3D Baskılı Kılavuzları ve Halka İstifleme Yöntemiyle Engineered Vasküler Greft ölçeklendirme

Bu yöntemin genel amacı, her boyutta sağlam ve tutarlı bir şekilde tasarlanmış kan damarları üretmektir. Bu teknik, kan damarlarının güvenilir ve etkili bir şekilde tasarlanmasını sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, her boyuttaki gemilerin kolay ve güvenilir bir şekilde üretilebilmesidir.

Bu yöntem için ilk olarak, bir doku tüpünün nasıl tasarlanacağını tartışırken aklımıza geldi ve yöntemimizi, her seferinde bir segment olmak üzere karayolu tünelleri inşa etmeye benzettik. 3D baskılı ekleri hazırlamak için önce sırasıyla 35, 60 veya 100 milimetrelik bir Petri kabının tabanlarına iki, dört veya altı mL kürlenmemiş silikondan oluşan ince bir tabaka ekleyin. 35 mm'lik plakalar için direkler oluşturmak için, PDMS'yi yedi mm yüksekliğe kadar 100 mm'lik farklı bir plakaya dökün ve PDMS'yi iki ila üç saat boyunca 60 santigrat derecede bir ocak gözü üzerinde ısıtın.

PDMS sertleştiğinde, silindirik direkler oluşturmak için beş mm'lik bir biyopsi zımbası kullanın. Silindirleri her 35 mm'lik plakanın merkezine sabitlemek için az miktarda kürlenmemiş PDMS kullanın. 3 mm'lik plakalara direkten eşit uzaklıkta yaklaşık 66.7 mm çapında 100D baskılı bir dış kabuk yerleştirin.

60 ve 100 mm'lik plakaların altındaki PDMS sertleşmeden önce, sırasıyla 60 ve 100 mm'lik plakaların her birine merkezi olarak 10 ve 20 mm çapında 3D baskılı direkler yerleştirin. Bulaşıkların 60 santigrat derece ocak gözü üzerinde açık havada iki ila üç saat kürlenmesine izin verin, ardından on sekiz saat polimer gazdan arındırın. Gaz alma işleminin sonunda, tüm plakaların iç kısımlarını %70 etanol ile sterilize edin ve her plakayı 30 dakika boyunca örtün.

Ardından, havayla kurumaya izin vermek için etanolü her plakadan dikkatlice aspire edin. Plakalar kuruduğunda, karşılık gelen yüzü yukarı bakacak kapakların yanındaki biyolojik güvenlik kabinine aktarın. ve sterilizasyonu tamamlamak için malzemeleri 30 dakika UV ışığına maruz bırakın.

Fibrin Hidrojeli hazırlamak için önce Fibrin jel ve TGF Beta 1 ila 35, 60 ve 100 mm kültür kapları ile desteklenmiş 0.5, 1.1 ve 1.81 mL büyüme ortamı ekleyin. Daha sonra, sırasıyla 35, 60 ve 100 mm'lik plakalara 40, 88.4 ve 145 mikrolitre Trombin ekleyin ve her plakayı elle hafifçe döndürün. Trombin eşit olarak dağıldığında, sırasıyla 35, 60 ve 100 mm'lik plakalardaki Trombin ortam karışımına damla şeklinde dairesel hareketlerle 160, 354 ve 580 mikrolitre Fibrinojen ekleyin ve Hidrojeli eşit olarak dağıtmak için plakaları hafifçe döndürün.

Hidrojelin oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika kürlenmesine izin verin. Daha sonra ilgilenilen düz kas hücrelerini tripsinize edin, 150 mm'lik hücre kültürü plakalarında genişletin ve ayrılan hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Peletleri üç ml farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin ve herhangi bir hücre kümesini parçalamak için hücreleri kuvvetli bir şekilde ezmek için iki mL'lik bir pipet kullanın.

Saydıktan sonra, hücreleri 50 ml'lik konik tüplerde mL alikotlarda 2/10 10 ila 6., 1/10 10 ila 7. ve 1.4 x 10 ila 7. hücrelere bölün ve karşılık gelen kültür plakalarına göre etiketlenin. Her 35, 60 ve 100 mm'lik plaka için sırasıyla iki, dört ve beş mL'lik nihai tohumlama hacimleri elde etmek için her tüpe farklılaşma ortamı ekleyin Ardından, hücre kültürü inkübatöründe genişleme için hücre çözeltilerini, karşılık gelen her bir plakada hazırlanan Hidrojel üzerine damla damla dikkatlice ekleyin. İki ila dört gün sonra halkalar direklerine doğru tamamen büzülmüş olacaktır.

Bu nedenle, her 35, 60 ve 100 mm'lik halkaya sırasıyla 10, 20 veya 35 mL TGF Beta 1 ekleyin. 35 mm'lik damar için vasküler yapıyı monte etmek için, 50 mL'lik bir polikarbonat konik borunun üstünden iki inçlik bir bölüm kesin ve PDMS, halka istifleme için uzun bir plaka oluşturmak üzere üst kenarı 35 mm'lik bir plakaya yapıştırın. 60 ve 100 mm'lik kap için uzun halka istifleme plakaları, 1,75 inç çapında bir polikarbonat boruyu, uzun plaka duvarları olarak hizmet etmek için uzunlamasına 2,5 inç bölümler halinde kesin.

Uzun plaka tabanları için, 0.125 inç kalınlığında bir polikarbonat levhayı iki inç çapında daire parçaları halinde kesin. Akrilik çözücü çimento kullanarak, polikarbonat tüp bölümlerini dairesel kesilmiş parçalara bağlayın. 50 mm uzunluğunda beş, on ve 20 mm çapında direkleri 3D yazdırın.

Daha sonra her bir kaba 10 mL kürlenmemiş silikon ekleyin ve PDMS tamamen kürlenmeden önce her 3D baskılı direği her 35, 60 ve 100 mm'lik kaba merkezi olarak yerleştirin. Ve bulaşıkları iki ila üç saat boyunca 60 derecelik bir ocak gözüne koyun. PDMS sertleştirildiğinde, plakaları az önce gösterildiği gibi% 70 etanol ile sterilize edin, ardından kurutulmuş etanol sterilize edilmiş kapları 30 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın.

Şimdi, sıkıca sarılmış düz kas Hidrojel halkasının önce bir tarafını, sonra diğer tarafını direğinden dikkatlice kaldırmak için iki çift çok ince forseps kullanın. Ardından, halkanın bir tarafını ve ardından diğer tarafını, karşılık gelen sonraki boyuttaki daha büyük kabın uzun direğine dikkatlice kaydırın. Dairesel olarak, hafif kademeli hareketlerle çalışarak, halkayı yavaşça direkten aşağı itin, ardından istenen damar uzunluğu elde edilene kadar ek doku halkalarını istifleyin.

Tüm halkalar istiflendiğinde, direkler çalışma yüzeyine paralel olacak şekilde plakaları çevirin ve plakaları yavaşça döndürürken her 35, 60 ve 100 mm'lik kabın dış yüzeyine sırasıyla 40, 80 ve 160 mikrolitre Trombin ekleyin. Ardından, her 35, 60 ve 100 mm'lik yapıya sırasıyla 40, 80 ve 160 mikrolitre Fibrinojen ekleyin, yapıyı hızlı bir şekilde döndürürken mümkün olduğunca hızlı ve eşit bir şekilde ekleyin. Trombin ve Fibrinojen karıştırıldıktan sonra hızla sert bir jel haline gelecektir.

Daha sonra her bir yapı kabına 20 mL farklılaşma ortamı ekleyin ve kapları ihtiyaç duyulana kadar 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Histolojik analiz, küçük halkaların dış kenarlarında gözlenen az miktarda kalıntı Fibrin jeli ile tüm halkalı boyutlarda yüksek bir hücresellik ortaya koymaktadır. Daha büyük halkalarda, bazı Fibrin jeli, hem orta hem de büyük halkalarda belirgin olan kollajen üretimi belirtileri ile hücresel içerikle serpiştirilir.

Alfa düz kas Aktin ve Tropomyosin ekspresyonu için doku halkası analizi, tüm halka boyutlarının her iki antikor için pozitif olduğunu ve düz kas fenotipinin korunduğunu doğruladığını ortaya koymaktadır. Çekme testi, her üç halka boyutunda da artan bir halka ve kap boyutu ile ilişkili olarak tutarlı bir artan mukavemet eğilimini gösterir. Çeşitli halka boyutlarını oluşturmak için hücre tohumlama sayıları da tohumlama yüzey alanı ile ilişkilidir.

Bu damar yapıları ayrıca dakikada 100 ila 417 ml arasındaki akış hızlarında beş dakikaya kadar akışa dayanabilir ve damarların bolluk sistemine bağlandığı yerde sadece küçük bir sızıntı gözlenir. Bir kez ustalaştıktan sonra, teknik uygun şekilde gerçekleştirilirse halkalar bir saat içinde tasarlanabilir. Bu prosedürü denerken, jelin sertleşmesini ve uygun halka oluşumunu sağlamak için Hidrojel bileşenlerini iyice karıştırmayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, diğer hücre tiplerinin halkalarını oluşturmak gibi, diğer doku tiplerinin mühendisliği için başka yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, çeşitli boyutlardaki vasküler dokuları tasarlamak için halka istifleme yönteminin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.