Name: İlköğretim Cilia Eğitim için birincil Neurosphere Kültür Kullanımının (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Öğrenin, nöral kök hücrelerde primer silyum biyogenezini ve sinyal proteinlerinin trafiklenmesini incelemek için nörosfer kültür yöntemini. Bu teknik, silyum oluşumu ve hücresel fonksiyonları anlamaya yönelik temel araştırmalar için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S.M.'nin laboratuvarındaki çalışma, CPRIT (R1220) ve NIH (1R01GM113023-01) tarafından sağlanan işe alım hibeleriyle finanse edilmektedir.

Yetişkin Fare Beyninden nöroküreleri 1. İzolasyonu <ol><li> izofluran aşırı dozda tarafından (yaklaşık 2 aylık) bir yetişkin fare Euthanize. Fare nefes durdu ve ölümden sonra hemen teşrih ettiğini tekrar kontrol edin. </li><li> makas kullanarak, kafatası açmak için bir orta hat kesi yapmak. beyin çıkarın. </li><li> Buz üzerinde 10 cm&#39;lik bir tabak içinde soğuk PBS beyin yerleştirin. Lateral ventrikül 48 SVZ&#39;unda elde etmek için tüm montaj diseksiyon yöntemi takip edin. </li><li> Bir 1.5 ml tüp içine yanal ventrikül yerleştirin PBS içinde% 0.05 tripsin-EDTA 500 uL ekleyin ve bir su banyosu içinde 37 ° C &#39;de 15 dakika süre ile boru inkübe edin. </li><li> 15 dakika sonra, durdurma ortamının 500 uL ekleyin ve hafifçe 20 pipetleyin - 1 ml ucu ile 30 kez. pipetleme sırasında hava kabarcıkları oluşturan kaçının. NOT: Bu adım, hücre hayatta kalması için kritik öneme sahiptir. </li><li> 8 dakika boyunca 500 x g&#39;de hücreleri dönerler. Süpernatantı atın 1 mL PBS ekleyin ve tekrar süspansiyon tyavaşça 1 ml ucu ile 5x pipetleme o hücreleri. </li><li> 8 dakika boyunca 500 x g&#39;de Spin. 1 ml ucu kullanılarak Süpernatant atılır ve bazal ortamın 1 ml. </li><li> (İsteğe bağlı) hücresel kalıntı gözlenirse, 70 um&#39;lik bir hücre süzgecinden-hücreleri geçer. </li><li> hemositometre ile hücrelerinin sayısını; Genel olarak, yaklaşık 30,000 - 60,000 hücre / SVZ elde edilir. </li><li> % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de MGK orta ve kültür 10 mL, 10 cm tabak içine bir SVZ&#39;unda hücreleri Plate. </li><li> Küreler 49 arasında füzyon önlemek için (isteğe bağlı),% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de MGK orta ve kültür 1.5 mL ile doldurulmuş olan bir ultra-düşük-bağlayıcı 6-plaka tek bir bölmesinde 1.000 hücreleri koydu. Not: 5-7 gün sonra, Neurospheres (Şekil 2A) gözlenebilir. kültürleme süresi farenin yaşına veya genetik kökenli farklı olabilir. </li><li> kültürünü korumak için her 3-4 günde MGK orta 2 mL ekleyin(Mevcut ortamı çıkarmayın). </li></ol> Neurospheres ve Ciliogenesis Testleri Farklılaşma Kapasitesinin 2. Analiz <ol><li> farklılaşma kapasitesini analiz etmek için, farklılaşma ortamında yapışkan koşullar altında nöroküreleri analiz eder. </li><li> otoklavda veya kullanımdan önce UV&#39;ye maruz kalma ile 12 mm yuvarlak lamelleri sterilize edin. yapışkan bir hücre kültürü için, aseptik şartlar altında, bir 24-çukurlu plaka iyi bir steril 12 mm yuvarlak kapak cam koydu. </li><li> Kaplama% 0.002 poli-L-lisin (PLL) 500 uL 10 s için cam kapak. çözelti aspire ve 10-15 dakika süre ile kurutulur. </li><li> Laminin çözeltisi (5 ug / ml) 500 ul ilave edin. 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca cam kapak inkübe edin. </li><li> laminin aspire ve farklılaşma orta veya MGK ortamında (farklılaşmamış kontrol) 500 uL ekleyin. </li><li> mikroskop altında 200 uL ucu ile 200 um küre - farklılaşma deneyinde, bir 100 çekme. Eklemekfarklılaşma ortamında 7-10 gün için 24 plaka ve kültür her oyuğuna 5-10 Neurospheres. </li><li> , Farklılaşmamış nöroküreleri analiz MGK ortamda 1-2 gün için 24 plaka ve kültür, her sıra için 5-10 nöroküreleri ekleyin. Ekli Neurospheres yayılmış ve bir tek tabaka (Şekil 2B) gibi büyür. </li><li> dikkatle Ortamın çıkarılmasından sonra, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit (PFA) ile hücrelerin düzeltmek ve daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca iki kez PBS ile yıkayın. plakası 1-2 ay için 4 ° C&#39;de saklanabilir. Not: (nöral kök / progenitör hücre işaretleme maddesi) Nestin karşı immun boyama gerçekleştirmek MGK orta nöral kök / progenitör hücreler ve farklılaşma ortamında farklılaşmış hücreleri görselleştirmek için, β-tübülin III (Tuj1 monoklonal nöronal markeri), GFAP (glial fibrilar asidik protein , astrosit markeri), ve O4 (oligodendrosit işaretleme maddesi) (Şekil 2B-D). (Arl13b karşı birincil ci immun boyama gerçekleştirmek, kirpikler analiz etmeklia işaretleme maddesi) ve Gpr161 (siliyer GPCR) (Şekil 3). </li><li> Bir slayt camına montaj çözümü ile kapak camı monte edin. fazla çözeltiyi almak için slayt cam yatırın. </li></ol> Neurospheres içinde Ciliogenesis 3. Analiz <ol><li> immün bozulmamış neurospheres hücreleri analiz etmek için, kültür ortamının transferi 1 mL 1.5 ml tüp birden Neurospheres içeren ve 8 dakika boyunca 500 x g&#39;de aşağı doğru döndürün. 15 dakika boyunca ortam çıkarıldıktan sonra% 4 (PFA) ile küreler düzeltmek ve PBS ile yıkayın. , 8 dakika boyunca 500 x g&#39;de Küreler Spin süpernatant kaldırmak ve 4 ° C&#39;de% 30 sukroz ile küreler O / N inkübe edin. </li><li> 1 ml ucu kullanılarak Süpernatant atılır ve bir kesim 1 ml ucu oct kullanmanın çözeltisinin 500 uL ekleyin. Ekim viskoz olduğu gibi, açma genişletmek için uç kenarını kesin. </li><li> bir tek kullanımlık plastik dondurma kalıp (10 mm x 10 mm x 5 mm) içine Neurospheres içeren Ekim çözeltisini. </li><li> m Freezeen az 15 dakika boyunca kuru buz üzerinde eski. </li><li> (İsteğe bağlı) deney durdurun ve 1 yıla kadar bir -80 ° C dondurucu içinde kalıp saklayın. </li><li> Bir kriyostat ile bölümleri kesme; bölümlerin kalınlığının 15-30 um olmalıdır. </li><li> Bir neurosphere birincil kirpikler görselleştirmek için, Arl13b karşı immun boyama (Şekil 4) gerçekleştirir. </li></ol> 4. Kültür ve nöroküreleri ve Yapışık NSC&#39;lerde Passage <ol><li> Geçiş Neurospheres küre boyutu 100-200 um arasında iken; Neurospheres (300 mm veya üzeri) çok büyük olduğu zaman, bunlar deneyler için ideal değildir. </li><li> 1 ml ucunu kullanarak bir 50 ml tüp içine nöroküreleri aktarın ve 8 dakika boyunca 500 x g&#39;de aşağı doğru döndürün. </li><li> Bir aspiratör kullanılarak Süpernatant atılır, PBS içinde% 0.05 tripsin-EDTA 500 uL ekleyin ve 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edilir. Tripsin miktarı, küre sayısına bağlı olarak değişmektedir. </li><li> yavaşça serum ortamına ve boru 500 mcL1 ml ucu t 20 kez. </li><li> 8 dakika boyunca 500 x g&#39;de Spin. 1 ml ucu kullanılarak Süpernatant atılır ve bazal ortamın 1 ml. </li><li> (İsteğe bağlı) hücresel döküntü veya çözünmemiş Neurospheres görülürse, 70 um&#39;lik bir hücre süzgecinden-hücreleri geçer. </li><li> Geçiş MGK ortamı içinde 10,000 hücre / cm2&#39;lik bir yoğunlukta bir 10 cm&#39;lik bir tabakta hücreleri; Hücreler bir hafta sonra bir sonraki geçişi için hazır olacaktır. </li><li> (İsteğe bağlı) 500.000 ila 1.000.000 hücre / ml süspansiyon elde etmek üzere orta dondurma ekleyin hücreleri dondurmak için. Kriyo-dondurma kaplar kullanılarak hücreler dondurma; ayrışmamış nöroküreler da dondurulabilir. </li><li> Yapışkan kültür için, 50,000 hücre / PLL- ve üzerine cm2 hücreleri dillute 1-2 gün MGK orta lamelleri ve kültür laminin kaplı. </li></ol> 5. Açlık ve kirpikler analizi <ol><li> Starvasyon ortamını (Tablo 1) hazırlayın. </li><li> 1-2 gün, ilk pl sonraayrışma, diğer bir yerde oyuk (kontrol) ve starvasyon ortamlarında MGK ortamına, değişim de (deney) sonra, uçucu hücrelerin ating. </li><li> Kültür 24 saat yapışık hücreleri. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS içinde% 4 PFA hücreleri saptamak ve oda sıcaklığında her biri 5 dakika için PBS ile iki kez yıkanır. </li><li> (İsteğe bağlı) deney durdurun ve 1-2 ay için 4 ° C&#39;de PBS içinde lamelleri ile 24 oyuklu plakalar saklayın. </li><li> 7, 50 boyanması için bir immüno-floresan protokolü gerçekleştirin. </li><li> Montaj çözümü kullanarak lamelleri monte edin. karanlıkta, oda sıcaklığında sürgü cam O / N kurutun. </li><li> Gerekli büyütmede bir bileşik mikroskop görüntüleri elde edin. eşlik yazılımı kullanılarak kontrol edilen bir mikroskop, kamera ve amaçları (40X / 1.3 yağ ve 63X / 1.4 yağ) kullanın. 0.5-0.8 um aralıklarla (Şekil 5) yeterli z bölümleri al. </li><li> siliyer lokalizasyonu kantitatif analizinde içinyapışkan hücreler, DAPI kanalı içine bakarak birleşik hücreler ile 3-8 ardışık alanlardan görüntülerin yığınlarını edinirler. ImageJ / Fiji kullanılarak primer kirpikler sayısını ölçmek. Tipik olarak,&gt; ImageJ Eklentileri &quot;Hücre sayacı&quot; aracını kullanın GPCR pozitif kirpik bulunan hücreleri saymak için iletişim kutusunu analiz; görüntülerin yığınları gelen maksimum çıkıntılar sayımı ve dışa amacıyla aynı deneyden tüm görüntüler için ImageJ / Fiji.Use benzer görüntü yeğinliğinin doğruluğu ve kontrast parametrelerinden de ihraç edilebilir. </li></ol> Neurospheres 6. transfeksiyonu <ol><li> Uyun, 24 saat süreyle kapak slipleri hücreleri ayrışmış. 24 kuyucuklu bir plakanın tek bir bölmesinde 500 uL MGK ortam içinde tipik olarak 75,000 ila 150,000 hücre bir hücre yoğunluğuna kullanın. </li><li> 5 saniye boyunca burgaç halinde bir 0.5 mL mikrotüp düşük serum ortamına 25 uL ve transfeksiyon reaktifi 1.5 uL karıştırın. </li><li> Ayrı bir 0.5 mL microtub endotoksin içermeyen plazmid DNA&#39;nın 2.5 ug eklemedüşük serum ortamında 25 uL içeren ve 5 saniye girdap oluşturarak karıştırın örn. </li><li> İkinci mikrotüp içeren DNA transfeksiyon reaktifi 1 uL ekleyin ve 5 saniye boyunca burgaç halinde karıştırın. </li><li> İlk mikrotüp DNA içeren tüp karışımı ekleyin ve pipetleme karıştırın. </li><li> Oda sıcaklığında 10-15 dakika inkübe karışımı. İnkübasyondan sonra, yavaşça MGK orta en (500 uL / ​​oyuk) ile ilgili oyuklara transfeksiyon karışımı, damla damla ilave edilir. </li><li> ortamı (NSC ortamı) ya da starvasyon ortamını (500 uL / ​​oyuk) kontrol etmek için ortam 24 saat sonra transfeksiyon değiştirin. </li><li> 24 saat sonra% 4 PFA orta değiştirerek hücreleri saptamak ve immun boyama yapmak; tipik olarak,% 10 transfeksiyon verimliliği kadar bu protokolü kullanılarak elde edilir. </li></ol>

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Burada, üretmek ve yetişkin fare SVZ&#39;unda gelen neurosphere kültürleri korumak için bir yöntem açıklanmaktadır. aşağıdaki gibi kültürleri ile ilgili birkaç uygun noktalardır. 200 um - İlk olarak, kürelerin büyüklükleri tipik olarak 50 arasındadır. Bir neurosphere çapı daha büyük 300&#39;den um alır Deneyimlerimize göre,, geçiş için en uygun zaman cevapsız edilmiştir. Bu daha büyük küre çekirdek ölü hücreleri ihtiva etmektedir. Neurospheres yaygın sinir kök / progenitör hücreleri incelemek için kullanılır İkinci olar...

Birincil kirpik bir mikrotübül tabanlı dinamik hücre içi bölümü olduğu bir embriyonik nöronal gelişim 1, 2 boyunca sonik kirpi (Shh) yolu da dahil olmak üzere, hücresel sinyal yollarını, koordine duyusal anten ve yetişkin nöronal fonksiyon 3 bölmeli hücre içi sinyal, 4 olarak işlev . Örneğin 5 Patched Shh reseptörü gibi, bu yolların, bileşenleri sinyal; yol aktivatör Smoothened (SMO) 6; ve Gpr161 7, negatif Shh yolu düzenler yetim G-protein kenetli reseptör (GPCR), dinamik bir tarzda cilia lokalize. Çoklu GPCR&#39;ler, 10 beyin 7, 8, 9, nöronlarda kirpikler lokalize bildirilmiştir </sup&gt;, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Kirpikler ve kirpikler tarafından oluşturulan sinyal geçiş yollarında bazı kusurların çoklu dokuları etkiler ve birlikte ciliopathies 17, 18, 19 olarak bilinir. Ciliopathy hastalık spektrumu sıklıkla kraniofasial anormallikler 20, 21, 22 olarak nöro kusurları içerir. Buna ek olarak, hipotalamus nöronları birincil kirpikler merkezi tokluk yolları düzenler ve kusurları gibi Bardet Biedel sendromu 24 olarak sendrom ciliopathies şişmanlığın yansıtma, merkezi şişmanlık 23 ile sonuçlanır. Buna ek olarak, kirpikler sinyalleşme, nöropeptit alıcı centr düzenlerark tokluk 14, 11 geçiş yolu. Bu tür hipokampal nöronlar somatostatin reseptör 3 olarak adenilat siklaz III (ACIII) ve GPCR&#39;lerin Siliyer lokalizasyonu yeni nesne tanıma kusurları ve 25, 26 hafıza noksanlıkları neden olur ve siliyer bütünlüğü 27 bir zamanda gelişmiştir. kirpikler tarafından oluşturulan sinyal gelişimsel açıdan yakın bir doku homeostazında bağlanırlar; Özellikle, sil serebellum 28, 29 granül progenitörlerinden kaynaklanan Shh alt tip medulloblastoma ilerlemesi için önemlidir. Böylece, birincil kirpikler embriyonik, postnatal ve erişkin nöronal gelişim ve işlevi sırasında önemli roller oynarlar. Nöral kök hücreler (NSC&#39;lerde) subventriküler bölgede lateral ventrikül (SVZ), hipokampusun dentat girus subgranuler kısmında ve ikametmemelilerde 30, 31, 32&#39;de hipotalamusta üçüncü ventrikül ventriküler bölgesi. NSC&#39;lerde multipotent olan kendini yenileme kapasitesini sahiptir ve beyin gelişimi ve rejeneratif tıpta 30 için önemlidir. SVZ&#39;una en NSC&#39;lerde hareketsiz olan ve, birçok durumda, yan karıncık 33 dışarı uzanan bir tek birinci cilium sahiptirler. Özellikle Shh, TGFp, ve reseptör tirozin kinaz yollarında 2, 34, 35, 36 ile ilgili olarak, alt-hücresel tepkiler oluşturmada farklı reseptörlerinin lokalizasyonu, yoluyla birincil kirpik sinyaller. Birincil kirpikler yanal ventrikil içine uzanan yana, birincil kirpikler beyin-omurilik sıvısı (CSF) NSCs 37 aktif hale getirmek için sitokinleri tespit olduğu hipotezi </s&gt; Yukarı. Son çalışmalar, Shh sinyal yolu ve birinci kirpikler koku epiteli, akciğer ve böbrek 38, 39, 40, 41 dahil olmak üzere birçok dokuda, tamir kök hücrelerin aktivasyonu ve rejenerasyonu için önemli olduğunu düşündürmektedir. Bununla birlikte, CSF mekanizma NSC&#39;lerde ile iletişim kurar ve ana kirpikler olup bilinmemektedir katılmaktadırlar. kültür içinde yapışık NSC&#39;lerde kirpikli edilir; Bu tür siliyalarda Smo&#39;nun ve Gpr161 olarak Shh yolu bileşenlerinin, lokalize; ve 42 tepkili Sus bulunmaktadır. Bu nedenle, NSC&#39;lerde bir Shh yolu incelemek için önemli model sistemi, siliyer ticareti ve nöronal farklılaşma yol olarak hizmet edebilir. Buna ek olarak, NSC&#39;lerde ayırt nöronları da siliyer trafik deneyleri için de kullanılabilir. Neurospheres neura çoğalması kaynaklanan serbest yüzen hücre kümeleri oluşturulurspesifik büyüme faktörleri ve yapışkan olmayan yüzeylerin 43, 44 varlığında büyüme l kök / progenitör hücreler. Neurospheres normal gelişimi ve hastalığın 31, 45, 46, 47 nöral kök / progenitör hücreleri incelemek için in vitro kültür modellerinde önemli vermektedir. Burada, nöral kök / progenitör hücrelerin kültürlenmesi için ve sinir / glia içine farklılaşması için bir neurosphere bazlı analiz tarif eder. Özellikle nöral kök / progenitör hücreler ve farklılaşmış nöronların (Şekil 1) tüycüklere bileşenleri sinyal kaçakçılığı vurgulamaktadır. birincil nöronları kültür aksine, birinci Neurospheres, kültür nispeten kolay birden fazla geçit için uygun olan ve donma-erime döngüleri ve sinir / glia farklılaşmayı geçirebilmektedir. Daha da önemlisi, bu neurosphere türetilmiş nöral tespitkök / progenitör hücreleri ve farklılaşmış nöronların kültür içinde kirpikli ve bu bölmelerin siliyer fonksiyonu ile ilgili sinyal molekülleri yerini belirleyen. Neurosphere tabanlı kültürleme metotları NSC&#39;lerde ve farklılaşmış nöronların ciliogenesis ve siliyer kaçakçılığı çalışmak için ideal bir model sistem olarak hizmet edebilir.

<table><tbody><tr><td>12 mm yuvarlak kapaklı cam</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu plaka</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>%4 paraformaldehit (PFA)</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tüp</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>95 mm x 15 mm petri kabı, kayabilir kapak</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714G</td><td>10 cm çanak</td></tr><tr><td>70 ve mikro; m hücre süzgeci</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Affinipure Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L)</td> <td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-545-152</td><td>Eşek anti Tavşan, Alexa 488 ikincil antikor</td></tr><tr><td>Arl13B, Klon N295B / 66</td><td>Neuromab</td><td>AB_11000053</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Takviyesi (50X), serum içermeyen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504001</td><td>B27</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Thermo scientific</td><td>ST 40R</td><td></td></tr><tr><td>Kriyojenik flakon</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Deoksiribonükleaz I, sığır pankreazından</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td>Dnase I</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Sigma</td><td>D8418-100ML</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Vinil Numune Kalıpları</td><td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td><td>4565</td><td>10 mm x 10 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu 10X, Modifiye, kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içermez, sıvı, steril filtreli, hücre kültürüne uygun</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forseps</td><td>Güzel bilim araçları</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Sigma</td><td>F9026-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G çözeltisi</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>montaj çözümü</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti Fare IgG1 İkincil Antikor, Alexa Fluor 555 konjuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21127</td><td>Keçi anti Fare IgG1, Alexa 555 ikincil antikor</td></tr><tr><td>Keçi anti Fare IgG2a İkincil Antikor, Alexa Fluor 555 eşlenik</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21137</td><td>Keçi anti Fare IgG2a, Alexa 555 ikincil antikor</td></tr><tr><td>Gpr161</td><td>ev yapımı</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>insan bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>FGF</td></tr><tr><td>hemositometre</td><td>Hausser Scientific</td><td>0.100 mm derinliğinde</td><td>geliştirilmiş neubauer</td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-0500-2</td><td></td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm Sarkom bazal membranından</td> İzofloran Laminin <td>Sigma</td><td>L2020</td><td>Laminin</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td> <td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 3000 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000</td><td></td></tr><tr><td>Bay Frosty</td><td>Nalgene&nbsp;</td><td>5100-0036</td><td></td></tr><tr><td>N-2 takviyesi (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502001</td><td>N2</td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Normal Eşek Serumu</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>OCT bileşiği</td><td>Sakura Dokusu-Tek</td><td>4583</td><td>OCT</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lizin (PLL)</td> <td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan EGF proteini, CF</td><td>R ve D sistemleri</td><td>236-EG-200</td><td>EGF</td></tr><tr><td>Makas</td><td>İnce bilim araçları</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus mikroskop slaytı</td><td>Fisher scientific</td><td>12-550-15</td><td>slaytlar</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0407</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA çözeltisi (10X)</td><td>Sigma</td><td>T4174-100</td><td>Tripsin</td></tr><tr><td>COSTAR 6 Kuyulu Plaka, Kapaklı Düz Tabanlı Ultra Düşük Bağlantı Yüzeyi Polistiren, Steril</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>ultra düşük bağlayıcı 6 oyuklu plaka</td></tr><tr><td>&beta;-tubulin III</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>TUJ1</td></tr></tbody></table>

İlköğretim cilia eğitim için birincil neurosphere kültür kullanımının

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Primer silyum, nöral kök/progenitör hücrelerin çoğalması ve embriyonik, doğum sonrası ve yetişkin yaşamında nöronal farklılaşma için temel olarak önemlidir. Ek olarak, farklılaşmış nöronların çoğu, G-proteinine bağlı reseptörler gibi sinyal reseptörlerini ve adenilil siklazlar gibi sinyal moleküllerini barındıran birincil kirpiklere sahiptir. Birincil silyum, embriyonik nöronal gelişim sırasında sonik kirpi yolu da dahil olmak üzere çoklu gelişimsel yolların aktivitesini belirler ve ayrıca yetişkin nöronal fonksiyon sırasında bölümlere ayrılmış hücre altı sinyallemeyi teşvik etmede işlev görür. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, birincil silyum biyogenezi ve işlevindeki kusurlar, beynin gelişimsel anomalileri, merkezi obezite ve öğrenme ve hafıza eksiklikleri ile ilişkilendirilmiştir. Bu nedenle, nöral kök / progenitör hücreler ve farklılaşmış nöronlar bağlamında birincil silyum biyogenezi ve siliyer kaçakçılığını incelemek zorunludur. Bununla birlikte, birincil nöronlar için kültürleme yöntemleri önemli ölçüde uzmanlık gerektirir ve donma-çözülme döngülerine uygun değildir. Bu protokolde, primer nörosferler kullanılarak karışık nöral kök/progenitör hücre popülasyonları için kültürleme yöntemlerini tartışıyoruz. Nörosfer tabanlı kültürleme yöntemleri, birincil nöral kök / progenitör hücreleri incelemenin birleşik faydalarını sağlar: çoklu geçişlere ve donma-çözülme döngülerine uygunluk, nöronlara / glia'ya farklılaşma potansiyeli ve transfektilite. Daha da önemlisi, nörosfer kaynaklı nöral kök/progenitör hücrelerin ve farklılaşmış nöronların kültürde kirpikli olduğunu ve bu bölmelerde siliyer fonksiyonla ilgili sinyal moleküllerini lokalize ettiğini belirledik. Bu kültürleri kullanarak, nöral kök / progenitör hücrelerde ve farklılaşmış nöronlarda siliogenez ve siliyer kaçakçılığı incelemek için yöntemleri daha ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu nörosfer tabanlı yöntemler, nöral kök / progenitör hücreler ve farklılaşmış nöronlar bağlamında G-proteinine bağlı reseptör ve sonik kirpi sinyali dahil olmak üzere kirpikler tarafından düzenlenen hücresel yolları incelememize izin verir.

Bir hafta MGK ortamında SVZ&#39;unda hücreleri kaplama sonra, yüzer Neurospheres (Şekil 2A) gözlenmiştir. kürelerin büyüklükleri 50 ila 200 um arasında değişmektedir. Küreler nöral kök / progenitör hücreler elde edilmiştir olmadığını belirlemek için Neurospheres PLL- ve üzerine plakalanmıştır 2 gün MGK orta lamelleri laminin kaplı. Daha sonra nöral kök / progenitör hücre işaretleyici, Nestin karşı boyama yapıldı. İki gün küreler lamelleri eklemek için ve hücrelerin bir t...

Birincil kirpik nöral projenitör hücre proliferasyonu, nöronal farklılaşma ve yetişkin nöronal fonksiyon temelde önemlidir. Burada, ciliogenesis ve primer neurosphere kültürleri kullanılarak nöral kök / progenitör hücreler ve farklılaşmış nöronların cilia proteinlerin sinyal kaçakçılığı incelemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

İlköğretim Cilia Eğitim için birincil Neurosphere Kültür Kullanımının

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Bu prosedürün genel amacı, primer siliyum biyogenezini ve taşınımını incelemek için primer nöral kök ve progenitör hücrelere yönelik nörosfer tabanlı kültür yöntemlerini kullanmaktır. Bu yöntem; primer nöral kök hücrelerde, nöral progenitörlerde ve nöronlarda siliyum biyogenezi ve siliyum moleküllerinin primer siliyumlara taşınımı gibi primer siliyum alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin temel avantajı, primer siliyum bağlamında biyogenezi ve siliyer yolakları analiz etmek için nöral kök hücrelerin, nöral progenitörlerin ve nöronların primer hücre kriterlerini kullanabilmemizdir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk çekeceklerdir çünkü nöral kök hücrelerin kültürü yeni başlayanlar için teknik olarak zorlayıcıdır. Lateral ventrikülün diseksiyonu, nörosferlerin kültüre edilmesi ve primer siliyumların kantifikasyonu gibi adımların kritik aşamaları gözlemleyerek kolayca öğrenilebilmesi nedeniyle, bu yöntemin bir demonstrasyonla gösterilmesi kritik önem taşımaktadır.Bu prosedüre, tüm montaj diseksiyon yöntemi kullanılarak yetişkin bir fareden ayrıştırılmış lateral ventrikülün subventriküler zonu ile başlayın. SVZ içeren dokuyu 1,5 mililitrel

using-primary-neurosphere-cultures-to-study-primary-cilia

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Burada subventricular bölgesi ve bireysel yetişkin farelerin kıvrımlarının gelen yapışkan tek katman veya neurospheres ya gibi, sinir öncü hücre kültürlerinin eş zamanlı üretimi için ayrıntılı bir protokol açıklar.

Bir Fare, İki Kültür: İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kültür Bireysel Farelerde iki Nörojenik Bölgeler&#39;den Kök Hücre

Burada sunulan nörosferlerin spontan nesil yüksek yoğunluklu kaplama nöronlardan nöral progenitor hücrelerinde zenginleştirilmiş bir protokoldür. Aynı deney sırasında, nöronlar daha düşük yoğunlukta kaplandığında, protokol aynı zamanda uzun süreli birincil sıçan nöron kültürleri ile sonuçlanır.

E14-E16 Sprague Dawley Sıçan Embriyosu İzole Karışık Primer Hipokampal ve Kortikal Nöronlardan Nörosfer Lerin Üretimi

In vitro deneylerin vivo koşullarını mümkün olduğunca yeterli şekilde yansıtmak için yapılması kolay bir iş değildir. Birincil hücre kültürlerinin kullanımı bütün bir organizmada hücre biyolojisini anlamaya yönelik önemli bir adımdır. Sağlanan protokol nasıl başarılı bir şekilde büyümek ve kültür embriyonik fare serebellar nöronlar özetliyor.

Embriyonik Fare Beyincisinden İzole Edilen Nöronların Birincil Kültürü

Primer silia centriole ile ilişkili hücre dışı yapılardır. İmmünfloresan boyama ile primer silia tespiti son derece yüksek kaliteli görüntülerle sonuçlanan nispeten basit bir işlemdir. Bu protokolde primer silya yı ifade eden fibroblastlar sabit, immünolekeli ve floresan veya konfokal mikroskopta görüntülendi.

İmmünfluoresan siyon ile Primer Silya'nın Basit Tespiti

Görüntüleri analiz etmek için yapay zekanın (Ai) kullanımı, yaygın olarak kullanılan yöntemlere kıyasla güçlü, daha az önyargılı ve hızlı bir yaklaşım olarak ortaya çıkıyor. Burada Ai'yi hücresel bir organel, birincil cilia'yı tanıması ve uzunluk ve lekelenme yoğunluğu gibi özellikleri titiz ve tekrarlanabilir bir şekilde analiz etmesi için eğitdik.

Birincil Cilia'yı Değerlendirmede Yapay Zeka Yaklaşımları

2D ve 3D insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hIPSC) tabanlı neokortik gelişim modellerinin üretimi ve karakterizasyonu için ayrıntılı protokollerin yanı sıra primer selyyum (PC) biyogenez ve fonksiyonunun nitel ve nicel analizini sağlayan tamamlayıcı metodolojiler sunuyoruz.

Neokortik Gelişim Sırasında Primer Seyum Tutulumını Diseksiyona Yönelik 2D ve 3D İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Bazlı Modeller

Burada, primer serebellar granül hücre öncüllerinin (GCP' ler) genetik manipülasyonu için uygun maliyetli, verimli ve uygulanabilir bir tekrarlanabilir in vitro elektroporasyon protokolü sunuyoruz. Ayrıca, bu protokol ayrıca birincil GCP hücrelerindeki birincil ekyuma bağımlı Kirpi sinyal yollarının moleküler çalışması için basit bir yöntem göstermektedir.

Granül Hücre Öncüsünde Birincil Seyuma Bağımlı Sinyal Yollarını İncelemek için Verimli ve Uygun Maliyetli Elektroporasyon Yöntemi

Burada, erişkin murin subventriküler bölgesinden izole edilen genişletilmiş nöral kök hücrelerde (NSC'ler) gen iletim verimliliğini artırmak için tasarlanmış bir nükleofeksiyon sistemini açıklıyoruz. Bulgular, bu yöntemin NSC'lerde gen bozulmasını önemli ölçüde iyileştirdiğini, geleneksel transfeksiyon protokollerinin etkinliğini aştığını ve hücre sağkalım oranını artırdığını göstermektedir.

Erişkin Murin Subventriküler Bölgesinden Nöral Kök Hücrelerin İzolasyonu, Genişlemesi ve Nükleofeksiyonu

Bu yöntem, bir ARL13B-CENTRIN-2 transgenik fare modelindeki endojen sinyalin, doku toplamadan kirpik organizasyonunun analizine kadar, mineralize dokunun geniş alanlarında üç boyutlu olarak primer kirpikleri yerinde görüntülemek için kullanılmasını tanımlar. Bu protokol diğer doku tiplerine de uygulanabilir.

Kas-İskelet Dokusundaki Primer Kirpiklerin ARL13B-CENTRIN-2 Fare Modeli Kullanılarak Hacimsel Görüntülenmesi ve Analizi

Ex vivo dik damlacık kültürü, mevcut in vitro ve in vivo deneysel tekniklere bir alternatiftir. Bu protokolün uygulanması kolaydır ve daha az miktarda reaktif gerektirirken, fetal vaskülarizasyon, morfogenez ve organogenezi manipüle etme ve inceleme yeteneğine izin verir.

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm Fetal Organları Dik Damlacık Kültürleri Fare Organogenesis sırasında Gelişim Süreçleri Eğitim için

Öğrenin, nöral kök hücrelerde primer silyum biyogenezini ve sinyal proteinlerinin trafiklenmesini incelemek için nörosfer kültür yöntemini. Bu teknik, silyum oluşumu ve hücresel fonksiyonları anlamaya yönelik temel araştırmalar için değerlidir.

İlköğretim Cilia Eğitim için birincil Neurosphere Kültür Kullanımının

Daha fazla video keşfet