Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi

Bu deneyin genel amacı, fare tamoksifen indüklemeli kader haritalama sistemi ve akış sitometrisi kullanarak vitellus kesesi hematopoetik progenitörlerini ve onların soyundan gelen hücreleri in vivo olarak karakterize etmektir. Bu çalışma, hematopoetik kök hücrelerden farklı olan hematopoetik progenitörlerin gelişimi ve farklılaşmasıyla ilgili immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sınırlı bir zaman penceresinde işaretlenen hematopoetik progenitörlerin ve yerleşik makrofajlar gibi soyundan gelen hücrelerin, gelişim ve yetişkinlik dönemleri boyunca izlenebilmesidir.

Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, embriyonik doku için gereken hücre miktarı ve eş zamanlı olarak işlenen numunelerin büyük hacmi nedeniyle zorluk yaşayacaklardır. Deneye başlamak için, öncelikle diseke edilmiş fare uterus boynuzlarını yaklaşık 30 milliliters buz gibi soğuk PBS ile doldurulmuş 10 millimeterlik bir petri kabına aktarın. Hemen ardından, boynuzun servikal ucundaki uterus kas tabakalarını kavrayın ve embriyoları serbest bırakmak için ince bir makası kas tabakası ile desidüal doku arasına kaydırın.

Ardından ince bir pensle Reichert membranı ve plasentayı çıkarın. Vitellus kesesini nazikçe diseke edin ve 0,5 mililitre sindirim çözeltisi ile doldurulmuş 24 kuyucuklu bir doku kültürü plağına aktarın. Göbek ve vitellin damarları kestikten hemen sonra embriyoyu, 2 mililitre 10 milimolar buz gibi soğuk EDTA ile doldurulmuş 12 kuyucuklu bir doku kültürü plağına aktarın.

Embriyonun baş kısmı keskin ve ince makaslarla ayrıldıktan sonra, gövdeyi ve başı 10 ila 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletin ve ardından embriyoyu çıkarıp EDTA içeren kanı toplayın. Sonrasında, embriyoyu çevreleyen amniyonu uzaklaştırın. Daha sonra, embriyodan arka üyeleri ve yabancı üyeleri çıkarın.

Bir çift ince pens kullanarak toraksı açın. Ardından, kalbin ön kısmını tutun ve ikinci bir pensle iç organları vücuttan ayırırken dokuyu nazikçe çekin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, fetal karaciğeri kalp ve bağırsaklardan ayırın.

Ardından organı, 0,5 mililitre sindirim çözeltisi ile doldurulmuş 24 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Kardiyovasküler sistemle olan anatomik bağlantı, fetal karaciğerin tanımlanması için kritiktir. Fetal karaciğer halen bu gelişim aşamasındadır ve embriyolar ne kadar gençse, diseksiyon o kadar zor olabilir.

Primer hücre süspansiyonlarını hazırlamak için, toplanan organları sindirim çözeltisi içinde 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Enzimatik çözelti içindeki dokuyu, 1 mL FACS tamponu ile doldurulmuş altı kuyucuklu bir doku kültürü plağının bir kuyucuğuna yerleştirilmiş 10 µm'lik bir süzgece aktarın. Tekli hücre süspansiyonu elde etmek için dokuyu nazikçe ezerek ayrıştırmak amacıyla 2 mm'lik bir şırıngadan alınan siyah kauçuk pistonu kullanın.

Ardından, hücre süspansiyonunu bir Pasteur pipeti ile aspire edin ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Süspansiyonu 4 santigrat derecede 7 dakika boyunca 320 ×g'de santrifüjleyin. Santrifüjden sonra, süpernatantı aspire ederek atın.

Ardından, taze Fc bloklama tamponu hazırlayın ve peleti 60 microliters içinde yeniden süspande edin. Daha sonra, tek hücreli süspansiyondan 50 microliters miktarını 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakanın kuyucuğuna aktarın. Plakayı en az 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Ardından, farklı dokulardan türetilmiş bir örnek havuzu elde etmek için süspansiyonun geri kalan 10 µL kısmını 5 mL'lik polistiren bir FACS tüpüne aktarın. Her bir florokrom için FMO kontrolleri amacıyla, bu havuzdan 50 µL'yi 96 kuyucuklu plakaya aktarın. Antijen yüzey boyamasına geçmek için, bir antikor çözeltisi ve FACS tamponu hazırlamak üzere altı florokrom antikorundan oluşan bir set kullanın.

Ardından, FMO kontrol boyaması için kullanılacak altı antikor çözeltisini ve FACS tamponunu hazırlayın. Daha sonra, 96 kuyucuklu plaka içerisindeki örneklere 50 µL antikor çözeltisi ekleyin. Örnekleri nazikçe çift pipetleme yöntemiyle karıştırın ve ardından plakayı 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

96 kuyucuklu plakayı 4 °C'de 7 dakika boyunca 320 ×g'de santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Hücreleri 200 µL FACS tamponu ile yıkayın ve plakayı bir kez daha döndürün. Süpernatant plakayı ters çevirerek uzaklaştırılırken özel dikkat gösterilmelidir.

Hücrelerin gevşemesini önlemek için 96 kuyucuklu plaka, tek ve hızlı bir bilek hareketiyle ters çevrilmelidir. Son olarak, doku ve kontrol örnekleri 70 µm süzgeç kullanılarak 6 mm polistiren tüplere süzülür. Artık akış sitometrik analiz gerçekleştirilebilir.

Canlı, eritrositik olmayan tek hücrelerden oluşan bir popülasyon, progenitör markörü KIT ve hematopoetik hücre markörü CD45'in ekspresyonu açısından analiz edildi. Hedeflenen popülasyon içerisinde üç farklı hücre alt popülasyonu ayırt edildi: KIT pozitif CD45 negatif, KIT pozitif CD45 düşük ve KIT negatif CD45 pozitif.

Vitellüs kesesi kit pozitif öncül hücreler arasında, hem CD45 negatif hem de CD45 düşük hücre popülasyonları, sarı floresan protein veya YFP eksprese eden AA4.1 pozitif hücreler içeriyordu; bu durum, olgunlaşmamış KIT pozitif öncüllerin, CD45 ekspresyonundan bağımsız olarak önce AA4.1 eksprese ettiğini göstermektedir. Karaciğer ve beyindeki AA4.1 pozitif, YFP pozitif hücreler yalnızca KIT pozitif CD45 düşük öncül popülasyonunda bulundu ve bunlar büyük olasılıkla vitellüs kesesi öncüllerinden köken alan dolaşımdaki öncüllere karşılık gelmektedir. Makrofajlar, kit negatif CD45 pozitif popülasyonda bulunmuş ve F480 parlak CD11 B pozitif hücreler olarak tanımlanmıştır.

Vitellüs kesesi, karaciğer ve beyindeki makrofajlar, ENP kökenli olabileceklerini gösteren tek bir 4-hydroxy tamoxifen uygulaması ile etkili bir şekilde işaretlenmiştir. Uzmanlaşıldığında, hücre izolasyonu ve boyama prosedürü, doğru şekilde yürütüldüğü takdirde üç ila dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, örneklerin toplandığı andan itibaren her zaman buz üzerinde tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir.

Taze FACS tamponları günlük olarak hazırlanmalı ve filtrelenmelidir. Bu prosedürü takiben, etiketlenmiş hücrelerinle ilgili diferansiyasyon ve proto faz potansiyeline dair ek soruları yanıtlamak için Rosa MTMG veya Rosa confetti hatları gibi diğer mash raporlayıcı veya flux suşları kullanılabilir.