin üstünde hekzan banyosuna cımbız ve yer kullanarak soğuk bloktan mikroskop lamı çıkarın. </li><li> Mikroskop altında bakıldığında, görünümü ve reklamın alanına mikroskop lamı koymakSadece objektif lens böylece çapraz polarizasyon yüksek kontrast buz kristallerinin olarak gösterebilir. 40x büyütme ayarlayın. </li><li> mikroskoba kamera takın ve buz kristallerinin net görüntülenmesine yol açar ve görüntüyü yakalamak için &quot;makro&quot; için ayarları yapın. NOT: 1 saat kadar bekleyen buz kristalleri daha net bir görüntü verebilir büyümeye izin vermek. </li><li> Tekrarlayın tüm numuneler için 4,1-4,5 adımları tekrarlayın. Tipik olarak, heksan odasında farklı numune ile 6 slaytlar yerleştirebilir. </li><li> sıkı bir mühür sağlanması ışık kaynağını kapatın ve hekzan küvetin üzerinde plastik tabak koyun. (Belirli bir analiz içinde, tutarlı bir tavlama süresi tutarak, 12-24 saat) buz kristalleri gece boyunca tavlanmasına izin verin. İnkübasyon sonrasında, buz filmlerin yakalama görüntüleri yukarıda açıklandığı gibi. NOT: Bazı numuneler diğerlerinden daha çabuk rekristalize edilebilir. bir yeniden kristalizasyon, 12 saat sonra olması halinde, 24 saate kadar herhangi bir yeniden kristalize olmasını sağlamak için kristaller tavlanmasına izin verecekkıymetleştirme meydana gelecektir. </li></ol> 5. Splat tahlili Veri Analizi <ol><li> Fotoğrafları bilgisayara yükleyin ve doğrudan öncesi ve tavlama sonrası buz kristallerinin büyüklüğünü karşılaştırın. bir IRI faaliyeti olmayan örnekler fark daha büyük buz kristallerinin oluşturulması yeniden kristalleşen ise buz yeniden kristalleşme aktivitesi olan örnekler, büyüme olmaz. Işık girişim büyük buz kristalleri biraz farklı tonlar görünür ve böylece görmek kolaydır yapacaktır. </li></ol> 6. Buz yakınlık Arıtma Ekipmanları Kurulumu <ol><li> etilen glikol ile bir sıcaklığa programlanabilir dolaşan su banyosu doldurun. Yeşil otomotiv etilen glikol kullanılabilir. </li><li> Yalıtımlı plastik boruyu 15 kullanılarak içi boş, pirinç proba banyo bağlayın. </li><li> 150 mL çanak kuytu uyabildiği bir polistiren kap oluşturmak. pirinç soğuk parmağı için merkezi bir delik olan kap için bir kapak oluşturun. </li></ol> 7.Buz-afinite temizliği için Örneklerinin Hazırlanması <ol><li> Soğuk iklime alışmaları bitki dokusu olarak bölüm 2.1&#39;de anlatıldığı. </li><li> 20 ml tüpler içinde öğütülmüş biyokütle (aşama 2.3) ~ 100-150 g toplayın ve hemen dondurularak yanıp söner. Numuneler, kullanımdan önce -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> bölümlerde 2.3-2.5 tarif edildiği gibi örnek hazırlayın. yaprak dokusunun yeniden süspanse edilmesi için: 1 oranında (doğal protein ekstraksiyon tamponu ml doku mg olarak verir:), 1 kullanın. endojen proteaz ile öğren bozulmasını önlemek için ek proteaz inhibitör tabletleri kullanın. Not: 2 veya 1: 3 (dokusunun mg: doğal protein ekstraksiyon tamponu mL) doku örneği, çok konsantre olduğunda, 1 oranının ayarlanması. </li><li> Hücresel enkaz kaldırmak için tülbent 2 kat, 3 kat aracılığıyla lizat eleyin. 4 ° C&#39;de 40 dakika boyunca 30,000 x g&#39;de santrifüj ile artık taneleri. </li><li> doğal protein çıkarma tamponu kullanarak 120 mL numune hacmini artırır. buz afinite temizliği için hemen lizat kullanınbuz bağlayıcı aktivitesi kaybını önlemek. </li></ol> 8. İletken buz afinite saflaştırma <ol><li> saflaştırma öncesinde, -0.04 ° C / saatlik bir oranda ° -3 için -0.5 ° C&#39;den soğumaya programlanabilen bir su banyosu ayarlayın. Not: soğutma hızı numunenin başlangıç ​​hacmine bağlı olarak ayarlanabilir. </li><li> -0.5 ° C&#39;ye kadar buz parmak soğutun ve daha sonra soğuk damıtılmış su ihtiva eden bir 50 mL tüp içine daldırılması. parmağına oluşturmak üzere buz ince bir tabaka buz çekirdekleşmeyi kolaylaştırmak ve sağlamak için bir kaç buz yongaları ekleyin. Bu işlem, tipik olarak, 20 ile 30 dakika sürer. Not: buzla kaplanmış parmak bütün topaklar önceki çalışmalar yerleştirilmesi için bir eldivenli eli ile düzeltilmelidir. bir buz tabakası -0.5 ° C de meydana değilse, -0.75 ° C&#39;ye sıcaklığını düşürmek. </li><li> Manyetik karıştırıcı üstünde bir polistiren kap içine küçük bir manyetik karıştırma çubuğu içeren 150 mL glass beher içinde yer örneği. buz parmak olduğundan emin olunmerkezli ve sıvı numune içine en az yarı yol düşürdü. bir kap kapağı. </li><li> 24 saatte bir kontrol programı yaklaşık iki gün boyunca çalışmasına izin verin. Numunenin% 50 dondurulmuş sonra, bir program dur. Buz yarımkürede içine öğren katılması &quot;buz aşındırma&quot; sonuçlanacaktır. NOT: Arıtma deneyleri program çalışır buna göre ayarlanır hangi süreye sahip büyük örnek hacimleri kullanılarak yapılabilir. </li><li> 4 ° C&#39;ye kadar prob, buz yarı-küresinin kaldırmak ısınmaya amacıyla, bağlanmamış proteinin ayrılması için damıtılmış su ile yarım küre yıkayın ve daha sonra 4 ° C&#39;de eritin. Not: çoğu öğren su ve uygun bir tampon içinde kararlı değildir (diğer bir deyişle, 50 mM Tris-HCI, pH 8 ya da 50 mM amonyum bikarbonat, pH 8) çözülme işlemi sırasında periyodik olarak ilave edilmesi gerekir (yaklaşık 1 mL / 2 saat) . Buz hemisfer alüminyum folyo ile sarılmış ve önceki eritme -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> buz yarımküre hala içeriyorsas pigment ya da örnek saflaştırma geliştirmek için, tekrar 8,1-8,5 2-3 yineleyin. Not: IBP konsantrasyonu düşük saflaştırma çok sayıda mermi aşağıdaki rağmen, saflık saflaştırılmış örnekleri MS kullanılarak analiz edilecektir verim daha değerlidir. yeterli malzeme mevcut ise, buzlu afinite saflaştırma üç tur önerilmektedir. </li></ol> Öğren 9. tanımlanması <ol><li> Öğren buz yarıküre erimeyi takiben büyük hacimde içerdiği için, numune konsantre edin. Küçük protein kaybını önlemek için bir 3000 Da molekül ağırlığı kesmesi ile santrifüj konsantrasyon tüpler kullanılarak ~ 1-3 mL doku ~ 100 g içeren örnekler konsantre edilir. </li><li> MS örnekleri göndermeden önce, bu tür bir BCA veya Bradford analizi gibi bir protein miktar tahlil kullanılarak protein konsantrasyonunu belirlemek. SDS-PAGE gibi jel elektroforezi ile numunelerin saflık tahmin. se önce IRI aktivitesi için saflaştırılmış proteinler testMS nding aktif protein saflaştırma ve konsantrasyon adım adım muhafaza edildiğinden emin olmak için. </li><li> Kütle spektrometre analizi 10 doğrudan konsantre örnekleri kullanın. </li></ol>

<ol><li>Sidebottom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-stable+antifreeze+protein+from+grass%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heat-stable antifreeze protein from grass.</a> Nature. 406 (6793), 256(2000).</li>
<li>Duman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifreeze+and+ice+nucleator+proteins+in+terrestrial+arthropods%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods.</a> Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).</li>
<li>Davies, P. L., Hew, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+of+fish+antifreeze+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Biochemistry of fish antifreeze proteins.</a> FASEB J. 4 (8), 2460-2468 (1990).</li>
<li>Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+antifreeze+protein+activity+in+Antarctic+lake+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria.</a> Microbiology. 150 (Pt 1), 171-180 (2004).</li>
<li>Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+alpha-helical+antifreeze+peptides+on+specific+ice+crystal+surface+planes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+L%22%5BJournal%5D)">Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes.</a> Biophys. L. 59 (20), 409-418 (1991).</li>
<li>Yeh, Y., Feeney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifreeze+proteins%3A+structures+and+mechanisms+of+function%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function.</a> Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).</li>
<li>Smolin, N., Daggett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+ice-like+water+structure+on+the+surface+of+an+antifreeze+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein.</a> J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).</li>
<li>Graham, L. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycine-rich+antifreeze+proteins+from+snow+fleas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas.</a> Science. 310 (5747), 461(2005).</li>
<li>Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifreeze+proteins+in+the+Antarctic+springtail%2C+Gressittacantha+terranova%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+B%22%5BJournal%5D)">Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova.</a> J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).</li>
<li>Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flies+expand+the+repertoire+of+protein+structures+that+bind+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).</li>
<li>Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+a+Bacterial+Antifreeze+Protein+as+an+Adhesin+with+Ice-Binding+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity.</a> PLoS One. 7 (11), e48805(2012).</li>
<li>Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+antifreeze+protein+in+a+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hyperactive antifreeze protein in a fish.</a> Nature. 429 (6988), 153(2004).</li>
<li>Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification+and+antifreeze+activity+of+carrot+antifreeze+protein+and+its+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants.</a> Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).</li>
<li>Gupta, R., Dreswal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+temperature+stress+modulated+secretome+analysis+and+purification+of+antifreeze+protein+from+Hippophae+rhamnoides%2C+a+Himalayan+wonder+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant.</a> Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).</li>
<li>Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+antifreeze+proteins+by+adsorption+to+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biphys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice.</a> Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).</li>
<li>Middleton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+ice-binding+proteins+from+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants.</a> Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).</li>
<li>Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-binding+proteins+confer+freezing+tolerance+in+transgenic+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana.</a> Plant Biotechnol. J. , (2016).</li>
<li>Olijve, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+rapid+ice+crystal+growth+through+nonbasal+plane+adsorption+of+antifreeze+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).</li>
<li>Zakharov, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice+Recrystallization+in+a+Solution+of+a+Cryoprotector+and+Its+inhibition+by+a+Protein%3A+Synchrotron+X-Ray+Diffraction+Study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study.</a> J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).</li>
<li>Capicciotti, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+ice+recrystallization+inhibitors+enable+freezing+of+human+red+blood+cells+with+reduced+glycerol+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations.</a> Sci. Rep. 5, 9692(2015).</li>
<li>Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+alpha-helical+antifreeze+peptides+on+specific+ice+crystal+surface+planes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes.</a> Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).</li>
<li>Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiourea%3A+the+antioxidant+of+choice+for+the+purification+of+proteins+from+phenol+rich+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues.</a> Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).</li>
<li>Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-shell+purification+of+ice-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Ice-shell purification of ice-binding proteins.</a> Cryobiology. 72 (3), 258-263 (2016).</li>
<li>Basu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+ice-binding+planes+of+antifreeze+proteins+by+fluorescence-based+ice+plane+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity.</a> J. Vis. Exp. (83), e51185(2014).</li>
<li>Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+evolution+of+a+cold+stress+associated+gene+family+in+cold+tolerant+grasses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses.</a> BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).</li>
<li>Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+ice-binding+face+of+a+plant+antifreeze+protein%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein.</a> FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Öğren başarıyla analiz ve saflaştırma için, proteinlerin bazı sıcaklığa duyarlı doğasını anlamak önemlidir. Bazı bitki öğren açılması, çökeltme ve işlem içinde elde edilen, 0 ° C&#39;nin üzerindeki sıcaklıklarda stabil hale gelir. Aktif öğren elde etmek için, bitkiler, soğuk bir odada (~ 4 ° C) içinde işlenir ve numuneler, deney sırasında buz üzerinde tutulur, çok daha önemlidir. Bütün hücreli ham lizatları kullanılarak endojen proteazlar tarafından proteinlerinin parçalanma olduğunda diğer bir faktör dikkate. Bitkilerd...

Buz-bağlayan proteinler (öğren) bitkilerde 1, böcekler 2, balık 3 ve mikroplar 4 de dahil olmak üzere bir organizma sayısı tespit edilmiştir koruyucu proteinlerin farklı bir familyasıdır. Bu proteinlerin önemli bir özelliği, özellikle ve verimli bir şekilde büyümesini düzenleme, buz kristallerine adsorbe için kendi benzersiz yeteneğidir. Öğren birkaç belgelenmiş özelliklere sahip iki en iyi karakterize edilmiş olan termal histerezis (TH) ve buzlu rekristalizasyon inhibisyon (IRI) ile yıkanmıştır. TH aktivitesi daha kolay dondurularak tolere hayvanlarda üretilen öğren gözlenir. donmayı önlemek için organizmaların dolaşım veya geçiş sıvıların donma noktası düşürmede Bu etki gösterir. Buna karşılık, kaçınılmaz olarak sıfırın altındaki sıcaklıklarda donacak dondurularak toleranslı organizmalar, içinde, öğren düşük TH aktivitesine sahip görünmektedir. Düşük TH aktivite rağmen yüksek bir IRI aktivite buz ağlama kısıtlamak içinStal büyüme genellikle bu proteinlerle görülmektedir. Dondurularak toleranslı organizma için bu IRI aktivitesi muhtemelen dışı bölümlerde buz kontrolsüz büyümesi hücreleri korumaya yardımcı olur. &quot;Yatak düğmesi&quot; modeli öğren buz kristallerinin 5 büyümesini önlemek mekanizmayı tarif etmek için kullanılabilir. Bu modelde, öğren özellikle su molekülleri bağlı öğren arasındaki boşlukta gelişen buz kristal kafesi ile birleştirmek için bu şekilde aralıklarla buz kristali yüzeyine adsorbe eder. Bu ilave su moleküllerinin eklenmesi elverişsiz kılan bir eğrilik Gibbs-Thompson etkisiyle 6 ile tarif edilebilir bir olay oluşturur. Bağlantılı klatrat suları hipotez buz kristali yüzeyine öğren spesifik bağlanmasını için bir mekanizma sağlar; reo spesifik olarak, protein buz bağlanma alanı üzerine yerleştirilmiş yüklü kalıntıların varlığı, sonuçSu moleküllerinin rganization böylece buz kristal kafes 7&#39;nin bir ya da daha fazla uçak eşleşir. TH aktivite erime arasındaki fark ölçülerek ve bir IBP mevcudiyetinde bir tek buz kristali donma sıcaklığının ile kantifiye edilebilir. TH aktivitesi öğren (a derece, tipik olarak sadece bir kısmı), bitki öğren tarafından üretilen düşük GAP etkinliğini değerlendirmek için yaygın olarak kabul edilen yöntem olsa da, normal olarak yüksek bir protein konsantrasyonu, özel ekipman ve operatör deneyimi gerektirir. olmayan öğren buz kristali büyümesinin sınırlamak olsa da, tüm öğren ve böylece IRI aktivitesi için test edilmesi ile paylaşılan bir özellik, özellikle düşük TH aktivitesine sahip olanlar için, öğren mevcudiyeti için etkili bir başlangıç ​​ekran. Bu aktiviteyi test etmek için kullanılan yöntem, bir protein numunesi flaş olmadığını belirlemek için belirli bir süre boyunca gözlenir küçük buz kristallerinin, bir tek tabaka üretmek için dondurulur ve böylece, bir &#39;splat tahlili&#39; olarak bilinirbuz kristali büyümesi ile sınırlıdır. Öğren varlığı için bir kaynak doku örneği taramak için kullanılan diğer yöntemlerin aksine, bu yöntem 10-100 ng aralığında düşük protein konsantrasyonları için geçerlidir, kolayca imal teçhizatı kullanmaktadır ve hızlı ve kolay bir yorumlanır verileri üretir. Bununla birlikte, deneyin, TH belirlenmesi ve buz kristali şekillendirme ile takip edilmelidir öğren için bir başlangıç ​​ekranını sağladığını vurgulamak önemlidir. doğal proteinlerin izolasyonu genellikle ilgi konusu bir proteinin yapısal ve biyokimyasal özellikleri ile ilgili bilgi gerektiren zor bir iştir. buz öğren afınite saflaştırma amaçları için bir alt-tabaka olarak buz kullanılarak bu proteinlerin izolasyonu sağlar. moleküllerin büyük çoğunluğu, buz kristali büyümesi, yüksek saflaştırılmış örnekteki bir IBP örnek sonuçlarının mevcudiyetinde bir buz yarıkürenin düşük büyüme, büyük quantit yoksun esnasında öncesinde buz-su sınır itilir yanaproteinler ve çözünmüş kontamine ler. Bu yöntem, böcek 8, 9, 10, bakteriler 11, balık 12 ve bitkiler 13, 14 öğren tanımlamak için kullanılmıştır. Buna ek olarak, bu yöntem sayesinde elde edilen IBP zenginleştirilmiş kısımlar, aynı zamanda aşağı biyokimyasal analiz için kullanılabilir. Bu kağıt öğren indüksiyonu ve ekstraksiyon yoluyla bitkilerde öğren tanımlanmasını açıklar, IRI faaliyeti analizi proteinlerin, ve buz afinite saflaştırması kullanılarak proteinlerin izolasyonunu doğrulamak için.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Ayarlanabilir laboratuvar jakı</td><td>Fisher</td><td>S63080</td><td></td></tr><tr><td>Tezgah üstü santrifüj</td><td>Desaga MC2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pirinç prob</td><td>Özel yapım</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera/kamera bağlantı noktası</td><td>Canon</td><td></td><td>Canon Power Shot SX110 dijital kamera; özel yapım mikroskop bağlantı noktası</td></tr><tr><td>Tülbent</td><td>Purewipe/Fisher Scientific</td><td>06-665-25A</td><td></td></tr><tr><td>Konsantrasyon tüpleri (0,5 mL)</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC501008</td><td></td></tr><tr><td>Konsantrasyon tüpleri (15 mL)</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900308</td><td></td></tr><tr><td>Konik tüpler (50 mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM12502</td><td></td></tr><tr><td>Soğutma bloğu</td><td>VWR</td><td>13259</td><td>Metal bir ısıtma bloğu kullanın</td></tr><tr><td>Nem Alma</td> Cihazı <td>Whirlpool</td><td></td><td>50 pint Energy Star nem alma cihazı; yerel tedarikçiden satın alma</td></tr><tr><td>Dessciation boncukları</td><td>t.h.e. Dessicant/VWR</td><td>EM-DX0017-2</td><td>6-8 ağ boyutu; %100 gösterge</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Olympus Tokyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çift cidarlı cam kase</td><td>Jenerik</td><td>Yerel laboratuvar cam eşya tedarikçisinden satın alma</td>Kuru <td></td></tr><tr><td>buz</td><td>Jenerik</td><td></td><td>Yerel tedarikçiyi kullanın; tehlikeli&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA-proteaz inhibitör tabletleri</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11836170001</td><td>Roche cOmplete mini</td></tr><tr><td>Etilen glikol</td><td>Jenerik</td><td></td><td>Yeşil otomotiv etilen glikolü herhangi bir yerel hırdavatçıdan satın alınabilir (yani Home Depot)</td></tr><tr><td>Hekzan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296090</td><td>Susuz, %95; tehlikeli</td></tr><tr><td>Daldırma yağı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56822</td><td></td></tr><tr><td>JA10 / 20 santrifüj</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Büyük plastik Petri kabı</td><td>Jenerik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen</td><td>Jenerik</td><td></td><td>Kullanım yerel tedarikçi; tehlikeli&nbsp;</td></tr><tr><td>Manyetik karıştırma plakası</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI190M</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop kapak slaytları</td><td>Fisher</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Plastik tüp</td><td>Genel</td><td></td><td>Yerel hırdavatçıdan PVC boru satın alın</td></tr><tr><td>Polarize film</td><td>Edmund Optics</td><td>43-781</td><td></td></tr><tr><td>Polistiren köpük</td><td>Jenerik</td><td></td><td>Polistiren nakliye kutularından yapılabilir</td></tr><tr><td>Poreclain harcı ve havaneli</td><td>Fisher</td><td>FB961</td><td></td></tr><tr><td>PVPP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77627</td><td>110 & m parçacık boyutu</td></tr><tr><td>İmbik Standı</td><td>Fisher</td><td>12-000</td><td></td></tr><tr><td>Küçük karıştırma çubuğu</td><td>Fisher</td><td>14-513-51</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık programlanabilir su banyosu</td><td>VWR</td><td>13271-118</td><td></td></tr><tr><td>Vakum gresi</td><td>Dow Corning/Sigma Aldrich</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Vinil boru</td><td>Jenerik</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bitki buz yakınlık arıtma kullanma buz yeniden kristalleşme İnhibisyon ve İzolasyonu değerlendirilmesi sayesinde proteinler buz bağlayıcı tanımlanması

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Buz-bağlayan proteinler (öğren) sıfırın altındaki sıcaklıklara maruz belirli organizmalar tarafından sentezlenir stres kaynaklı bir protein ailesine aittir. Hücre dışı buz kristalleri büyüdükçe bitkilere, dondurarak hasar plazma membranları ve olası hücre ölümünün yırtılması sonuçlanır. Buz kristallerine öğren adsorpsiyonu, böylece, hücresel hasarı düşürerek, buz yeniden kristalleşme engelleme (IRI) olarak bilinen bir süreç ile daha fazla büyümesini kısıtlar. Öğren, denge erime noktasının altında bir çözeltisine, termal histerezis (T-H) aktivitesi olarak bilinen bir özelliği, donma noktasını düşürmek için yeteneğini göstermektedir. Bu koruyucu özellikler nedeniyle, endüstriyel, tıbbi ve tarımsal uygulamalarda potansiyel kullanımlarına yeni öğren belirlenmesinde çekmektedirler. Bu çalışma, 1 ile bitki öğren belirlenmesini) indüksiyonu ve çıkarma öğren bitki dokusunda, 2) IRI aktivitesi için özleri tarama, ve 3) izolasyon ve Purif tarifÖğren ait ication. Düşük sıcaklık maruz öğren sağlanmasının ardından, özü ve standart bir ışık mikroskobu kullanılarak, buz kristali büyümesinin gözlem sağlayan bir &#39;splat tahlili&#39; kullanılarak IRI aktivitesi için test edilir. Bu deney, düşük protein konsantrasyonu gerektirir ve hızlı bir şekilde elde edilebilir ve kolayca buz bağlayıcı aktivitesi için bir başlangıç ​​ekranını sağlayan yorumlanır sonuçlar üretir. Öğren sonra &#39;buz-afinite saflaştırma&#39; adı verilen bir teknikle, buz adsorbe etmek öğren özelliğini kullanarak kirletici proteinler izole edilebilir. Bitki özlerinden derlenen hücre lizatları kullanılarak, bir buz yarımküre yavaş yavaş bir pirinç sonda üzerinde yetiştirilebilir. Bu polikristal buz kristal yapısına öğren içermektedir. Bir IBP önsel biyokimyasal ya da yapısal bilgiye gerektiren bu yöntem, aktif proteinin geri kazanımını sağlar. Buz ile saflaştırılmış protein fraksiyonları moral tanımlanması da dahil olmak üzere alt uygulamalar için kullanılabilirkütle spektrometrisi ve doğal proteinlerin biyokimyasal analizi ile başlıktaki dizileri.

Kurulum kolaylığı için, Şekil 1 ve Şekil 2, sırasıyla IRI analizi ve buzlu afinite temizliği için kullanılan ekipman, görsel bir gösterge olarak dahil edilmiştir. Öğren olan ve olmayan hardal otu toplanan özler kullanılarak IRI analiz sonuçları Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. Bu sonuçlar, dondurularak dayanıklı değildir hardal otu, toplanan ekstraktlar bağlı öğren mevcut olmaması b...

Bu çalışma, buz yeniden kristalleşme engelleme etkinliği ve buzlu afinite saflaştırmasını kullanarak yerel öğren daha sonra tecrit değerlendirme yoluyla dondurularak dayanıklı bitkiler buz bağlayıcı proteinin tanımlanmasını açıklar.

Bitki Buz yakınlık Arıtma kullanma Buz yeniden kristalleşme İnhibisyon ve İzolasyonu Değerlendirilmesi sayesinde Proteinler Buz bağlayıcı tanımlanması

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Bu protokolün genel amacı, buz bağlama aktivitesini test ederek ve buz afinite saflaştırması kullanarak doğal peptitleri izole ederek bitkilerden yeni buz bağlayıcı proteinleri veya IBP'leri tanımlamaktır. Bu yöntem, bitki donma toleransı, özellikle de buz bağlayıcı proteinler alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, karmaşık saflaştırma yöntemlerine gerek kalmadan doğal ekstraktlardan buz bağlayıcı proteinleri izole etmenize olanak tanımasıdır.Cihaz kurulumunu zihinde canlandırmak zor olabileceğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Bu protokole, metin protokolünde açıklandığı şekilde splat cihazı kurulumu ile başlayın. Donma toleranslı çimenlerde veya diğer donma toleranslı bitki türlerinde buz bağlayıcı proteinlerin (IBPs) ekspresiyonunu indüklemek için, bitkileri düşük ışık koşulları altında, dört derece santigrat sıcaklıkta bir haftaya kadar soğuğa alıştırın.Gövdenin tabanından keserek yaklaşık 0,1 gram yaprak dokusu elde edin ve ardından 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Numuneyi hemen sıvı azot ile şok dondurun ve kullanıma kadar -80 °C'de saklayın. Hücreleri liz etmek için doku örneğini sıvı azot altında havan ve havan eli kullanarak ince bir toz haline gelene kadar ezin.Homojenizasyon işlemi sırasında sıvı azotun buharlaşmadığından emin olun. Öğütülmüş numuneleri derhal buz üzerine yerleştirin ve sıvı azotun tamamen buharlaşmasını bekleyin. Ardından, bir mililitre natif protein ekstraksiyon tamponu ekleyin ve karıştırmak için pipetleyin.Numuneleri dört derece Celsius'te gece boyunca hafifçe çalkalayın ve kalan adımları aynı sıcaklıkta gerçekleştirin. Ertesi gün, numuneleri yaklaşık 1.600 ×g'de beş dakika boyunca santrifüj ederek hücresel kalıntıları uzaklaştırın. Çözünür fraksiyonu muhafaza edin ve hücresel kalıntılar devam ediyorsa beş dakika daha santrifüjleyin.Berraklaştırılmış numuneler, kullanıma kadar -20 °C'de saklanabilir. Polarize filmle donatılmış dış hazneye 100 mL heksan dökün ve lamlar üzerinde nem oluşumunu önlemek için beş ila altı adet kurutucu boncuk ekleyin. Ardından, banyoyu örten plaka üzerine az miktarda vakum gresi sürün ve sızdırmazlığı sağlayarak heksanın buharlaşmasını önlemek için sıkıca çevirerek kapatın.Deneye başlamadan 40 dakika önce, soğutma bloğunu plastik tüpün hemen altına gelecek şekilde bir polistiren kutuya yerleştirin ve üzerini tamamen kuru buzla örtün. Analize başlamadan önce tüpün düz olduğundan emin olun. Ardından, soğuk bloğun üzerindeki kuru buzu kaldırın.Öncelikle, örneğin soğutma bloğunun neresine düşeceğini belirlemek için bu prosedürü su ile test edin. Otomatik pipete takılı olan tek kullanımlık ucu, örneğin pipetin dış yüzeyine yapışmak yerine aşağı düşmesini sağlayacak olan imersiyon yağına daldırın. Fazla yağı temizlemek için bir kağıt havlu kullanın.Ardından 10 µL su aspire edin. Suyu bırakmadan önce pipeti doğrudan plastik tüpün üzerine yerleştirin. Su soğutma bloğuna çarptığında, tek katmanlı buz kristalleri oluşturarak belirgin bir şapırtı sesi duyulmalıdır.Ardından, su ile belirlenen damla işaretinin üzerine cam bir mikroskop lamel yerleştirin. Analizi başlatmadan hemen önce ışık kaynağını açın ve cam haznenin tabanında oluşmuş olan tüm buzları kazıyın. Daha sonra, su için yapıldığı gibi örnekle splat analizini gerçekleştirin; buz kristallerinden oluşan bir tek katman oluşturmak için cam lamel üzerine 10 µL örnek bırakın.Mikroskop lamını cımbız yardımıyla soğuk bloktan hızlıca ve dikkatlice çıkarıp polarize filmin üzerindeki heksan banyosuna yerleştirin. Mikroskop altında bakarak, lamı görüş alanına getirin ve çapraz polarizasyonun yüksek kontrastlı buz kristallerinin görselleştirilmesine olanak tanıması için objektif lensini ayarlayın. Kamerayı mikroskoba bağlayın ve buz kristallerinin net bir şekilde görselleştirilmesini sağlamak için ayarları makroya getirerek görüntüyü yakalayın.Bu adımları tüm örnekler için tekrarlayın. Genellikle, heksan haznesine farklı örnekler içeren altı adede kadar lam yerleştirilir. İşlem tamamlandığında ışık kaynağını kapatın.Ardından, heksan banyosunun üzerine sızdırmazlığı sağlayacak şekilde plastik bir plaka yerleştirin ve buz kristallerinin gece boyunca tavlanmasına izin verin. İnkübasyonun ardından, buz filmlerinin görüntülerini daha önce olduğu gibi yakalayın. Bitki dokusunu daha önce olduğu gibi soğuğa alıştırdıktan sonra, öğütülmüş biyokütlenin yaklaşık 100 ila 150 gramını 20 mililitrelik tüplere toplayın.Numuneleri hemen şok dondurun ve kullanıma kadar -80 °C'de saklayın. Yaprak dokusunun yeniden süspansiyonu için bir bir oran kullanarak numuneyi daha önce olduğu gibi hazırlayın. Endojen proteazlar tarafından IBP'lerin yıkımını önlemek için ek proteaz inhibitörü tabletleri kullanın.Hücresel kalıntıları uzaklaştırmak için lizatı üç kez iki kat tülbentten geçirin. Kalıntıları 4 °C'de 40 dakika boyunca 30.000 ×g'de santrifüj ederek çöktürün. Ardından, natif protein ekstraksiyon tamponu kullanarak numune hacmini 120 mL'ye tamamlayın ve buz-bağlama aktivitesinde herhangi bir kayıp oluşmasını önlemek için lizatı buz-afinite saflaştırması için hemen kullanın.Buz parmağı -0.5 °C'ye kadar soğuttuktan sonra, soğuk distile su içeren 50 mL'lik bir tüpün içine daldırın. Buz çekirdeklenmesini kolaylaştırmak için birkaç parça buz ekleyin ve parmağın üzerinde ince bir buz tabakası oluşmasını bekleyin. Bu işlem genellikle 20 ile 30 dakika arasında sürer.Numuneyi, manyetik karıştırıcının üzerindeki polistiren bir kaba yerleştirilmiş ve içinde küçük bir manyetik karıştırma çubuğu bulunan 150 mililitrelik cam bir behere yerleştirin. Buz parmağının merkezlendiğinden ve sıvı numunenin içine en az yarıya kadar indirildiğinden emin olun. Ardından kabı mühürleyin.Programın yaklaşık iki gün boyunca çalışmasına izin verin ve her 24 saatte bir kontrol edin. Numunenin %50'si donduğunda programı durdurun. IBP'lerin buz yarımküresine dahil olması buz aşındırmasına (ice etching) neden olacaktır.Buz yarım küresini uzaklaştırmak için probu dört santigrat dereceye ısıtın. Ardından, bağlanmamış proteinleri temizlemek için yarım küreyi distile su ile durulayın ve dört santigrat derecede çözdürün. Buz yarım küresi hâlâ pigment içeriyorsa veya örnek saflaştırmasını artırmak için, saflaştırma adımlarını iki ila üç kez tekrarlayın.Burada, IBP'ler içermeyen bir tampon kontrolünden toplanan ekstratlar ile IBP içermeyen yabani tip Arabidopsis thaliana ekstratları gösterilmiştir. 18 saat sonra, tampon kontrolü ve A.thaliana ekstratları buz kristali büyümesini kısıtlayamamaktadır. Buna karşılık, soğuğa adapte olmuş Lolium perenne'den IBP'ler eksprese eden transgenik A.thaliana ekstratlarında görülen küçük buz kristalleri, buz kristali büyümesini önemli ölçüde kısıtlamaktadır.İlk saflaştırma aşamasının ardından, yarım küre yüzeyindeki yüksek derecedeki buz aşındırması, IBP'lerin buza adsorbe olduğunu ve buz kristallerinin büyümesini modifiye ettiğini göstermektedir. Ek çözünenleri, pigmentleri ve kontamine proteinleri uzaklaştırmak için ikinci bir buz-afinite aşaması uygulanmış ve bu sayede daha berrak bir buz yarım küre elde edilmiştir. Bu prosedürün ardından, buz bağlayıcı proteinleri daha ayrıntılı karakterize etmek amacıyla, nanolitre bir osmotometre kullanılarak buz şekillendirmesi ve termal histerezis değerlendirilebilir.Ek olarak, peptit dizilerini belirlemek amacıyla izole edilen fraksiyonlar kütle spektrometresine gönderilebilir.

identification-plant-ice-binding-proteins-through-assessment-ice

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Burada Saccharomyces cerevisiae protein kompleksleri tanımlamak için yeni bir nicel proteomik tekniği açıklar. Bu çalışmada, yüksek özgüllük ile bir ER protein, Scs2p bağlayıcı ortakları tanımlamak için tandem kütle spektrometresi tarafından takip yakınlık arıtma ile birlikte SILAC yöntemi kullandık.

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Ayrıca antifriz proteinleri olarak bilinen buz bağlayıcı protein (IBPs), buz büyümesini engelleyen ve doku dondurma kullanım için umut verici bir katkı maddesi vardır. IBPs araştırmak için kullanılan başlıca araç nanolitre Osmometer olduğunu. Biz bir optik mikroskop üzerine monte edilmiş bir ev tasarlanmış soğutma aşamasında geliştirilen ve özel olarak geliştirilmiş bir LabVIEW rutin kullanılarak kontrol. Nanolitre Osmometer ultra-hassas bir şekilde numune sıcaklık manipüle burada açıklanan.

Buz Bağlayıcı Protein İncelemelerde LabVIEW çalıştırılan Roman nanolitre Ozmometre

Burada bitki protein komplekslerinin saflaştırılması ve karakterizasyonu için bir protokol açıklar. Biz bir kompleks içinde bir tek proteini imüno tarafından, bu yüzden onun translasyon sonrası modifikasyonlar ve etkileşim ortakları belirlemek olduğunu göstermektedir.

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Antifriz proteinleri (AFP'ler) buz büyümesini önlemek veya yavaşlatmak için belirli buz düzlemlerine bağlanır. Floresan bazlı buz düzlemi benzeşimi (FIPA) analizi, AFP'ye bağlı buz düzlemlerinin belirlenmesi için orijinal buz aşındırma yönteminin bir modifikasyonudur. AFP'ler floresan olarak etiketlenir, makroskopik tek buz kristallerine dahil edilir ve UV ışığı altında görselleştirilir.

Floresan Bazlı Buz Düzlemi Benzeşimi ile Antifriz Proteinlerinin Buz Bağlayıcı Düzlemlerinin Belirlenmesi

Bu iletişim kuralı bir protein örnek karakterizasyonu benzeşme kapiler Elektroforez tarafından kapiller Jel Elektroforez ve hızlı bağlama tarama için şarj edilmiş ligandlar birleştirir. Bu proteinler gibi özünde düzensiz proteinler, esnek bir yapı için bağlama farklı conformers için tüm farklılıkları belirlemek için önerilir.

AtHIRD11 içsel bozukluğu ve bağlama kapiller Jel Elektroforez ve benzeşme kapiler Elektroforez Metal iyonları doğru Analizi

Biz glikoproteinlerin biyofiziksel ve yapısal karakterizasyonu için yaklaşımlar ile immünglobulin kat biolayer Interferometry, izotermal titrasyon Kalorimetre ve x-ışını kristalografisi tarafından mevcut.

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

Onlar yaşayan hücrelerden salgılanan gibi biz tek etiketlenmemiş proteinler gerçek zamanlı Optik algılama için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çeşitli farklı biyolojik sistemleri ve yapılandırmaları için uygulanabilir dalgaboyu saçılma (iSCAT) mikroskopi dayanmaktadır.

Etiket içermeyen Imaging, tek proteinler salgılanan iSCAT mikroskobu ile yaşayan hücrelerden

Bu protokol, inositol fosfatlar veya fosfoinositidler bağlayan proteinlerin tanımlanması üzerinde duruluyor. Bu etanol veya manyetik boncuklar için streptavidin üzerinden immobilize olan biyotinlenmiş inositol fosfatlar veya fosfoinositidler ile benzeşme Kromatografi kullanır. Inositol fosfat veya fosfoinositide bağlayıcı proteinler Batı lekesi veya kütle spektrometresi ile tanımlanır.

Inositol fosfat veya Phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık Kromatografi Batı Blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması

Burada açıklanan Nicotiana benthamiana yaprak dokusunda NLR bağışıklık reseptörünün TIR etki alanının etkileşim ortaklarının belirlenmesi için bir yakınlık etiketleme yöntemidir. Ayrıca Nicotiana ve diğer bitki türlerinde bu tekniği kullanarak ilgi diğer proteinler arasındaki etkileşimlerin belirlenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanır.

Protein-Protein Etkileşim Ağlarının Planta Özdeşleştirilmesinde TurboID Tabanlı Yakınlık Etiketlemesi

Bu makalede, seyrek matris ekranlarda yeni kristalleşme koşulları oluşturmak için mikrotohumlama kullanarak I3C (5-amino-2,4,6-triiodoishthalic asit) ile türemiş protein kristalleri oluşturmak için bir yöntem sunar. Tepsiler sıvı dağıtım robotları kullanılarak veya elle kurulabilir.

Rastgele Mikrotohum Matris Taraması Ile Protein Kristallerinin I3C ile Türevleştirilmesi

Burada, model olarak AT4G18020 (APRR2)-AirID proteini kullanarak salatalıkta (Cucumis sativus L.) yakınlık etiketleme (PL) deneyini gerçekleştirmek için adım adım bir protokol sunuyoruz. Yöntem, bir vektörün inşasını, agroinfiltrasyon yoluyla bir yapının dönüşümünü, biyotin infiltrasyonunu, protein ekstraksiyonunu ve afinite saflaştırma tekniği ile biyotin etiketli proteinlerin saflaştırılmasını açıklar.

Bitkilerde protein-protein etkileşimi için AirID tabanlı yakınlık etiketlemesi

Keşfedin buz bağlayıcı proteinleri buz yakınlık arıtma ile izole etme yöntemini. Bu teknik, bitki donma toleransı araştırmalarında karmaşık arıtma işlemleri olmadan yerel ekstraktlardan IBP izolasyonu sağlar.

Bitki Buz yakınlık Arıtma kullanma Buz yeniden kristalleşme İnhibisyon ve İzolasyonu Değerlendirilmesi sayesinde Proteinler Buz bağlayıcı tanımlanması (Video) | JoVE Journal

Bitki Buz yakınlık Arıtma kullanma Buz yeniden kristalleşme İnhibisyon ve İzolasyonu Değerlendirilmesi sayesinde Proteinler Buz bağlayıcı tanımlanması

Daha fazla video keşfet