İlköğretim Cilia Eğitim için birincil Neurosphere Kültür Kullanımının

Bu prosedürün genel amacı, primer silyum biyogenezi ve kaçakçılığını incelemek için primer nöral kök ve progenitör hücreler için nörosfer tabanlı kültürleme yöntemlerini kullanmaktır. Bu yöntem, kirpik biyogenezi ve kirpik moleküllerinin birincil kirpiklere kaçakçılığı gibi birincil kirpikler alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Primer nöral kök hücrelerde, nöral progenitörlerde ve nöronlarda.

Bu tekniğin temel avantajı, nöral kök hücrelerin, nöral progenitörlerin ve nöronların birincil hücre kriterlerini, birincil silyum bağlamında biyogenezi ve siliyer yolakları analiz etmek için kullanabilmemizdir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir çünkü nöral kök hücrelerin kültürlenmesi yeni başlayanlar için teknik olarak zordur. Lateral ventrikülün diseksiyonu ve nörosferlerin kültürlenmesi ve primer kirpiklerin nicelleştirilmesi gibi adımlar, kritik adımları gözlemleyerek kolayca öğrenilebileceğinden, bu yöntemin bir gösteriminin kritik olduğunu göstereceğiz.

Bu prosedüre, tüm montaj diseksiyon yöntemi kullanılarak yetişkin bir fareden diseke edilen lateral ventrikal bir subventriküler bölge ile başlayın. SVZ'yi içeren dokuyu 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. PBS'ye 500 mikrolitre% 0.05 Tripsin-EDTA ekleyin ve bir su banyosunda 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından 500 mikrolitre durdurma ortamı ekleyin ve 1 mililitrelik bir uç kullanarak 20 ila 30 kez hafifçe pipetleyin. Pipetleme sırasında hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. Bundan sonra, hücreleri sekiz dakika boyunca 500 kez G'de döndürün.

Süpernatanı atın, ardından 1 mililitre PBS ekleyin ve 1 mililitrelik bir uç kullanarak beş kez hafifçe pipetleyerek hücreleri yeniden süspanse edin. Sekiz dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra 1 mililitrelik bir uç kullanarak ortamı aspire edin ve 1 mililitre bazal ortam ekleyin.

Hücreleri saydıktan sonra, hücreleri bir SVZ'den 10 mililitre NSC ortamı içeren 10 santimetrelik bir tabağa yerleştirin ve 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile kültürleyin. Beş ila yedi gün sonra nöroküreler gözlemlenebilir. Bağlı nörosferlerdeki hücreleri immün boyama ile analiz etmek için, birden fazla nöroküre içeren 1 mililitre ortamı 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve sekiz dakika boyunca 500 kez G'de döndürün.

Ortamı çıkardıktan sonra, küreleri 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Paraformaldehiti çıkardıktan sonra, küreleri gece boyunca% 30 sükroz ile inkübe edin. Ve sonra tekrar santrifüjleyin.

PBS ile yıkayın. Ardından, daha önce olduğu gibi santrifüjledikten sonra, süpernatanı çıkarın ve atın. Ardından, 1 mililitre uçlu bir pipet takın ve 500 mikrolitre OCT solüsyonunu nörosferlerin üzerine pipetleyin.

Nörosferleri içeren OCT çözeltisini tek kullanımlık bir plastik dondurma kalıbına aktarın. Ardından kalıbı kuru buz üzerinde en az 15 dakika dondurun. Kriyostat ile bölümleri kesin.

Nörosferdeki kök hücreleri görselleştirmek için, kök hücre markörü Nestin'e karşı immün boyama yapın. Bir nörosferdeki primer kirpikleri görselleştirmek için, ARL13B'ye karşı immün boyama yapın. Bu deneye, yapışık ayrışmış nöral kök hücrelerin Poli-L-Lizin ve Laminin kaplı örtü astarları üzerine ekilmesinden bir ila iki gün sonra başlayın.

Deney kuyularındaki ortamı açlık ortamına ve kontrol kuyularındaki taze NSC ortamına değiştirin. 24 saat daha kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS'de% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.

Fiksasyondan sonra, oda sıcaklığında her biri beş dakika boyunca PBS ile iki kez yıkayın. Ve sonra standart protokolleri kullanarak immünofillonezan gerçekleştirin. Kapak kızaklarını montaj solüsyonu ile monte edin.

Ardından, sürgülü camı gece boyunca karanlıkta oda sıcaklığında kurutun. Ertesi gün, gerekli büyütme oranında bileşik mikroskopta görüntüler elde edin. Mikroskop kamerası ve objektifleri, beraberindeki yazılım kullanılarak kontrol edilmelidir.

0.5 ila 0.8 mikron aralıklarla yeterli z kesiti alın. Yapışık hücrelerde siliyer lokalizasyonun kantitatif analizi için, DAPI kanalını görüntüleyerek birleşik hücrelere sahip üç ila sekiz ardışık alan seçin. Her alandan görüntü yığınları alın.

ImageJ kullanarak birincil kirpiklerin sayısını ölçün. Eklenti Analizi iletişim kutusunu açın ve GPCR pozitif kirpikli hücreleri saymak için Hücre Sayacı aracını seçin. Sayma ve dışa aktarma amacıyla aynı deneydeki tüm görüntüler için benzer görüntü yoğunluğu ve kontrast parametrelerini kullanın.

Kültürlemeden 24 saat sonra, NSC besiyerinde veya açlık besiyerinde ayrışmış hücreler, yeşil ile gösterilen GPR161'e, kırmızı görünen ARL13B'ye ve mavi olarak gösterilen DNA'ya karşı sabitlendi ve immün boyandı. GPR161 pozitif kirpikler soldaki kontrol hücrelerinde ve sağdaki aç hücrelerde görülür. Bu büyütülmüş görünümlerde görüldüğü gibi.

Beyaz oklar ve ok uçları sırasıyla GPR161 pozitif ve negatif kirpikleri gösterir. Bu görüntü, ARL13B pozitif kirpikli hücrelerin miktar tayinini göstermektedir. Niceleme, her biri tek bir deneyin iki teknik kopyasından olmak üzere iki görüş alanından gerçekleştirilir.

ARL13B pozitif kirpikli hücrelerin yüzdesi açlık üzerine artar. Bu görüntü, kontrol ve aç hücrelerde ARL13B pozitif kirpiklerde lokalize olan GPR161'in nicelleştirilmesini göstermektedir. ARL13B pozitif kirpiklerde lokalize olan GPR161 yüzdesi de açlıktan öldüğünde artar.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa iki saatten daha kısa sürede yapılabilir. Bu prosedürü takiben, kirpiklerin tümör oluşumundaki rolü gibi ek soruları yanıtlamak için primer tümör kaynaklı hücrelerin kültürlenmesi için başka bir yöntem gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, birincil kirpikler alanındaki araştırmacıların, birincil nörosfer tabanlı sistemlerde siliyer biyogenezi ve kaçakçılığını keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, nöral kök hücrelerde, nöral progenitörlerde ve nörosfer tabanlı kültürlerden türetilen nöronlarda primer kirpiklerin nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.